Surveillance simultanée de l’électrophysiologie sans fil et du test comportemental de la mémoire comme outil pour étudier la neurogenèse de l’hippocampe

Le test comportemental est crucial dans la recherche en neurosciences pour une grande quantité d’informations générées dans un contexte in vivo. À cet égard, les chercheurs ont largement utilisé différents tests comportementaux pour analyser la fonction sensori-motrice, les interactions sociales, les comportements anxieux et dépressifs, la dépendance aux substances et diverses formes de fonctions cognitives¹. L’enregistrement manuel des tests comportementaux peut être difficile, épuisant et inexact, même pour la plupart des observateurs experts. Même si certains efforts ont été faits pour développer un logiciel gratuit et open-source pour l’enregistrement du comportement (par exemple, l’application sexrat male² pour le comportement sexuel), plusieurs alternatives permettent l’enregistrement automatique et en temps réel du comportement de différentes espèces animales du poisson³ aux rongeurs 4,5,6. Le suivi vidéo est une méthode précieuse pour un enregistrement rapide et précis du comportement utilisée dans une grande variété d’applications⁷. Une caractéristique plus potentielle dans la zone d’enregistrement comportemental est d’explorer l’activité neuronale pendant la manifestation comportementale. L’enregistrement simultané de l’activité neuronale (des cellules individuelles aux principales zones du cerveau) et des tâches comportementales pourrait nous montrer comment le cerveau génère des modèles comportementaux spécifiques⁸. Les comportements sont une séquence de composants mineurs qui pourraient révéler des corrélats entre l’activité neuronale et les mouvements ou actions. Si l’activité neuronale et les modèles comportementaux pouvaient être enregistrés simultanément sur plusieurs échelles de temps, ils pourraient expliquer comment chaque état cérébral est corrélé à chaque comportement particulier (pour un examen plus approfondi de l’enregistrement comportemental, voir Datta et al., 2019 revue⁸). Par conséquent, l’enregistrement synchronisé de l’activité comportementale et neuronale à l’échelle souhaitée (des neurones à de grandes zones du cerveau) est considéré comme un outil extrêmement utile. Il existe plusieurs systèmes destinés à intégrer des enregistrements comportementaux à d’autres mesures comme l’activité neuronale ^4,5.

Bien que l’électroencéphalographie soit considérée comme l’une des techniques les plus utilisées dans le domaine des neurosciences cliniques et de recherche, la mobilité relativement élevée, ainsi que la taille du dispositif d’enregistrement EEG, rendent cette technique unique et difficile à détecter dans le cas de modèles in vivo⁹. Certaines solutions à ce problème ont été développées, par exemple, l’utilisation de câbles et de dispositifs pivotants qui permettent aux animaux de se déplacer librement dans l’arène. Néanmoins, les systèmes à câbles posent souvent des problèmes pour mener des études, par exemple, lors du transfert d’un animal d’une cage à une autre, on observe une gêne ou un enchevêtrement de l’animal avec les câbles. Des dispositifs télémétriques ont été mis au point pour les enregistrements électrophysiologiques sans fil afin d’accroître la flexibilité de la situation d’enregistrement^10,11. Toutefois, ces systèmes ont montré des limites considérables en raison de leur faible nombre de canaux d’enregistrement et de leurs faibles taux d’échantillonnage¹¹. Dans cette étude, nous avons utilisé un système sans fil disponible dans le commerce qui envoie des signaux EEG de l’animal via une connexion Wi-Fi avec un système de rongeurs en mouvement libre¹². L’appareil pèse 6 grammes et supporte jusqu’à 16 canaux enregistrés à 1 kSps. Ce système permet l’enregistrement EEG ou de pointes dans l’environnement animal, avec une perturbation réduite, servant de solution économique par rapport aux systèmes électrophysiologiques traditionnels sur le marché. De plus, nous avons synchronisé ces données à l’aide d’un logiciel de suivi vidéo pour fournir une corrélation entre l’EEG et les modèles comportementaux. Cette synchronisation s’effectue hors ligne par alignement et interpolation des données et des événements en fonction des horodatages générés par les deux systèmes et est traitée sur MATLAB.

La neurogenèse adulte est définie comme la prolifération, la survie et la différenciation dans les neurones des cellules nouvellement générées dans le gyrus denté des animaux^13,14. Ce processus est connu pour être associé à l’amélioration de la mémoire et de l’apprentissage qui augmente la neurogenèse adulte chez les rongeurs par le biais de conditions d’environnement enrichi (EE)¹⁵. L’EE consiste à loger les rongeurs en petits groupes à l’intérieur d’une grande cage munie de jouets et de tubes, où les animaux ont une pertinence nouvelle et complexe mais sans pertinence biologique¹⁵. Bien que l’EE stimule la neurogenèse de l’hippocampe, elle varie également dans de nombreux facteurs tels que l’âge, la souche animale, les conditions de stimulation spécifiques ou la procédure de détection de la neurogenèse. Chez des souris d’âge moyen exposées à un logement EE pendant sept jours, la naissance de nouvelles cellules granulaires (GC) dans le gyrus denté de l’hippocampe (DG) a été signalée¹⁶. Des études tentant d’ablater sélectivement la neurogenèse adulte chez des rats adultes ont suggéré que de nouvelles cellules granulaires d’environ 1 à 2 semaines sont nécessaires dans la réponse apprise¹⁷. Environ 2 ou 3 semaines après la naissance de la GC chez l’adulte DG, plusieurs caractéristiques telles que les épines dendritiques, essentielles à la transmission synaptique excitatrice¹⁸, commencent à apparaître. Zhao et al. ont effectué une analyse quantitative pour montrer que le pic de croissance de la colonne vertébrale se produit au cours des 3 à 4 premières semaines¹⁹. Plusieurs études électrophysiologiques in vivo suggèrent que seulement trois semaines de conditions de logement EE produisent des altérations dans la transmission synaptique du DG et augmentent l’excitabilité cellulaire²⁰. En outre, il a été rapporté que l’exposition à un environnement enrichi 1 à 4 semaines après les injections de BrdU augmentait significativement la densité des cellules BrdU/NeuN dans la couche granulaire DG chez la souris²¹. Ces auteurs suggèrent qu’une période critique existe entre une et trois semaines après l’exposition à l’EE puisqu’une augmentation substantielle du nombre de nouveaux neurones a été observée²¹. Les études sur la neurogenèse hippocampique adulte (AHN) chez l’homme ont été controversées car il n’y avait aucune preuve directe. Cependant, un rapport récent a décrit les stades de développement de l’AHN dans le cerveau humain adulte, identifiant des milliers de neurones immatures dans le DG, démontrant ainsi l’importance de l’AHN au cours du vieillissement chez l’homme²². Sur la base des preuves mentionnées précédemment, l’étude de l’AHN dans des modèles animaux est plus importante que jamais (pour un examen plus approfondi de l’AHN, voir Leal-Galicia et al., 2019 revue¹⁵).

Comme mentionné précédemment, l’hippocampe a été lié à une fonction fondamentale dans les capacités d’apprentissage et de mémoire. La formation des mémoires passe par trois processus distincts : l’encodage (acquisition de mémoire), la consolidation (stockage de la mémoire) et la récupération (reconnaissance de la mémoire)²³. La mémoire de reconnaissance chez l’homme est testée à l’aide de la tâche de comparaison visuelle par paires²⁴. Les principes fondamentaux des modèles humains et animaux de la mémoire et de l’amnésie sont les tests comportementaux qui évaluent la capacité de reconnaître un stimulus précédemment présenté^25,26, comme le fait la tâche de comparaison visuelle par paires chez l’homme. Par conséquent, l’un des tests comportementaux les plus utilisés pour évaluer la capacité d’un rongeur à reconnaître un stimulus précédemment présenté, c’est-à-dire la capacité d’apprentissage et de mémoire, est la tâche spontanée de reconnaissance de nouveaux objets (NORT)^23,27. Le protocole NORT consiste en deux nouveaux objets identiques dans une arène familière pendant 10 minutes dans l’essai d’acquisition. Après un temps précis compris entre 0 28 et⁴⁸ heures²⁹ (temps variable selon chaque protocole), l’animal est renvoyé dans la même arène contenant l’un des mêmes objets familiers, et un nouvel objet. L’animal explore spontanément l’objet nouveau si l’objet familier a été mémorisé²⁶. Le ratio de préférence est couramment utilisé pour évaluer le rendement de l’exploration. Il est déterminé en divisant le temps total d’exploration de l’objet du temps d’exploration du nouveau ou de l’objet familier. Le NORT présente certains avantages par rapport aux autres tests de mémoire de reconnaissance. Plus important encore, il ne nécessite aucune motivation externe, récompense ou punition. Il ne génère pas de conditions stressantes. Enfin, aucune formation n’est nécessaire pour évoquer le comportement d’exploration des objets (pour un examen plus approfondi de NORT, voir ^réf.23).

Par conséquent, l’enregistrement simultané de multiples modalités de données et leur intégration dans l’étude de l’apprentissage et de la mémoire, en tant qu’effet de la neurogenèse hippocampique adulte, sont très attrayants et constituent une solution convaincante pour les chercheurs dans le domaine. Le présent travail exposera tous les processus impliqués dans l’évaluation simultanée du suivi vidéo comportemental (nouvelle tâche de reconnaissance d’objets) et de l’enregistrement électroencéphalographie sans fil. Ici, nous avons examiné le processus de fabrication des électrodes, la chirurgie d’implantation des électrodes épidurales (vis crânienne), le protocole d’enrichissement environnemental (pour l’induction de la neurogenèse de l’hippocampe), le protocole NORT, la configuration BTS, le couplage EEG - BTS pour une surveillance simultanée en temps réel et l’analyse EEG et des données comportementales exécutées sur l’environnement informatique MATLAB.

Toutes les procédures suivent le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (NIH Publications N° 8023, révisé en 1978) mis en œuvre par les institutions nationales de santé et les lois locales mexicaines pour réduire le nombre d’animaux utilisés pour le bien-être animal et interdire la souffrance animale. Le comité d’éthique de l’Universidad Iberoamericana a approuvé les protocoles expérimentaux pour l’utilisation d’animaux dans cette étude.

1. Configuration générale

1. Installez le logiciel de suivi comportemental sur un ordinateur conformément aux instructions de fabrication.
2. Montez la caméra directement au-dessus de l’appareil, de sorte qu’elle soit orientée vers le bas. L’appareil photo doit être connecté à l’ordinateur.
3. Installez le logiciel du pilote requis par l’appareil photo (en suivant les instructions de fabrication).
4. Si l’appareil photo comprend un zoom, réglez-les pour qu’ils s’adaptent parfaitement à l’écran de l’appareil photo.
5. Désactivez le mode autofocus (AF) de l’appareil photo après le logiciel de fabrication.
6. Assurez-vous que la caméra fonctionne correctement en temps réel et testez le mode de capture vidéo jusqu’à ce qu’il soit prêt à être utilisé.

2. Protocole d’enrichissement de l’environnement (voir la figure 1)

NOTE: Des rats Wistar mâles âgés de trois mois ont été utilisés pour cette expérience et ont été maintenus dans des conditions naturelles de lumière sombre.

1. Placez la litière de sciure de bois dans une arène carrée en acrylique transparent (500 x 500 x 500 mm).
2. Placez trois types de jouets différents sur l’aréna avec lesquels les rongeurs peuvent interagir (p. ex., roues d’activité, double pont, escaliers, etc.).
3. Ajouter quatre tubes en PVC opaque gris incurvé de 2 pouces et quatre tubes.
4. Fournir aux distributeurs de nourriture et d’eau un accès ad libitum aux animaux.
5. Placez trois rongeurs par cage à l’intérieur de la salle du vivarium dans des conditions régulières.
6. Laissez les animaux dans cette arène pendant le temps requis selon le protocole correspondant. Dans cette expérience, les animaux devraient rester à l’intérieur de l’arène pendant 20 jours.
   REMARQUE: Après la chirurgie d’implantation d’électrodes, les animaux ne retournent pas au traitement d’enrichissement environnemental. Au lieu de cela, ils ont été placés dans des cages individuelles jusqu’à ce que le test de reconnaissance du nouvel objet soit terminé.

3. Processus de fabrication des électrodes

1. Coupez un morceau de fil de cuivre à environ 2 cm et utilisez un papier de verre pour frotter à environ 0,5 cm de chaque extrémité.
2. Roulez une extrémité du fil de cuivre sur la tête d’une vis de petite taille (électrodes) et assurez-vous qu’elle est fermement fixée, car il s’agit d’une étape cruciale. Un contact correct entre les deux matériaux doit être garanti pour éviter les artefacts dans les signaux EEG.
3. Insérez l’autre extrémité sur l’extrémité terminale du connecteur et assurez-vous qu’elle est correctement fixée en renforçant à l’aide de pinces fines. Cette pointe doit se connecter avec un câble amplificateur.
4. Mesurez la conductivité appropriée de la pointe à la vis à l’aide d’un multimètre. Ce processus garantit que la connexion de l’électrode est correctement installée.

4. Chirurgie d’implantation d’électrodes épidurales (vis crânienne)

NOTE: Après 20 jours de traitement d’enrichissement environnemental, les animaux subiront une intervention chirurgicale suivant la procédure décrite ci-dessous:

1. Injecter un cocktail de kétamine/xylazine (90/10 mg/kg, i.p.) à l’animal.
   REMARQUE: Pour éviter l’obstruction des voies respiratoires, attendez que le rat cesse de bouger, puis sortez-le de la cage de logement et placez l’animal sur une surface plane. Injecter un anti-inflammatoire non stéroïdien (méloxicam 1 mg/kg, s.c.) et un antibiotique (enrofloxacine 2,5 mg/kg, p.o.) comme analgésie préventive.
2. Une fois que le rat est entièrement anesthésié, rasez la région de la tête du rat.
   REMARQUE : Assurez-vous que l’animal est complètement anesthésié avant de poursuivre la chirurgie. Pincez soigneusement l’une des pattes ou la queue. Si l’animal réagit au stimulus, attendez quelques minutes de plus et pincez-le à nouveau. Si l’animal ne réagit pas au pincement, passez à l’étape suivante. Si l’équipement requis est disponible, l’utilisation d’une anesthésie gazeuse (comme l’isoflurane) est fortement recommandée, car elle est plus facilement titrée pour des raisons de sécurité.
3. Placez l’animal sur l’appareil stéréotaxique en fixant d’abord les deux oreilles avec les barres d’oreille (veillez à ne pas blesser l’oreille interne de l’animal). Enfin, placez les dents de devant sur la barre de morsure et fixez la barre nasale.
   REMARQUE: Fournir à l’animal un coussin chauffant pour toute la chirurgie, car l’anesthésie utilisée dans cette procédure provoque généralement une hypothermie et des problèmes respiratoires.
4. Nettoyez le dessus de la tête en utilisant trois cycles alternés de gommage à base de chlorhexidine ou d’iode, suivis d’un rinçage au sérum physiologique ou à l’alcool.
5. Administrer la lidocaïne par voie sous-cutanée (20 mg/mL) sous la peau de la tête (0,5 mL).
6. Instillez une goutte de solution ophtalmique ou de solution saline aux yeux de chaque animal toutes les 5 à 10 minutes pour les aider à ne pas se dessécher.
7. À l’aide d’un scalpel, faites une incision d’environ 2 cm de la direction antérieure à la direction postérieure pour exposer correctement la région supérieure du crâne.
8. Rétractez la peau à l’aide de pinces bulldog et grattez le tissu recouvrant le crâne.
9. Identifier et enregistrer les coordonnées bregma obtenues.
10. À partir de Bregma, à l’aide des Paxinos stéréotaxiques et du Watson Atlas³⁰, localisez et marquez la position de chacun des sept points (coordonnées) où les électrodes seront fixées.
    NOTE: Dans cette expérience, vis F3, F4 (+2,0 mm de Bregma, 2,25 mm latérales de la ligne médiane); Vis C3, C4 (-3,0 mm de Bregma, 2,75 mm latérales à partir de la ligne médiane); et des vis P3, P4 (-7,0 mm de Bregma, 2,75 mm latérales de la ligne médiane) ont été installées. Une septième vis était située à l’arrière de l’os nasal (NZ), comme référence de mise à la terre (voir la figure 2).
11. À l’aide d’un outil de forage à vitesse variable, faites un trou avec une pointe de taille 2 (longueur 44,5 mm) sur chacune des marques, veillez à ne pas pénétrer complètement dans le crâne.
12. Insérez l’électrode dans le trou et vissez-la soigneusement dans le crâne.
13. Répétez les étapes 4.10 et 4.11 jusqu’à ce que les sept vis soient correctement fixées.
14. Fixez les 7 vis avec une première couche de ciment dentaire. Insérez chaque électrode dans un connecteur. Couvrez entièrement les fils avec une deuxième couche de ciment dentaire (cela empêchera l’animal de retirer les vis) et le bas du connecteur. Si nécessaire, couvrir d’une troisième couche de ciment dentaire, en laissant le connecteur EEG propre pour une connexion correcte, afin que le dispositif EEG puisse être connecté correctement (voir Figure 3).
    REMARQUE: Après avoir placé chaque paire de vis bilatérales, celles-ci peuvent être fixées avec du ciment dentaire (étape optionnelle).
15. Laissez le rat en soins postopératoires pendant la nuit. Observez l’animal et fournissez-lui un coussin chauffant pendant 1 à 2 heures après la chirurgie, car l’anesthésie utilisée dans cette procédure provoque généralement une hypothermie et des problèmes respiratoires.
16. Administrer 50 mL/kg/24h (dose d’entretien) de solution saline par voie sous-cutanée pour prévenir la déshydratation. Injecter un anti-inflammatoire non stéroïdien (méloxicam 2 mg/kg, s.c.) et un antibiotique (enrofloxacine 5 mg/kg, p.o.) après la chirurgie et pendant les 24 heures suivantes.
17. Après la chirurgie, gardez les rats dans des cages individuelles pour une récupération complète pendant sept jours avant de procéder aux tests comportementaux.
18. Manipulez doucement l’animal périodiquement (au moins une fois par jour) pour aider à réduire le stress lors de manipulations futures. Tout en tenant le rat d’une main, la pression des doigts est doucement appliquée sur le dos de l’animal, en faisant glisser les doigts à travers la fourrure. Vérifiez la plaie à la tête, l’état de santé, le comportement en général et le poids corporel pendant une période d’une semaine après la chirurgie.
    REMARQUE : Si une anomalie ou des signes de maladie ou de stress sont détectés chez l’animal, avisez le médecin vétérinaire responsable. Après cette période, effectuez le test de reconnaissance d’objets Novel et la technique d’enregistrement EEG.

5. Test de reconnaissance d’objets nouveaux (NORT)

REMARQUE: Sept jours après la chirurgie, passez à des tests comportementaux. Toutes les procédures comportementales de l’expérience présentée ont été effectuées entre 14 h 00 min et 16 h 00 min, ce qui correspond au cycle lumineux du rat.

1. Placez un gilet en tissu souple (sur lequel le dispositif EEG serait placé pendant le test comportemental) sur le rat. Laissez l’accoutumance pendant 2-3 jours avant d’effectuer le test comportemental.
2. Placez une arène carrée en acrylique noir (500 x 500 x 500 mm) dans une salle d’enregistrement éclairée par une faible lumière.
3. Fixez deux nouveaux objets identiques au centre du sol de l’arène à l’aide de ruban adhésif double face (pour éviter son déplacement par les animaux). Les objets doivent être équidistants les uns des autres et des murs de l’aréna.
4. Nettoyez soigneusement chaque objet au préalable avec de l’éthanol à 50%, ainsi que le sol de l’arène après chaque essai (pour éviter les indices olfactifs).
   NOTE: Transférez toujours les animaux dans des salles d’hébergement (de la salle du vivarium à la salle expérimentale) au moins une demi-heure avant le début de chaque session. Après avoir terminé la session d’enregistrement, laissez les animaux dans la salle expérimentale pendant une heure supplémentaire. Ceci afin d’éviter le stress qui pourrait affecter la performance de ce test.
5. Connectez l’appareil EEG avant de commencer chaque test. Retenez doucement l’animal et insérez fermement le câble au connecteur situé sur la tête de l’animal à l’aide de la trousse EEG fixée au dos de l’animal (voir la figure 4). Un seul poste est autorisé.
   REMARQUE: Une manipulation préalable douce de l’animal peut aider à réduire le stress chez les animaux pendant la procédure de connexion. Sinon, le risque d’endommagement de l’appareil ou des animaux augmente. Préchargez complètement la batterie de l’appareil à l’aide d’un port USB.
6. Phases de tests de reconnaissance d’objets novateurs
   1. Habituation: Manipulez l’animal à intervalles de 5 minutes pendant deux jours consécutifs et, immédiatement après, placez l’animal sur l’arène (sans aucun objet) et laissez-le explorer librement pendant 10 minutes.
      REMARQUE: Avant d’exécuter des sessions de test d’acquisition et de mémoire, les rats ont été soigneusement manipulés et connectés au dispositif EEG correspondant, qui a été correctement fixé avant de commencer le test.
   2. Séance d’acquisition : Placez l’animal sur l’arène face à l’un des murs opposés aux objets. Permettez aux animaux d’explorer librement pendant 10 min. Passez à l’étape 6.13 pour l’enregistrement des tests à l’aide d’un logiciel de suivi comportemental.
      REMARQUE: Assurez-vous que l’appareil EEG maintient correctement le gilet attaché à l’arrière du rat (pour assurer un suivi approprié de l’animal). Pour un renforcement supplémentaire, utilisez du ruban de masquage.
   3. Test de mémoire à court terme (SMT): Remplacez l’un des objets par un autre complètement différent en forme, couleur et texture. Placez l’animal, 2 h après la séance d’acquisition, dans l’arène face à l’un des murs opposés aux objets. Laissez l’animal explorer librement pendant 10 min. Passez à l’étape 6.13 pour l’enregistrement des tests à l’aide du logiciel de suivi comportemental.
   4. Test de mémoire à long terme (LMT) : remplacez l’objet utilisé par tout autre objet complètement différent en forme, couleur et texture du test de mémoire à court terme. Placez l’animal 24 h après la séance d’acquisition, dans l’arène face à l’un des murs opposés aux objets. Permettre à l’animal d’explorer librement pendant 10 minutes Passez à l’étape 6.13 pour l’enregistrement du test à l’aide du logiciel de suivi comportemental.

6. Configuration du logiciel de suivi comportemental

1. Ouvrez le logiciel de suivi comportemental.
2. Connectez-vous au compte à l’aide de l’utilisateur et du mot de passe de l’institution.
3. Ouvrez le robinet « Nouvelle expérience vide » et choisissez un nom pour le protocole (par exemple, « NORT »).
4. Sélectionnez « Mode de suivi vidéo ».
   REMARQUE: Dans cette expérience, la caméra est configurée pour diffuser le suivi vidéo en direct. Cependant, il existe une option supplémentaire pour sélectionner des vidéos préenregistrées.
5. Allez à « Appareil ». Définissez la zone de l’arène, en ajustant le rectangle orange aux limites de l’arène projetée. Déterminez la région de l’objet, en ajustant les cercles orange à la bordure des objets à l’intérieur de l’arène projetés à partir de la caméra à l’écran.
6. Réglez la ligne de règle mobile à l’échelle sur une position le long de la longueur connue de l’image (l’arène). Entrez la longueur de l’objet en millimètres dans l’option « La longueur de la ligne de règle est » du panneau Paramètres. Dans ce cas, l’arène mesure 500 x 500 mm.
7. Allez à « Suivi et comportement ». Continuez jusqu’à « Zones ». Cliquez sur le menu « Ajouter un élément » et sélectionnez « Nouvelle zone ». Sélectionnez la zone de l’aréna et nommez-la nouvelle zone (p. ex., « Champ »).
8. Répétez l’étape précédente avec la zone des objets et nommez la nouvelle zone (par exemple, « Objets »).
9. Allez dans « Couleur de l’animal » et sélectionnez l’option « Les animaux sont plus clairs que l’arrière-plan de l’appareil ».
   NOTE: Des rats blancs (Wistar) ont été utilisés pour cette expérience. Cependant, le logiciel a des options supplémentaires pour les chercheurs qui utilisent des rats noirs et tachetés. Les deux races d’animaux peuvent être utilisées dans la même expérience.
10. Allez dans « Suivi de la tête et de la queue de l’animal » et sélectionnez « Oui, je veux que la tête et la queue de l’animal soient suivies ».
11. Aller à « Tests » | « Étapes » et dans le menu « Ajouter un élément », sélectionnez « Nouvelle étape ». Nommez la nouvelle étape, « Acquisition ». Définir la durée de l’étape (p. ex., 600 s).
12. Répétez l’étape précédente des étapes « Test de mémoire à court terme » et « Test de mémoire à long terme ».
    NOTE: Dans ce protocole, toutes les étapes ont la même durée (10 min).
13. Allez à « Procédures ». Définissez les événements à suivre pour chaque étape (acquisition, test de mémoire à court terme et test de mémoire à long terme).
14. Commencez le test (avec chaque animal). Allez dans « Tests » (dans la barre de menu supérieure) et sélectionnez « Ajouter un test (+) ». Attribuez un numéro à l’animal à tester (p. ex., « 1 »).
15. Sélectionnez « Enregistrer » et nommez les animaux et la session (p. ex., « M1 Acq »).
16. Avant de placer l’animal dans l’arène, cliquez une fois sur le bouton « Play ». Un message « en attente de démarrage » s’affiche.
17. Après avoir placé l’animal dans l’arène, cliquez une deuxième fois sur le bouton « Play ». Le test commencera et se terminera automatiquement.
18. Répétez les étapes 6.13-6.16 pour le test de mémoire à court terme (2 h après la session d’acquisition) et le test de mémoire à long terme (24 h après la session d’acquisition).

7. Configuration de l’appareil d’électrophysiologie sans fil

1. Connectez le modem à un hôte PC et allumez-le. Éteignez tout autre périphérique réseau sur le PC. De préférence, désactivez toute autre communication sans fil dans la salle d’enregistrement comme Bluetooth, les téléphones cellulaires, les autres modems ou même les combinés sans fil.
2. Fixez l’amplificateur au dos du rat, comme mentionné à l’étape 5.5.
3. Allumez l’appareil EEG en branchant la batterie.
   REMARQUE: 2 s après la connexion de l’appareil, une LED rouge sur l’amplificateur EEG clignote, indiquant que la communication avec le modem est active, puis une LED verte sera allumée. Si la communication réussit, les voyants du modem commencent à clignoter en continu. L’amplificateur est maintenant prêt à envoyer des informations au modem.
4. Lancez le logiciel EEG et configurez-le conformément aux instructions du fabricant pour l’intégrer dans le dispositif d’acquisition EEG sans fil
5. Appuyez sur le bouton « Démarrer l’affichage ». Le logiciel EEG affichera l’acquisition réelle du signal.
   REMARQUE: Utilisez « Gestionnaire des tâches de Windows » pour attribuer le mode de priorité « Temps réel » afin d’éviter les informations manquantes pendant l’expérimentation.

8. Enregistrement du signal électroencéphalographique (EEG)

1. Après avoir vérifié que le logiciel EEG acquiert des données, lancez le logiciel de suivi comportemental et définissez un protocole expérimental pour vérifier que l’animal se trouve dans la zone d’observation et que la configuration fonctionne correctement.
2. À ce stade, démarrez l’enregistrement du logiciel EEG en appuyant sur le bouton « Démarrer l’enregistrement ». Après avoir vérifié que le signal d’acquisition est en cours d’exécution, commencez l’expérimentation dans le BTS.
3. Une fois l’expérience terminée, revenez au logiciel EEG et arrêtez le processus d’enregistrement. L’enregistrement sera sauvegardé en utilisant un nom par défaut composé de la date d’enregistrement en utilisant le format suivant: « yyyy-mmdd-hhmm_SubjectID_Ephys.plx ». Par défaut, tous les enregistrements sont enregistrés dans le dossier du logiciel EEG (NeurophysData).
4. Vérifiez que les deux fichiers de données ont été créés. Enregistrez le journal d’expérience ou modifiez le nom pour éviter toute confusion.

9. Synchronisation des tâches comportementales et des signaux EEG

1. Ouvrez MATLAB et exécutez la commande : convert_plx2mat. Une telle fonction ouvrira une boîte de navigation. Les fonctions de conversion sont fournies par le fabricant et doivent être ajoutées au chemin de MATLAB.
2. Sélectionnez le *.plx à convertir et appuyez sur « Entrée » sur la ligne de commande de MATLAB pour le convertir en paramètres par défaut.
3. Ouvrez le fichier d’expérimentation BTS et allez dans « Protocole ». Cliquez sur l’option « Résultats, rapports et données », sélectionnez tous les événements des deux objets et cliquez sur « Choisissez le format d’heure pour le rapport », sélectionnez la troisième option: « Afficher les heures des événements en temps réel dans HH:MM:SS.sss - par exemple 13:20:14.791. »
4. Maintenant, allez dans « Fichier » et cliquez sur « Exporter » et « Exporter l’expérience au format XML », cochez « Date et heure du test », enfin cliquez sur « Créer XML ».
5. Allez dans « Exporter les données de test » et cliquez sur « Enregistrer les données ». Un fichier .csv avec les heures des événements sera créé.
6. Répétez les étapes 9.1 à 9.5 pour chaque fichier. Dans notre cas, les trois expériences étaient : ACQ, STM et LTM.
7. Une fois les fichiers EEG et de comportement convertis, rassemblez-les dans un seul dossier. Le dossier doit contenir six fichiers, les trois fichiers .mat et trois .csv, respectivement. Dans notre cas, les fichiers ont été appelés : PID_01_ACQ_N.mat, PID_02_STM_N.mat, PID_03_LTM_N.mat, PID_01_ACQ_M.csv, PID_02_STM_M.csv et PID_03_LTM_M.csv. ID fait référence au numéro d’identification d’un animal.
8. Ouvrez la fonction « procesa_sujeto.m » à l’aide de MATLAB et ajustez la deuxième ligne à l’identifiant de l’animal.
9. Maintenant, déplacez MATLAB vers ce dossier et exécutez: « procesa_sujeto » pour créer des figures de bande relative alpha et bêta à la puissance associées à la reconnaissance d’objets sur les étapes ACQ, STM et LTM.
   REMARQUE: « procesa_sujeto » est une fonction qui exécute / exécute plusieurs analyses de traitement du signal. Ces analyses sont résumées comme suit aux étapes 9.10 à 9.15.
10. Filtrez chaque signal EEG avec un filtre passe-bande Butterworth de 4e ordre à [5-40] Hz, en utilisant la correction de phase.
11. Inspecter visuellement les signaux avant l’analyse suivante, et les canaux avec des artefacts dérivés d’un placement défectueux des électrodes ou d’un mauvais ajustement par les mouvements des animaux ont été exclus de l’analyse plus approfondie.
12. Signaux de référence à la moyenne commune pour atténuer les artefacts de mouvement.
13. Segmentez les signaux EEG pour former des époques de 4 s de longueur synchronisées par des horodatages dérivés de BTS. Les événements ciblés étaient l’exploration de l’objet marquée par la distance de l’animal à la frontière des objets. Ces événements sont marqués sur les horodatages BTS et ont été utilisés comme identificateurs pour fixer les positions des fenêtres. Ainsi, les époques EEG sont délimitées de 1 s avant le début de l’exploration à 3 s après. À ce stade, aucune validation de la durée de l’exploration n’a été utilisée, mais elle sera prise en compte pour les recherches futures.
14. Estimer la densité de puissance spectrale sur ces époques en utilisant la méthode du périogramme de Welch en utilisant une longueur de fenêtre de 1 s, un chevauchement de 90%, fenêtre de Hanning avant l’estimation de la transformée de Fourier, avec ces paramètres, une résolution de 1 Hz a été atteinte.
15. Évaluer le spectre de puissance sur chaque bande en évaluant l’aire sous le périogramme, et les valeurs présentées correspondent à l’énergie relative, cela signifie que l’énergie de chaque bande EEG a été divisée par l’énergie totale de l’époque. Cette procédure réduit également les estimations erronées dues aux artefacts sur les signaux EEG.

Les méthodes décrites ci-dessus ont été appliquées pour enregistrer simultanément l’EEG et l’activité des rats après le traitement d’enrichissement de l’environnement. Les rats Wistar mâles âgés de trois mois ont été soumis à un protocole de traitement d’enrichissement environnemental à moyen terme pendant 20 jours, et ils ont été opérés pour fixer six électrodes à vis du crâne appariées sur les régions frontale, centrale et pariétale référencées à une septième électrode située en Nouvelle-Zélande. Les animaux ont été maintenus dans des conditions naturelles d’obscurité, avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Ce travail montre l’intégration entre le système EEG et le logiciel de suivi comportemental pour un enregistrement simultané en direct. Nous n’avons utilisé que des animaux traités selon le protocole EE car nous ne prétendons pas comparer l’efficacité du traitement, mais seulement illustrer les avantages de l’équipement. Comme preuve que le protocole de logement d’enrichissement environnemental de 20 jours utilisé stimule la neurogenèse adulte, nous présentons des données de numération cellulaire BrdU positives chez des animaux sous EE et des animaux hébergés dans des conditions standard à partir de données non publiées de notre laboratoire. Des rats Wistar mâles âgés de trois mois ont été utilisés. Ils ont été injectés trois fois avec BrdU avec 12 h d’intervalle. Les animaux ont été anesthésiés (pentobarbital (50 mg/kg, i.p.) et euthanasiés par perfusion transcardique (voir figure 5). Pour nous assurer que le gilet attaché à l’appareil EEG ne limite pas les mouvements des animaux, nous avons effectué le test en champ ouvert (OFT) en deux groupes, un groupe a subi une intervention chirurgicale tout en portant l’équipement (gilet et amplificateur EEG), et l’autre groupe d’animaux est resté intact sans porter le matériel. Nous n’avons pas trouvé de différences significatives dans la distance parcourue par les animaux en 10 minutes d’essai (voir Figure 5). Le protocole NORT typique consiste à présenter deux objets et à remplacer l’un d’eux par un nouvel objet. Le logiciel de suivi comportemental surveillait le temps d’exploration.

Le logiciel de suivi comportemental a enregistré un groupe d’animaux pour évaluer leurs principaux paramètres de performance. Par conséquent, nous avons utilisé trois paramètres pour évaluer le rendement de l’exploration. Le rapport de préférence a été calculé en utilisant le temps passé par la tête des animaux dans la zone d’objet, qui indique le temps total que la tête des animaux a passé dans chaque objet. En outre, nous avons calculé un rapport de préférence pour le temps passé à se déplacer vers les objets, qui montre le temps total passé sur chaque animal qui se déplaçait vers chaque zone d’objet. De plus, le temps passé par visite à chaque objet a été calculé. La figure 6 montre les résultats à trois paramètres mentionnés ci-dessus. Dans l’essai d’acquisition, il n’y avait pas de distinction entre les objets dans les trois paramètres évalués : le temps passé dans la zone d’objet pour les trois essais, le temps se déplaçant vers les objets pour les trois essais et le temps par visite dans chaque objet. Il n’y avait aucune différence dans l’essai STM. Pendant ce temps, dans l’essai LTM, un ratio préférentiel d’exploration significativement plus élevé pour le nouvel objet a été observé. De plus, dans l’essai LTM, une préférence pour l’objet nouveau dans le temps passé par visite (panneau C) a également pu être observée. La vidéo 1 montre un exemple représentatif d’un rat enregistré dans l’expérience tandis que la vidéo 2 montre un exemple représentatif d’EEG simultané et d’enregistrement comportemental.

Il était possible de faire correspondre les événements temporels suivis avec le suivi comportemental et l’enregistrement du logiciel EEG à l’aide de l’horloge de l’ordinateur. Les figures 7 et 8 montrent les changements de puissance relative EEG sur les bandes alpha et bêta. Ceux-ci sont liés au contrôle moteur, à la concentration et à la mémoire, ce qui suggère que l’exploration est simplement liée à ces fonctions. Les résultats de l’animal 3 montrent que la puissance alpha tend à diminuer sur STM en ce qui concerne ACQ et LTM, suggérant une désynchronisation liée à l’exploration ou à la récupération de mémoire. Le nombre de reconnaissance d’objets (époques traitées) était faible. À ce stade, il n’est pas possible de déterminer si un test statistique validerait si une telle différence est réelle ou si un artefact a pu produire de telles conditions expérimentales. Néanmoins, la segmentation, l’étiquetage et l’analyse des époques sont devenus possibles grâce à une chronologie d’événements de marquage simultanés chez les animaux et de résultats EEG produits pour de futurs projets de recherche. La combinaison de ces systèmes empêche une identification erronée des événements par un processus de marquage manuel, qui est devenu un problème important à des fins d’expérimentation animale. La combinaison du BTS et de l’activité électrophysiologique (EP) pourrait être associée avec précision au comportement animal; Néanmoins, les conditions expérimentales nécessitent l’utilisation de techniques avancées de traitement du signal pour éliminer les artefacts de mouvement et apporter des améliorations efficaces à la configuration expérimentale.

Figure 1 : Exemples de conditions d’environnement enrichi (EE) en cage. Le logement a été fourni avec des jouets et des tubes, dans lesquels les animaux trouvent nouveau et complexe, mais sans pertinence biologique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Positions des électrodes épidurales dans le crâne du rat. Les vis ont été utilisées simultanément comme ancrage pour le casque et comme électrodes. F = frontal; C = frontoparietal; P = pariétal; 3 = gauche; 4 = droite; NZ = comme référence au sol. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Images représentatives d’une chirurgie d’implantation d’électrodes épidurales (vis crânienne). Image montrant des électrodes intracrâniennes implantées vissées chez des rats à différents stades de la chirurgie. Assurez-vous que les techniques d’asepsie sont suivies lors de l’exécution de cette procédure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Images représentatives d’un rat avec la configuration expérimentale. Le rat a été obligé de porter le gilet attaché à l’appareil EEG avec une batterie intégrée, à l’intérieur de l’arène utilisée pour le protocole NORT. L’image montre le casque et le connecteur de câble installé sur le rat de la tête. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Preuve de capacité de mouvement et de stimulation neurogénique chez l’adulte par le protocole EE. (A) Des images représentatives de l’activité animale pendant 10 minutes lors de l’essai en plein champ (OFT) et de la distance moyenne parcourue par les animaux portant l’équipement/la chirurgie, et les animaux sans l’équipement/pas de chirurgie. (B-E) Section DG représentative avec cellules marquées BrdU (foncé intense) pour les groupes de logement EE et standard. Les panneaux B et D montrent un faible grossissement du DG, et les panneaux C et E montrent la surface de la boîte à un grossissement plus élevé. Les panneaux B et C sont des tissus du groupe de logement EE, les panneaux D et E sont du groupe de logement standard. L’encart illustre le nombre moyen de cellules marquées dans les deux groupes. ML - couche moléculaire; GCL – couche cellulaire granulaire; SGZ – zone sous-granulaire; flèches - cellules BrdU+. Les graphiques montrent la moyenne ± SEM. Le test T-student a été utilisé pour comparer les groupes. * p≤0,05. Aucune différence significative n’a été trouvée entre les groupes dans le test en plein champ. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Rendement de l’exploration dans l’évaluation NORT. (A) Temps passé dans la zone d’objet pour les trois essais. (B) Le temps se rapproche des objets des trois essais. (C) Temps par visite dans chaque objet. Les graphiques montrent la moyenne ± SEM. L’ANOVA bidirectionnelle à mesures répétées avec le test de comparaisons multiples de Sidak a été utilisée dans tous les paramètres. * p≤0,05, ** p≤0,01 entre les objets de l’essai respectif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Changements par rapport à la puissance de la bande EEG alpha associés à l’exploration. Cette figure montre les changements dans la puissance alpha relative, d’une demi-seconde à 2,5 après que l’animal a commencé l’exploration des objets. Les six graphiques correspondaient aux électrodes frontales, centrales et pariétales (de haut en bas) et aux côtés gauche et droit. Les boxplots montrent la distribution de ces séries chronologiques pour chaque combinaison de conditions d’un objet : « familier » et « roman » et de stade : « ACQ », « STM » et « LTM ». Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Changements par rapport à la puissance de la bande EEG bêta associée à l’exploration. Cette figure montre les changements sur la puissance bêta relative, d’une demi-seconde à 2,5 après que l’animal a commencé l’exploration des objets. Les six graphiques correspondaient aux électrodes frontales, centrales et pariétales (de haut en bas) et aux côtés gauche et droit. Les boxplots montrent la distribution de ces séries chronologiques pour chaque combinaison de conditions d’un objet : « familier » et « roman » et de stade : « ACQ », « STM » et « LTM ». Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo 1 : Vidéo représentative montrant un rat enregistré dans l’expérience. Le rat était à l’intérieur de l’arène utilisée pour le protocole NORT. Le rat portait le gilet attaché à l’appareil EEG avec une batterie intégrée. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 2: Vidéo représentative montrant l’EEG simultané et l’enregistrement comportemental. Le signal EEG était affiché sur le côté gauche tandis que le test comportemental (NORT) était affiché sur le côté droit de la vidéo. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Dr. Sylvia Ortega-Martinez travaille comme employée de Stoelting Co., une société qui a fourni et parrainé la production et le libre accès à cet article.