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Article de méthode

Un modèle xénogreffe dérivé par le patient pour la malformation veineuse

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DOI :

10.3791/61501

⸱

15 juin 2020

 ,  , 
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un protocole détaillé pour générer un modèle de xénogreffe murine de malformation veineuse. Ce modèle est basé sur l’injection sous-cutanée de cellules endothéliales dérivées du patient contenant des mutations du gène TIE2 hyper-activantes et/ou PIK3CA. Les lésions de Xenograft récapitulent étroitement les dispositifs histopathologiques du tissu patient de VM.

Résumé

La malformation veineuse (VM) est une anomalie vasculaire qui résulte d’une altération du développement du réseau veineux entraînant des veines dilatées et souvent dysfonctionnelles. Le but de cet article est de décrire soigneusement l’établissement d’un modèle de xénogreffe murine qui imite VM humaine et est capable de refléter l’hétérogénéité du patient. Les mutations TEK (TIE2) non héréditaires (somatiques) et PIK3CA dans les cellules endothéliales (EC) ont été identifiées comme les principaux moteurs de l’élargissement pathologique des vaisseaux dans la VM. Le protocole suivant décrit l’isolement, la purification et l’expansion des EC d’origine du patient exprimant le mutant TIE2 et/ou PIK3CA. Ces EC sont injectées sous-cutanéement dans le dos des souris athymiques immunodéficientes pour générer des canaux vasculaires ectatiques. Les lésions générées avec TIE2 ou PIK3CA-mutant EC sont visiblement vascularisées dans les 7\u20129 jours suivant l’injection et récapitulent les caractéristiques histopathologiques du tissu patient de VM. Ce modèle VM xenograft fournit une plate-forme fiable pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires conduisant la formation et l’expansion de VM. En outre, ce modèle sera instrumental pour des études translationnelles testant l’efficacité des nouveaux candidats de drogue dans la prévention de l’agrandissement anormal de navire vu dans VM humain.

Introduction

Les défauts dans le développement de la vascularisation sont la cause sous-jacente de nombreuses maladies, y compris la malformation veineuse (VM). VM est une maladie congénitale caractérisée par la morphogenèse anormale et l’expansion des veines1. Des études importantes sur les tissus VM et les cellules endothéliales (EC) ont identifié des mutations de gain de fonction dans deux gènes : TEK, qui code le récepteur de la tyrosine kinase TIE2, et PIK3CA, qui code l’isoforme p110α (sous-unité catalytique) de PI3-kinase (PI3K)2,3,4,5. Ces mutations somatiques entraînent une hyperactivation ligand-indépendante des voies de signalisation angiogéniques/de croissance clés, y compris PI3K/AKT, ce qui entraîne des veines ecstatiques dilatées3. Malgré ces découvertes génétiques importantes, les mécanismes cellulaires et moléculaires suivants déclenchant l’angiogenèse anormale et la formation de canaux vasculaires agrandis ne sont toujours pas entièrement compris.

Pendant l’angiogenèse normale et pathologique, de nouveaux vaisseaux germent d’un réseau vasculaire préexistant et EC subissent une séquence de processus cellulaires importants comprenant la prolifération, la migration, le remodelage de matrice extracellulaire (ECM) et la formation de lumen6. Les cultures in vitro bidimensionnelles (2D/3D) d’EC sont des outils importants pour étudier chacune de ces propriétés cellulaires individuellement. Néanmoins, il existe une demande claire pour un modèle de souris récapitulant l’élargissement pathologique des vaisseaux dans le microenvironnement hôte tout en fournissant une plate-forme efficace pour l’évaluation préclinique des médicaments ciblés pour la recherche translationnelle.

À ce jour, un modèle murin transgénique de VM associé aux mutations de gain de fonction tie2 n’a pas été rapporté. Les modèles transgéniques actuels de souris VM s’appuient sur l’expression omniprésente ou restreinte de tissu de la mutation activante PIK3CA p.H1047R3,5. Ces animaux transgéniques fournissent un aperçu significatif des effets spécifiques au corps entier ou aux tissus de cette mutation PIK3CA de point chaud. La limitation de ces modèles est la formation d’un réseau vasculaire hautement pathologique ayant pour résultat la létalité tôt. Ainsi, ces modèles de souris ne reflètent pas entièrement l’occurrence sporadique des événements mutationnels et de la nature localisée de la pathologie de VM.

Au contraire, les modèles de xénogreffe dérivés par le patient sont basés sur la transplantation ou l’injection de tissus pathologiques ou de cellules dérivées de patients sur des souris immunodéficientes7. Les modèles Xénogreffe sont un outil puissant pour élargir les connaissances sur le développement des maladies et la découverte de nouveaux agents thérapeutiques8. En outre, l’utilisation de cellules dérivées du patient permet aux scientifiques de récapituler l’hétérogénéité de mutation pour étudier le spectre des phénotypes de patients.

Ici, nous décrivons un protocole où les VM EC dérivés du patient qui expriment une forme mutante constitutivement active de TIE2 et/ou PIK3CA sont injectés sous-cutanéement dans le dos de souris nues athymiques. Les cellules vasculaires injectées sont suspendues dans un cadre ecm afin de promouvoir l’angiogenèse comme décrit dans les modèles xénogreffe vasculaires précédentes9,10,11. Ces EC de VM subissent la morphogenèse significative et génèrent des vaisseaux pathologiques agrandis et perfusés en l’absence de cellules de soutien. Le modèle de xénogreffe décrit de VM fournit une plate-forme efficace pour l’évaluation préclinique des drogues ciblées pour leur capacité à inhiber l’expansion incontrôlée de lumen.

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Protocole

Des échantillons de tissus de patients ont été obtenus auprès des participants après le consentement éclairé de la collection et du dépôt d’échantillons de tissus et de données de patients atteints de tumeurs et d’anomalies vasculaires dans le cadre d’un Comité d’examen institutionnel (CISR) approuvé par les politiques institutionnelles du Cincinnati Children’s Hospital Medical Center (CCHMC), du Cancer and Blood Disease Institute et avec l’approbation du Comité d’enquête clinique. Toutes les procédures animales décrites ci-dessous ont été examinées et approuvées par le Comité des soins et de l’utilisation des animaux institutionnels du CCHMC.

1. Préparation de matériaux et de solutions de stock

  1. Préparation d’un milieu complet de croissance des cellules endothéliales (EGM)
    1. Supplément de milieu basal endothélial (EBM) avec les facteurs de croissance suivants présents dans le kit (voir tableau des matériaux): facteur de croissance du fibroblaste humain-bêta (hFGF-β), facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF), Facteur de croissance semblable à l’insuline Arg3 Long- I (R3-IGF-I), acide ascorbique, facteur de croissance épidermique (EGF), sulfate de gentamycine et amphotericine-B, et l’héparine. Ajouter 1% de pénicilline/streptomycine/L-Glutamine (PSG) et 20% de sérum bovin fœtal (FBS).
      REMARQUE : Nous ne recommandons pas d’ajouter de l’hydrocortisone.
    2. Filtrer stérilement la solution sous un capot d’écoulement laminaire à travers un filtre de 0,2 μm de dessus de bouteille dans une bouteille en verre autoclavé et un support aliquot dans des tubes coniques de 50 mL et stocker à 4 °C jusqu’à une semaine ou à -20 °C pendant jusqu’à un an.
  2. Préparer la collagène Une solution de stock
    1. Préparer 50 mg/mL collagènease Une solution de stock en 1x phosphate tampon saline (PBS).
    2. Filtrer stérilement la solution sous un capot d’écoulement laminaire avec filtre et seringue de 0,2 μm, et stocker 100 aliquots μL à -20 °C.
  3. Préparer le milieu de collecte des tissus (Tampon A)
    1. Préparer une solution de stock Ca2+/Mg2+ en ajoutant 0,927 g de dihydrate de chlorure de calcium (CaCl2.2H2O) et 1 g d’héptahydrate de sulfate de magnésium (MgSO4.7H2O) à 500 mL d’eau distillée. Filtrer stérilement la solution à travers un filtre de 0,2 μm de dessus de bouteille dans une bouteille en verre autoclavée et stocker à température ambiante (RT).
    2. Supplémentez le milieu aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 10 % de solution Ca2+/Mg2+ et 2 % de FBS.
    3. Filtrer stérilement la solution sous un capot d’écoulement laminaire avec filtre et seringue de 0,2 μm et stocker les aliquots de 5 mL à -20 °C.
  4. Revêtement fibronectine des plaques de culture tissulaire
    1. Préparer le tampon de revêtement (tampon B) en dissolvant 5,3 g de carbonate de sodium (Na2CO3; 0,1 M) dans 500 mL d’eau déionisée. Ajuster le pH du tampon à 9,4 à l’aide d’acide chlorhydrique de 1 M (HCl). Filtrer sous un capot d’écoulement laminaire à travers un filtre de 0,2 μm de dessus de bouteille dans une bouteille en verre autoclaved et stocker à RT.
    2. Pour le revêtement, la pipette 2 mL/5 mL/10 mL de tampon B par plaque de culture tissulaire de 60 mm/100 mm/145 mm, respectivement. Ajouter 1 μg/cm2 de solution de protéines purifiées à plasma humain et répartir délicatement le liquide sur la plaque.
    3. Incuber la plaque à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 20 min.
    4. Aspirate Buffer B et laver la plaque avec pbs avant de cultiver les cellules.

2. Isolement des cellules endothéliales du tissu patient VM

  1. Isolement des EC des tissus VM solides
    REMARQUE : Le tissu de VM est réséqué par la chirurgie de débulking12,13 en vertu d’un protocole approuvé par la CISR.
    1. Laver le tissu VM (le poids de l’échantillon de tissu varie généralement entre 0,5 g et 1,5 g) dans 5% PSG dans PBS.
    2. Transférer le tissu dans un plat de culture cellulaire de 100 mm, hacher l’échantillon de tissu en petits morceaux à l’aide d’outils de dissection chirurgicaux stériles, et transférer dans un tube conique de 50 mL.
    3. Ajouter 100 μL de collagènease Une solution de bouillon à 5 mL de tampon A pour une concentration finale de 1 mg/mL, puis ajoutez-le au tissu et digère le tissu haché à 37 °C pendant 30 min tout en secouant le contenu toutes les 5 minutes.
    4. Broyer soigneusement le tissu digéré à RT à l’aide d’un broyeur de pilons de surface lisse de 6 mm dans le tube conique de 50 mL.
    5. Continuer à moudre soigneusement les tissus digérés à l’aide d’un pilon tout en ajoutant 5 mL de PBS froid complété par 0,5% d’albumine de sérum bovin (BSA) et 2% PSG. Répétez cette étape quatre fois.
    6. Filtrer la solution à travers une passoire cellulaire de 100 μm dans un tube conique de 50 ml pour enlever les fragments de tissu.
    7. Suspension de cellules de centrifugeuse pendant 5 min à 400 x g à RT. Procéder à l’étape 2.3.
  2. Isolement de VM EC du sang lésionnel obtenu à partir de la sclérothérapie du patient
    1. Obtenir le sang lésionnel humain de VM de sclérothérapie en vertu d’un protocole approuvé par la CISR.
    2. Le sang lésionnel dilué (le volume d’échantillon varie généralement entre 0,5 mL et 5 mL) dans pbs à un volume final de 40 mL.
    3. Suspension de cellules de centrifugeuse pendant 5 min à 200 x g à RT.
  3. Placage initial de cellules
    1. Jeter le supernatant et resuspender le granulé unicellulaire dans 1 mL d’EGM.
    2. Ajouter 9 mL d’EGM complet sur des plaques de 100 mm et des graines de 1 mL de suspension cellulaire.
    3. Incuber les cellules à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2.
    4. Tous les deux jours, retirez 2 mL de support et ajoutez 2 mL de FBS filtré stérile.
    5. Une fois que les cultures cellulaires atteignent une confluence de 40\u201250% changer le milieu pour terminer EGM. Il faut généralement entre 2\u20123 semaines pour que les cellules atteignent cette confluence.
    6. Observez tous les jours pour l’apparition des colonies de l’EC. Ils peuvent être reconnus par leur morphologie typique de type « pavé » (figure 1A). Entre 3\u20125, des colonies EC apparaissent dans chaque échantillon.
    7. Changez le milieu tous les deux jours pendant 5/u20127 jours jusqu’à ce que les colonies communautaires commencent à se toucher.
  4. Isolement manuel des différentes colonies communautaires
    1. Pour récolter les colonies d’EC, laver la plaque avec 5 mL de PBS et l’asphyxie manuelle avec une pipette sérologique.
    2. Prenez la plaque au microscope et encerclez les emplacements de plusieurs colonies ec à l’aide d’un stylo de marquage à la fois sur le couvercle et le fond avant de la retourner à la hotte d’écoulement laminaire.
    3. Détacher les colonies de CE en canalisant 50 μL de solution trypsin-EDTA à 0,05 % sur les zones marquées.
    4. À l’aide d’un petit grattoir à cellules ou d’une pointe de pipette, gratter délicatement les cellules de la plaque.
    5. Inclinez la plaque sur le bord le plus proche, et rincez avec 1 mL d’EGM par zone marquée et de recueillir les cellules.
    6. Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé.
    7. Plaquez les colonies ec recueillies à une densité de 1 x 104 cellules/cm2 sur des plats de culture cellulaire recouverts de fibronectine (1 μg/cm²) contenant des EGM frais. Le lendemain, changez de support pour compléter EGM.
    8. Modifier le milieu pour compléter EGM tous les deux jours pendant 2\u20123 semaines jusqu’à ce que les cellules atteignent 80% de confluence.
    9. Trypsinize EC avec 2 mL de trypsin-EDTA préchauffé à 0,05% par plat de 100 mm à 37 °C pendant 2 min et neutraliser la trypsie en ajoutant 4 mL d’EGM.
    10. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL et la centrifugeuse à 400 x g à RT pendant 5 min. Remplacer les cellules supernatantes et resuspend dans 2 mL d’EGM.
    11. Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé. Les nombres cellulaires typiques obtenus sont 1 x10 6 cellules par plaque de culture cellulaire de 60 mm ou 2 x 106 cellules par plaque de culture tissulaire de 100 mm.
    12. Pelleter les cellules par centrifugation à 400 x g à RT pendant 5 min et aspirate le supernatant. Passez à l’étape 3.2.1.

3. Sélection et expansion des cellules endothéliales

  1. Préparation de perles magnétiques conjuguées anti-CD31
    1. Vortex le flacon contenant les perles magnétiques anti-CD31 conjuguées pendant 30 s. Le nombre de perles requises est de 8 x 106 perles/2 x 106 cellules.
    2. Laver la quantité désirée de perles magnétiques conjuguées anti-CD31 avec 1 ml de solution de lavage contenant 0,1% de BSA dans PBS dans un tube de microcentrifuge de 1,5 mL.
    3. Placez le tube de microcentrifuge dans un aimant d’isolement cellulaire pendant 1 min.
    4. Remplacer le supernatant et répéter l’étape de lavage.
  2. Purification et placage des cellules endothéliales
    1. Resuspend de granulé de cellules obtenu dans 2.4.12 dans 500 μL de solution de lavage contenant 0.1% BSA dans PBS.
    2. Ajoutez une solution cellulaire au tube de microcentrifuge contenant des perles magnétiques et resuspendez complètement.
    3. Incuber pendant 20 min à 4 °C avec inclinaison douce.
    4. Ajouter 500 μL de 0,1 % de BSA dans pbs et bien mélanger.
    5. Placez le tube sur un aimant d’isolement cellulaire pendant 1 min.
    6. Apirate doucement tout le liquide, qui contient la fraction CD31-négatif des cellules sans toucher les perles.
    7. Laver le granulé de perle contenant la fraction cellulaire CD31-positive avec 1 mL de 0,1% BSA dans PBS et répéter la séparation magnétique.
    8. Répétez l’étape de lavage et de séparation magnétique pour un minimum de 3 fois pour purifier la fraction cellulaire CD31-positive.
    9. Resuspend les cellules endothéliales purifiées dans un tube conique de 15 mL et tournez vers le bas pendant 5 min à 400 x g à RT.
    10. Retirer le surnatant et resuspend le granulé de cellule dans 1 mL d’EGM.
    11. Ajouter 9 mL d’EGM complet sur des plaques de 100 mm et des graines de 1 mL de suspension cellulaire. Notez que certaines perles magnétiques sont encore attachées aux cellules dans cette étape initiale d’ensemencement. La plupart des perles se lavent pendant l’expansion cellulaire, mais un petit nombre de perles peut persister dans les premiers passages.
    12. Incuber les cellules à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2.
    13. Modifier le milieu tous les deux jours jusqu’à ce que les cellules atteignent 80 % de confluence (figure 1B).
  3. Expansion des cellules endothéliales
    1. Une fois que les cellules atteignent 80 % de confluence, détachez-la avec 2 mL de 0,05 % de trypsine-EDTA par plat de 100 mm à 37 °C pendant 2 min.
    2. Neutraliser la trypsine en ajoutant 4 ml d’EGM et recueillir des cellules dans un tube conique de 15 mL.
    3. Centrifugeuse à 400 x g à RT pendant 5 min.
    4. Remplacer les cellules supernatantes, resuspender dans 2 mL d’EGM, et compter le nombre de cellules avec un hémocytomètre ou par comptage automatisé des cellules.
    5. Cellules de graines à une densité de 1 x 104 cellules/cm² dans des plaques de culture tissulaire recouvertes de fibronectine de 145 mm (1 μg/cm²).
    6. Continuer à passer les cellules jusqu’à ce que le numéro de cellule souhaité ait été atteint. Considérez qu’une plaque de culture tissulaire confluente de 145 mm contient environ 8\u20129 x 106 cellules et le nombre de cellules nécessaires est de 2,5 x 106 cellules par injection. Seules les cellules entre le passage 3 et 8 doivent être considérées pour la xénogreffe.

4. Protocole de xénogreffe VM dérivé du patient

NOTE: Dans ce protocole, nous utilisons 5\u20126 semaine, immunodéficient masculin, athymique nue Foxn1souris nu.

Toutes les procédures animales doivent être approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC).

  1. Préparation des matériaux la veille de l’injection
    1. Pré-réfrigérer les seringues, les aiguilles et les pointes de pipet dans le congélateur de -20 °C pendant la nuit.
    2. Décongeler lentement la matrice extracellulaire de la membrane du sous-sol (BMEM) pendant la nuit sur un seau à glace placé à 4 °C pour éviter une visibilité accrue du gel.
  2. Préparation de la suspension cellulaire pour injection
    1. Trypsinize EC avec 5 mL de préchauffé 0,05% trypsin-EDTA par plat de 145 mm à 37 °C pendant 2 min.
    2. Neutraliser la trypsine en ajoutant 5 ml d’EGM et recueillir des cellules dans un tube conique de 15 mL.
    3. Centrifugeuse à 400 x g à RT pendant 5 min.
    4. Remplacer les cellules supernatantes et résuspender dans 3 mL d’EGM, et compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé.
    5. Déterminez le nombre total de cellules nécessaires pour toutes les injections planifiées.
      REMARQUE : Le nombre recommandé de cellules est de 2,5 x 106 cellules par injection. Un total de 2 injections sont généralement effectuées dans chaque souris pour des doublons techniques. Il est nécessaire de calculer un excédent de 10% du numéro de cellule pour tenir compte de la perte lors du transfert dans la seringue.
    6. Transférer le volume contenant le numéro de cellule calculé dans un nouveau tube conique de 50 mL et cellules de granulés par centrifugation à 400 x g à RT pendant 5 min.
    7. Remplacer le supernatant, en laissant un petit volume (environ 50\u201270 μL) pour desserrer le granulé.
  3. Préparation des seringues
    1. Calculer un volume excédentaire de 20 μL/injection pour tenir compte de la perte lors du transfert à la seringue. Resuspendez le granulé cellulaire avec 220 μL de BMEM par injection sur la glace. Le volume injecté de suspension cellulaire sera de 200 μL par lésion.
    2. Mélanger la suspension cellulaire à fond sur la glace pour obtenir une suspension homogène des cellules et éviter de créer des bulles.
    3. À l’aide d’un pipet de 1 mL et d’une seringue de 1 mL, le mélange BMEM-cell de pipet simultanément dans l’ouverture de la seringue par la force d’aspiration tout en tirant le piston de la seringue.
    4. Luer verrouille une aiguille stérile de 26 G x 5/8 pouces à la seringue et garde les seringues préparées à plat sur la glace avant l’injection.
  4. Injection sous-cutanée dans la souris
    1. Anesthésiez les souris avec un mélange isoflurane/oxygène de 5 % à un débit de 1 L/min à l’aide d’un vaporisateur isoflurane. Assurer une sédation adéquate des animaux (p. ex., manque de réaction aux pincements aux orteils). Maintenir l’anesthésie par l’administration continue de 1,5% isoflurane / oxygène livré par cône de nez.
    2. Placez les souris sur leur estomac, en exposant la région arrière où la greffe se produira et désinfecter la région d’injection avec 70% d’éthanol.
    3. Roulez doucement la seringue préparée pour réutiliser les cellules réglées. Faites glisser les bulles à l’extrémité de l’aiguille de la seringue et expulsez un petit volume de la suspension cellulaire pour assurer l’élimination de toutes les bulles.
      REMARQUE : Deux injections peuvent être effectuées pour chaque souris – sur le côté gauche et le côté droit du dos de la souris.
    4. Pincez et créez une structure « en forme de tente » à l’aide de votre pouce et de l’index et insérez l’aiguille sous-cutanéement juste sous la peau. Assurez-vous que l’aiguille n’est profonde que la peau en libérant la peau pincée pour empêcher l’injection dans le tissu musculaire.
    5. L’aiguille de maintien à angle de 45° injecte soigneusement 200 μL de la suspension cellulaire pour créer une petite masse sphérique (figure 1C).
    6. Enregistrez le poids de la souris avec une balance, identifiez la souris par l’oreille et retournez en cage.
    7. Surveiller les souris après la sédation pour s’assurer qu’elles retournent à l’activité normale.
  5. Surveillance de la croissance des lésions
    1. À l’aide d’un étrier, mesurer la longueur et la largeur de chaque prise (figure 1D).
    2. Mesures de document tous les deux jours jusqu’à la collecte des lésions.

5. Collecte et traitement des tissus

  1. Euthanasier les souris 9 jours après l’implantation dans une chambre de CO2 et vérifier les signes vitaux pour confirmer la mort. Effectuer une dislocation cervicale sur les souris comme une méthode secondaire pour euthanasier la souris.
  2. Récoltez la lésion/bouchon de xénogreffe du flanc de la souris par dissection à l’aide de forceps chirurgicaux et de ciseaux.
    REMARQUE : Afin d’éviter la rupture des vaisseaux remplis de sang à l’intérieur de la prise, il est important d’éviter de toucher la prise de lésion avec des outils de dissection et de laisser les tissus environnants excessifs tels que la peau attachée à la prise.
  3. Plongez la lésion réséquée dans pbs pour laver.
  4. Installez une scène de caméra avec une caméra. Aligner les bouchons sur une planche à découper avec une règle. Prenez une image de tous les bouchons pour enregistrer la vascularité brute des lésions (Figure 1E).
  5. Fixez les bouchons en submergeant 10% de formaline pendant la nuit à RT.
  6. Lavez les bouchons dans PBS le lendemain et déplacez-les dans 70 % d’éthanol.
  7. Bouchons de lésion de processus pour l’incorporation de paraffine (noyau de pathologie).

6. Sectionment des lésions

  1. Utilisez un microtome pour couper 5 sections de μm des lésions murines recueillies sur des lames chargées positivement.
    REMARQUE : Pour l’analyse subséquente, les sections au centre de la prise (environ 50\u201270 μm dans le tissu) sont importantes.
  2. Faire fondre la paraffine à 60 °C pendant 1 h avant la coloration.
  3. Dé-paraffiniser et réhydrater les tissus séquentiellement sous une hotte chimique d’écoulement de fumée. Par conséquent, incuber la diapositive dans le xylène pendant 10 min, 100% éthanol (EtOH) pendant 5 min, 90% EtOH pendant 3 min, et 80% EtOH pendant 3 min.
  4. Rincer la diapositive dans l’eau déionisée pendant 5 min.

7. Hématoxyline et Éosine (H&E)

  1. Incuber des sections dans l’hématoxyline pendant 2 min.
  2. Placez les diapositives dans un bocal à taches et rincez-les dans un évier par un jet régulier d’eau du robinet jusqu’à ce que l’eau soit claire.
  3. Déhydrater les lames en incuber les tissus séquentiellement en 70% EtOH pendant 1 min, 80% EtOH pour 1 min, 90% EtOH pour 1 min, 100% EtOH pour 1 min, et frais 100% EtOH pour 1 min.
  4. Sections de tache dans Eosin Y pour 30 s.
  5. Rincer à 100% etoh frais jusqu’à ce que la solution soit claire.
  6. Incuber la diapositive dans les xylènes pendant 2 min. Laisser sécher les diapositives pendant 5\u201210 min sous le capot de fumée.
  7. Distribuez une goutte de support de montage permanent et non aqueux sur les sections xénogreffes et placez le couvercle sur le dessus.
  8. Laissez sécher les lames toute la nuit avant l’imagerie.

8. Immunohistorichimie

  1. Préparer le tampon de récupération d’antigènes (Tris-EDTA) en pesant 0,6 g de tris-base et 1 mL de 0,5 M EDTA à 500 mL d’eau déionisée. Ajuster le pH à 9,0 à l’aide de 1 M HCl. Ajouter 250 μL de Tween-20.
  2. Incuber des lames de tissu dé-paraffinisées (obtenues à l’étape 6.2\u20126.3) dans un bécher avec tampon de récupération d’antigène, en remuant sur un bloc de chauffage, pendant 20 min à 95 °C.
  3. Retirer le bécher du bloc de chauffage, laisser refroidir à 35 °C, puis laver en PBS pendant 3 min.
  4. Bloquer les sections de tissu dans le sérum normal de cheval de 5% dans PBS pendant 30 min à RT.
  5. Préparer une solution de travail biotinylée Ulex europaeus agglutinine-I (UEA-I) en diluant 20 μg/mL d’UEA-I biotinylée dans 5% de sérum cheval normal en PBS.
  6. Pipet 50\u2012100 μL de solution de travail UEA-I par section et incuber pendant 1 h à RT dans une chambre humidifiante.
  7. Laver les diapositives deux fois dans PBS pendant 3 min.
  8. Quench sections de diapositives dans 3% peroxyde d’hydrogène pendant 5 min à RT.
  9. Laver les diapositives deux fois dans PBS pendant 3 min.
  10. Préparer 5 μg/mL de peroxydadé de raifort Streptavidin conjugué dans le sérum normal de cheval de 5% dans pbs.
  11. Pipet 50\u2012100 μL sur chaque lame de tissu et incuber pendant 1 h à RT dans une chambre humidifiante.
  12. Laver les diapositives deux fois dans PBS pendant 3 min.
  13. Préparer la solution 3,3'Diaminobenzidine (DAB) selon les instructions du fabricant et ajouter 50\u2012100 μL par section.
  14. Incuber les sections pour 10\u201215 min, vérifier et surveiller le développement des taches toutes les 2\u20125 min.
  15. Laver les diapositives trois fois dans PBS pendant 3 min.
  16. Ajouter une goutte d’hématoxyline et incuber pendant 3 min.
  17. Placez les diapositives dans un bocal à taches et rincez-les dans un évier par un jet régulier d’eau du robinet jusqu’à ce que l’eau soit claire.
  18. Incuber séquentiellement la diapositive dans 80% EtOH pendant 1 min, 90% EtOH pendant 1 min, 100% EtOH pendant 1 min, et xylène pendant 2 min.
  19. Laisser sécher les diapositives pendant 5\u201210 min sous le capot de fumée.
  20. Distribuez une goutte de support de montage permanent et non aqueux sur les sections xénogreffes et placez le couvercle sur le dessus.
  21. Laissez sécher les lames toute la nuit avant l’imagerie.

9. Analyse des canaux vasculaires d’origine humaine

NOTE : La vascularité des lésions de VM est quantifiée en mesurant la zone vasculaire et la densité vasculaire. Seuls les canaux vasculaires positifs d’UEA-I sont considérés pour la quantification.

  1. Prenez quatre à cinq images par section de lésion avec un microscope de champ lumineux à un grossissement de 20x (champs de haute puissance [HPF]). Prenez des images HPF dans un modèle x-plane dans la section de lésion pour éviter le chevauchement (Figure 1F-H). Inclure une barre d’échelle sur les images prises.
  2. Ouvrez les images HPF dans Image J (Fichier > Ouvrir). Calibrer les pixels de la barre d’échelle comme suit. Utilisez l’outil en ligne droite et passez au-dessus de la barre d’échelle. Pour convertir les pixels mesurés en mm, cliquez sur Analyser > Définir l’échelle.
  3. Cliquez sur Analyser > Définir les mesures et sélectionner Zone et Ajouter à la superposition.
  4. Mesurer la zone de champ totale d’un HPF à l’aide d’Analyse > Mesurer. Enregistrez cette mesure pour la quantification à l’étape 9.8.
  5. À l’aide de l’outil de sélection à main levée, décrivez manuellement les canaux vasculaires UEA-I+.
    REMARQUE : Un canal vasculaire est défini comme n’importe quelle zone qui est doublée d’UEA-I+ - EC qui peut contenir des cellules sanguines.
  6. Cliquez sur Analyser > Mesurez pour quantifier la zone vasculaire définie de l’UEA-I+ (mm2/HPF).
  7. Répétez cette mesure pour les cinq HPF prises dans une seule prise.
  8. Moyenne de la superficie vasculaire totale des cinq HPF. La superficie vasculaire obtenue par HPF est ensuite divisée par la zone de champ HPF (en mm2, étape 9,5) et exprimée en pourcentage (%).
  9. Pour la quantification de la densité vasculaire, comptez le nombre de canaux vasculaires UEA-I+ de chaque HPF pris. La densité vasculaire est le nombre moyen de canaux vasculaires UEA-I+ comptés par zone HPF (vaisseaux/mm2).

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Résultats

Ce protocole décrit le processus de génération d’un modèle de xénogreffe murine de VM basé sur l’injection sous-cutanée de l’EC patient-dérivé dans le dos des souris nues immunodéficientes. Les colonies de cellules endothéliales peuvent être récoltées dans les 4 semaines suivant l’isolement initial des cellules du tissu VM ou du sang lésionnel (figure 1A,B). Le lendemain de l’injection, le bouchon de lésion xénogreffe couvre une surface d’environ 80\u2012100 mm2. Dans nos mains, les bouchons d...

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Discussion

Ici, nous décrivons une méthode pour générer un modèle xénogreffe de VM dérivé du patient. Ce modèle murin présente un excellent système qui permet aux chercheurs d’acquérir une compréhension plus profonde de l’élargissement pathologique des lumens et jouera un rôle déterminant dans le développement de thérapies plus efficaces et ciblées pour le traitement de la VM. Ceci peut être facilement adapté pour étudier d’autres types d’anomalies vasculaires telles que la malformation veineuse lymphatique capillaire

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont pas de conflits d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier Nora Lakes pour la relecture. La recherche rapportée dans ce manuscrit a été soutenue par le National Heart, Lung, and Blood Institute, sous le numéro de prix R01 HL117952 (E.B.), qui fait partie des National Institutes of Health. Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Souris nues athymiques, (Foxn1-nu) ; 5-6 semaines, mâlesEnvigo069(nu)/070(nu/+)Injection sous-cutanée
Biotinylée Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I)Vector LaboratoriesB-1065Analyse histologique
Filtre sur flacon (500 ml ; 0,2 µ ; M)Thermo Fisher974106Culture cellulaire
Albumine sérique bovine (BSA)BSAA7906-50MGCulture cellulaire ; Analyse histologique
Chlorure de calcium dihydraté (CaCl2.2H2O)SigmaC7902-500GCulture cellulaire
Pied à coulisseMicroscopie électronique Sciences50996491Mesure du bouchon de lésion
CD31 Billes magnétiques conjuguées (Dynabeads)Life Technologies11155DEC Séparation Crépine
cellulaire (100 &mu ; M)Greiner542000Culture cellulaire
Collagénase ARoche10103578001Culture cellulaire
Tube conique ; polypropylène (15 mL)Greiner07 000 241Culture cellulaire
Tube conique ; polypropylène (50 mL)Greiner07 000 239Culture cellulaire
Coplin pot de colorationTed Pella21029Analyse histologique
Coverglass (50 X 22 mm)Fisher Scientific12545EAnalyse histologique
DAB : 3,3' Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB)Vector LaboratoriesSK-4105Analyse histologique
Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium (DMEM)Corning10-027-CVCulture cellulaire
DynaMag-2Life Technologies12321DSéparation EC
Poinçon d’oreilleVWR10806-286Injection sous-cutanée
EDTA (0,5 M, pH 8,0)Life Technologies15575-020Anlaysis histologique Endothelial
Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (milieu basal et suppléments)LonzaCC-3162Culture cellulaire
Eosin Y (à base d’alcool)Thermo Scientific71211Analyse histologique
EthanolDecon Labs2716Analyse histologique
Sérum fœtal bovin (FBS) , HyCloneGE HealthcareSH30910.03Culture cellulaire
Pointe du filtre 1 250 &mu ; LMidSciAV1250-Hétapes
Pointe de filtre 20 &mu ; LVWR10017-064étapes
Filtre tip 200 &mu ; LVWR10017-068
tamponnée au formol en plusieurs étapes (10 %)SigmaF04586Dissection du bouchon de lésion
Hémacytomètre (INCYTO ; Jetable)SKC FILMSDHCN015Culture cellulaire
Vecteurd’hématoxylineH-3401Analyse histologique
Plasma humain Protéine purifiée de fibronectine (1mg/mL)SigmaFC010-10MGCulture cellulaire
Solution de peroxyde d’hydrogène (30 % p/p)SigmaH1009Analyse histologique
LogicielImageJAnalyse
Isoflurane, USPAkorn Santé animale59399-106-01Injection sous-cutanée
magnésium heptahydraté (MgSO4.7H2O)SigmaM1880-500GCulture cellulaire
Matrice membranaire basale (sans rouge de phénol ; Sans LDEV)Corning356237Injection sous-cutanée
Tube de microcentrifugation (1,5 mL)VWR87003-294Lame de microscope de séparation EC
Superfrost (75mm x 25mm)Fisher Scientific1255015-CSAiguilles d’analyse histologique
, 26G x 5/8 pouces Aiguilles stériles Sub-QBecton Dickinson (BD)BD305115Injection sous-cutanée
Normal sérum de chevalVector LaboratoriesS-2000Anlaysis histologique
Pénicilline-Streptomycine-L-Glutamine (100X)Corning30-009-CICulture cellulaire
Milieu de montage permanent (VectaMount)Vector LaboratoriesH-5000Anlaysis histologique
Pestle Size C, PlainThomas Scientific3431F55EC
isolation Phosphate Tamponné Saline (PBS)Fisher ScientificBP3994Balance de culture cellulaire
VWR65500-202Injection sous-cutanée
Pipettes sérologiques (10 ml)VWR89130-898Culture cellulaire
Pipettes sérologiques (5ml)VWR89130-896Culture cellulaire
Carbonate de sodium (Na2CO3)Sigma223530Culture cellulaire
Streptavidine, Raifort Peroxydase, Concentré, pour IHCVector LaboratoriesSA-5004Seringue de culture cellulaire
(60ml)BD Biosciences309653Culture de celluloïde
FILTRE DE SERINGUE (0.2 µ ; M)Corning431219
Seringues de culture cellulaire (1 mL avec Luer Lock)Becton Dickinson (BD)BD-309628Injection sous-cutanée
Plaque traitée pour culture tissulaire (100 X 20 mm)Greiner664160Culture cellulaire
Plaque traitée pour culture tissulaire (145X20 mm)Greiner639160Culture cellulaire
Plaques traitées pour culture tissulaire (60 X 15) mmEppendorf30701119Culture cellulaire
Tris-base (base Trizma)SigmaT6066Analyse histologique
Trypan Blue Solution (0,4 %)Life Technologies15250061Culture cellulaire
Trypsine EDTA, 1X (0,05 % Trypsine/0,53 mM EDTA)Corning25-052-ClCulture cellulaire
Tween-20Biorad170-6531Analyse histologique
Bouteille WheatonVWR16159-798Culture cellulaire
XylènesFisher ScientificX3P-1GALAnalyse histologique
Plusieurs Plusieurs Solution sulfate de

Références

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