Un essai ex vivo pour étudier Candida albicans Hyphal Morphogenesis dans le tractus gastro-intestinal

Candida albicans est un pathogène fongique opportuniste et polymorphe qui est normalement proportionnel, mais qui peut subir un changement morphologique en une forme virulente capable de causer des infections potentiellement mortelles chez les personnes immunocompromisées^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13}. C. albicans est l’une des principales causes d’infections nosocomiales systémiques, avec un taux de mortalité de 40\u201260%, même avec un traitement antifongique^2,14,15. Bien que C. albicans réside dans différents créneaux d’accueil, y compris le système^{reproducteur féminin 16,17}, la cavité buccale des personnes en bonne santé¹⁸ et le tractus gastro-intestinal (GI)^19,20, la majorité des infections systémiques proviennent du tractus gastro-intestinal et en outre, la source de l’infection systémique est souvent confirmée pour être le^{tractus gastro-intestinal 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34}. La pathogénie de C. albicans dans le tractus gastro-intestinal est influencée par un large éventail de facteurs; cependant, une caractéristique majeure nécessaire à la virulence est la transition d’une morphologie des cellules de levure en une morphologie virulente des cellules hyphaliques^{35,36,37,38,39,40,41,42,43,44}. C. albicans attachement et la diffusion du tractus gastro-intestinal pendant l’infection est fortement associée à sa capacité à passer d’une levure proportionnelle à hyphe virulente, permettant aux champignons de causer des maladies invasives^{44,45,46,47,48,49,50,51,52,53}.

Une variété de facteurs dans l’intestin, y compris n-acétylglucosamine, réguler la formation d’hyphal par C. albicans. Par conséquent, il est crucial de réduire l’écart dans la connaissance concernant la morphogenèse hyphale de cet agent pathogène fongique dans le^{tractus gastro-intestinal 54,55,56}. Des preuves récentes indiquent que divers métabolites intestinaux contrôlent différemment la morphogenèse hyphale de C. albicans in vitro^57,58,59,60. Cependant, les contraintes techniques présentent des problèmes lorsqu’on tente d’étudier la formation d’hyphes de C. albicans dans des échantillons intestinaux in vivo, en particulier la coloration des cellules de levure et d’hyphes et l’analyse quantitative du développement hyphal. Pour comprendre la morphogenèse hyphale de C. albicans dans le tractus gastro-intestinal, une méthode ex vivo a été développée à l’aide d’extraits solubles de contenu intestinal homogénéisé de souris pour étudier l’effet des métabolites sur la morphogenèse hyphale fongique. Utilisant des échantillons d’intestin de souris résistantes et sensibles à l’infection par l’IG de C. albicans, cette méthode aidera à identifier et à étudier l’effet des métabolites, des antibiotiques et des xénobiotiques sur la morphogenèse hyphale fongique dans le tractus gastro-intestinal.

Tous les protocoles animaux ont été approuvés par le Midwestern University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) tel que décrit^{avant 57}. Le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université du Midwest a approuvé cette étude en vertu du Protocole IACUC de l’UTW #2894. Les politiques de soins aux animaux de l’UTW suivent la Politique du Service de santé publique (SSP) sur les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire et les politiques énoncées dans la Loi sur le bien-être des animaux (AWA).

1. Les souris étudient le protocole standard

1. Utilisez des souris C57BL/6J mâles et femelles âgées d’au moins six semaines. Complétez-les avec de l’eau stérile avec ou sans cefoperazone (0,5 mg/mL).
   1. Co-maison souris en groupes de 5, avec chaque cage contenant soit tous les mâles ou toutes les souris femelles. Fournissez aux souris du chow de souris standard et de l’eau (via une bouteille de 400 mL) en tout temps.
   2. Vérifiez les cages quotidiennement pour vous assurer que les niveaux de nourriture et d’eau sont suffisants et pour examiner les souris à la recherche de signes de détresse.
2. Remplacez l’eau par de la cefoperazone toutes les 48 h pour vous assurer que des antibiotiques frais sont fournis, peu importe le reste de l’eau dans les biberons de la cage.
3. Après 5\u20127 jours de traitement de cefoperazone, euthanasiez des souris par asphyxie de CO₂ observant le protocole établi d’IACUC. Confirmer la mort par dislocation cervicale.
4. Disséquer les souris à l’aide de ciseaux pointus autoclave-stérilisés et de forceps autoclave-stérilisés.
   1. Après l’euthanasie, fixez l’animal à une surface de dissection en épinglant tous les membres de sorte que l’abdomen soit exposé.
   2. Vaporiser la région abdominale avec 70% d’éthanol pour empêcher la fourrure de coller aux forceps, ciseaux, ou des sections intestinales pendant la dissection.
   3. Utilisez des forceps pour pincer et soulever une section de peau à la base de l’abdomen et créer une petite incision à travers la peau et fascia sous-jacente à l’aide de ciseaux. Prenez grand soin lors de la fabrication de cette incision pour éviter de percer le cecum ou la paroi intestinale.
   4. Étendre cette coupe à la cage thoracique, exposant partiellement la cavité péritonéale. Faire une coupe à partir du point de l’incision initiale de chaque côté s’étendant vers le haut et latéralement.
   5. Tirez ces volets latéralement et épinglez à la surface disséquante pour exposer complètement la cavité péritonéale.
5. Extraire le tractus gastro-intestinal à l’aide de forceps, tout en utilisant des ciseaux pour rendre les coupures supérieures à l’estomac et à la région distale du gros intestin pour assurer la collecte de la plus grande quantité de contenu intestinal de chaque section.
6. Lors de la suppression du tractus gastro-intestinal, prenez soin d’éviter de rompre les composants individuels. Séparez l’estomac, l’intestin grêle, le cecum et le gros intestin individuellement à l’aide de ciseaux à leurs extrémités proximales et distales.
7. Pour la collecte de chaque contenu intestinal de chaque section, faire une incision unique à l’extrémité distale de chaque section à l’aide de ciseaux, suivie par l’expulsion manuelle de la teneur en intestin dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL à l’aide de forceps.
8. Conserver le contenu de l’intestin à -80 °C pour les analyses ex vivo.

2. Préparation des plaques d’agar extrait-peptone-dextrose (YPD) de levure

1. À une bouteille en verre de 1 L ajouter 25 g d’extrait de levure peptone-dextrose poudre de bouillon, 10 g d’agar, et l’eau ultrapure à un volume final de 500 mL.
2. Autoclave à 121 °C pendant 30 min sur un cycle liquide pour stériliser le média.
3. Sous une hotte d’écoulement laminaire, verser environ 20 mL de supports d’agar dans une plaque de Petri stérile. 500 mL de supports d’agar devraient produire environ 25 plaques.
4. Conserver les assiettes à 4 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’emploi.

3. Préparation ex vivo pour l’essai hyphal de morphogenèse

1. Stries d’une culture fraîche de C. albicans SC5314 sur une plaque d’agar YPD et incuber toute la nuit à 30 °C.
2. Choisissez deux à trois colonies individuelles de taille moyenne provenant de la culture C. albicans SC5314 cultivées pendant la nuit et suspendez-les en 1 mL de salin tamponné de phosphate (PBS).
3. Récupérer le contenu des intestins congelés dans le congélateur de -80 °C et décongeler à 25 °C.
4. Pesez environ 150 mg de contenu intestinal dans un nouveau tube de 1,5 mL.
5. Suspendre à nouveau le contenu intestinal avec 150 μL de PBS (teneur en intestin et PBS à un rapport poids/volume de 1:1).
6. Vortex à grande vitesse pendant 30 s pour homogénéiser le contenu de l’intestin et permettre de s’asseoir à température ambiante pendant environ une minute.
7. Centrifugeuse l’homogénéise à 1000 x g pendant 3 min.
8. Transférer le supernatant dans un nouveau tube de 1,5 mL.
9. Répétez les étapes 3.7 et 3.8 pour enlever tous les débris dans le surnatant.
10. Ajouter 10 μL de l’inoculum C. albicans SC5314 préparé ci-dessus à ce supernatant
11. Bien mélanger et incuber à 37 °C pendant 4 à 5 h.

4. Ajout exogène de métabolites aux extraits homogénéisés d’intestin pour l’essai hyphal de morphogenèse

1. Récupérer le contenu des intestins congelés du congélateur de -80 °C et les suspendre de nouveau en PBS à un rapport de 1:1 (poids : volume).
2. Ajouter la concentration désirée de métabolites intestinaux au contenu intestinal et au mélange PBS.
3. Vortex à grande vitesse pendant 30 s pour homogénéiser le contenu intestinal contenant des métabolites et permettre de s’asseoir à température ambiante pendant environ 10 min.
4. Centrifugeuse l’homogénéise à 1000 x g pendant 3 min.
5. Transférer le supernatant dans un nouveau tube de 1,5 mL. Répétez les étapes 4.4 et 4.5 pour enlever tous les débris dans le supernatant.
6. Ajouter 10 μL de l’inoculum C. albicans SC5314 préparé ci-dessus à ce supernatant. Bien mélanger et incuber à 37 °C pendant 4 à 5 h.

5. Essai de morphogenèse de C. albicans (immunostaining et imagerie)

1. Centrifuger les échantillons à 1000 x g pendant 2 min et jeter le supernatant par pipetting.
2. Fixer les échantillons dans 100 μL de 2% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 15 min.
3. Centrifugeuse à 1000 x g pendant 2 min et jeter le supernatant par pipetting.
4. Lavez les échantillons deux fois avec 1 mL de PBS. Pour laver les échantillons, suspendez la pastille dans PBS en pipetting doucement. Ne pas vortex de l’échantillon car cela peut endommager les structures hyphal. Après la re-suspension, centrifugeuse à 1000 x g pendant 2 min et jeter le supernatant par pipetting.
5. Incuber les échantillons à température ambiante dans 100 μL de PBS contenant de l’anticorps polyclonal C. albicans (1:100 dilution) pendant 30 min.
6. Lavez les échantillons trois fois avec 1 mL de PBS.
   REMARQUE : Lors de l’utilisation d’un anticorps fluorescent, il est recommandé que toutes les étapes de dilution et de lavage soient effectuées en faible lumière afin d’éviter le blanchiment des photos et d’améliorer la longévité de l’échantillon.
7. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 15 min dans 100 μL de PBS contenant anti-Lapin IgG Alexafluor 488 anticorps à 1:500 dilution. Effectuez l’incubation dans un tiroir ou une pièce sombre pour éviter le blanchiment des photos.
8. Lavez les échantillons trois fois avec 1 mL de PBS.
9. Suspendre à nouveau les échantillons dans 100 μL de PBS et les transférer dans une plaque de 96 puits pour l’imagerie.
   REMARQUE : Lorsqu’elle n’est pas photographiée, il est recommandé d’envelopper la plaque de 96 puits dans du papier d’aluminium pour éviter le blanchiment des photos.
10. Cellules fongiques d’image utilisant des lentilles objectives 20x et 40x utilisant un microscope d’imagerie de fluorescence. Utilisez un filtre à protéines fluorescentes vertes (longueur d’onde excitation 470/40 et longueur d’onde d’émission 525/50) pour détecter la fluorescence.

Ces résultats ainsi que les résultats antérieurs du laboratoire Thangamani60 indiquent que lorsque C. albicans est cultivé ex vivo dans des extraits d’homogénéisation intestinale prélevés dans l’estomac, les intestins grêles et les gros intestins de souris témoins non traitées et traitées aux antibiotiques, C. albicans se développe généralement avec une morphologie de levure (figure 1B). Cependant, lorsqu’il est cultivé dans l’extrait cécal à partir de souris traitées aux antibiotiques, C. albicans subit facilement la morphogenèse, ce qui entraîne des échantillons contenant des formes de levure et d’hyphes (Figure 1B); cela ne se produit pas chez les souris témoins. Ceci soutient des résultats précédents, qui ont montré une augmentation significative des formes d’hyphe dans les échantillons cultivés dans les extraits cecal antibiotiques-traités, mais pas dans n’importe quels autres extraits antibiotique-traitésd’intestin 60. Ces résultats suggèrent que le traitement antibiotique provoque des changements dans l’environnement cécal, qui induisent la morphogenèse hyphale de C. albicans. En outre, la localisation spécifique de ce phénotype remarqué seulement dans le cecum suggère également que ces conditions hyphae-promotion peuvent ne pas nécessairement présenter dans tout le tractus gastro-intestinal, mais sont plutôt limitées à des segments spécifiques du tractus gastro-intestinal en fonction de la disponibilité des nutriments, métabolites et autres molécules inconnues.

Puisque l’extrait cécal des souris antibiotiques-traitées favorise la morphogenèse de C. albicans57,58,59,60,nous avons examiné si l’addition exogène d’un groupe choisi de métabolites d’intestin (identifiés des études in vitro précédentes) à la teneur cecal des souris cef-traitées affectera la morphogenèse de C. albicans ex vivo. Des travaux antérieurs effectués par le laboratoire Thangamani ont caractérisé le profil métabolomique de l’homogénéité à teneur cécale extraite de souris non traitées et traitées aux antibiotiques, révélant des changements significatifs dans l’abondance de divers métabolites à la suite d’un traitement antibiotique, en particulier une diminution de l’abondance des acides biliaires secondaires et une abondanceaccrue de glucides 60. En outre, cette étude a identifié que les acides biliaires secondaires et les acides carboxyliques inhibent le développement d’hyphe, tandis que les hydrates de carbone comprenant le glucose, favorisent la morphogenèse hyphal de C. albicans in vitro60. Les résultats indiquent que l’ajout d’un pool de métabolites inhibiteurs de l’intestin contenant de l’acide désoxycholique (DCA, 0,5 mg/mL), de l’acide lithocholic (LCA, 0,1 mg/mL), acide palmitique (0,1 mg/mL), acide p-tolylacetic (0,1 mg/mL), acide sébacique (0,5 mg/mL), 2 l’acide méthylbutyrique (0,5 mg/mL) et l’acide lactique (5 mg/mL) à l’homogénéité cécale des souris traitées au cef ont complètement inhibé la morphogenèse hyphale ex vivo. D’autre part, l’addition exogène du glucose (1 mg/mL) à l’homogénéate cecal des souris cef-traitées a montré un ex vivo massif de développement hyphal (figure 2B). Collectivement, ces résultats indiquent que l’addition des métabolites d’intestin de nouveau à l’homogénéate cecal des souris cef-traitées régule différentiellement la morphogenèse de C. albicans, confirmant ainsi des résultats in vitro précédents. Ces résultats indiquent que les métabolites intestinaux jouent un rôle essentiel dans la morphogenèse hyphale de C. albicans et la compréhension des cibles génétiques et des voies de signalisation modulées par ces métabolites aidera au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour prévenir et traiter les infections à C. albicans.

Figure 1 : Analyse ex vivo pour déterminer l’effet du traitement de cefoperazone sur la morphogenèse hyphale de C. albicans dans le contenu intestinal. (A) Schéma de protocole. (B) Le contenu intestinal traité aux antibiotiques (panneaux supérieurs) et non traité (panneaux du bas) a été prélevé sur l’estomac, les intestins grêles, les ccums et les gros intestins des souris C57BL/6J. Le contenu intestinal inoculé avec C. albicans SC5314 a été incubé à 37 °C pendant 4\u20125 h et taché d’anticorps C. albicans. Les cellules ont été imaged au grossissement de 40x. Des images représentatives sont affichées ici. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Ajout exogène de métabolites intestinaux au contenu cécal des souris traitées au cef sur la formation hyphe de C. albicans ex vivo. (A) Schéma de protocole. (B) Piscine inhibitrice de métabolites intestinaux contenant du DCA (0,5 mg/mL), du LCA (0,1 mg/mL), de l’acide palmitique (0,1 mg/mL), de l’acide p-tolylacétique (0,1 mg/mL), de l’acide sébacique (0,5 mg/mL); L’acide 2-méthylbutyrique (0.5 mg/mL), et l’acide lactique (5 mg/mL) ou le glucose (1 mg/mL) ont été ajoutés de nouveau à la teneur en cecal des souris cef-traitées, mélangées complètement et incubées à 37 °C pendant 15 min pour effectuer l’essai ex vivo hyphae. Le contenu cécal inoculé avec C. albicans SC5314 a été incubé à 37 °C pendant 4\u20125 h et taché d’anticorps C. albicans. Les cellules ont été imaged au grossissement de 40x. Des images représentatives sont affichées ici. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents ou d’autres conflits d’intérêts.