Analyse de l’ARN de microdissection à capture laser pour analyse d’expression génique spécifique aux tissus spatiaux et temporels chez les plantes

Summary

Présenté ici est un protocole pour la microdésection laser-capture (LCM) des tissus végétaux. LCM est une technique microscopique pour isoler les zones de tissu d’une manière sans contamination. La procédure comprend la fixation des tissus, l’incorporation de paraffine, la sectionnement, l’extraction de LCM et d’ARN. L’ARN est utilisé dans l’analyse spécifique aux tissus en aval et résolue temporellement des transcriptomes.

Abstract

Le développement d’un organisme multicellulaire complexe est régi par des types de cellules distincts qui ont des profils transcriptionnels différents. Pour identifier les réseaux de régulation transcriptionnels qui régissent les processus de développement, il est nécessaire de mesurer les profils d’expression des gènes spatiaux et temporels de ces différents types de cellules. Par conséquent, il est essentiel de mieux comprendre le contrôle spatio-temporel de l’expression génique pour mieux comprendre comment les processus biologiques et développementaux sont réglementés. Ici, nous décrivons une méthode de microdissection de capture laser (LCM) pour isoler un petit nombre de cellules de trois organes d’embryon d’orge au cours d’un cours de temps pendant la germination suivie du profilage de transcription. La méthode consiste en la fixation des tissus, le traitement des tissus, l’incorporation de paraffine, la sectionnement, l’extraction de LCM et d’ARN suivie d’une PCR ou d’un RNA-seq en temps réel. Cette méthode nous a permis d’obtenir des profils spatiaux et temporels des transcriptomes d’organes de semence à partir de différents nombres de cellules (des dizaines à des centaines), fournissant une spécificité tissulaire beaucoup plus grande que les analyses typiques des tissus en vrac. À partir de ces données, nous avons pu définir et comparer les réseaux de réglementation transcriptionnels ainsi que prévoir les facteurs de transcription réglementaires des candidats pour les tissus individuels. La méthode doit s’appliquer à d’autres tissus végétaux avec un minimum d’optimisation.

Introduction

Le développement et la croissance des plantes impliquent l’action coordonnée des réseaux de régulation transcriptionnels au sein de différentes cellules qui existent dans un environnement cellulaire complexe. Pour comprendre l’activité de ces réseaux de réglementation, nous avons besoin de la connaissance de l’expression des gènes spatiaux et temporels dans différents types de cellules à travers les stades de développement. Cependant, les analyses de l’expression des gènes sont plus couramment effectuées dans des organes entiers ou des échantillons de tissus en vrac en raison du défi technique d’isoler et d’analyser un petit nombre de cellules. La méthode que nous déc....

Protocol

Comme le produit final est l’ARN, prenez soin d’éviter de contaminer le travail avec RNases. Porter des gants est un must. Utiliser le pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) -eau traitée, tampons, etc. Tampons autoclave et cuire la verrerie avant utilisation.

1. Fixation des tissus

1. Préparer le fixatif de choix en fonction des espèces et des types de tissus; pour les semences d’orge, utiliser le fixatif de Farmer (75 % d’éthanol, 25 % d’acide acétique glaciaire (v/v)).
2. Refroidir le fixatif sur la glace avant la récolte des tissus.
3. Recueillir le matériel végétal d’intérêt et, si nécessaire, le disséquer en morceaux de ....

Results

Nous avons généré des transcriptomes spécifiques aux tissus spatiaux et temporels à partir de graines d’orge pendant la germination à l’aide de notre protocole LCM ARN-seq¹⁰. L’étude a été réalisée en appliquant l’ARN-seq LCM à un petit nombre de cellules de trois organes embryonnaires (plumule, pointe radicule, scutellum) tous les 8 h sur un cours de 48 h pendant la germination (0-48 h, 7 points de temps) (Figure 2A,B).

Discussion

De nombreuses études d’expression génétique spécifiques aux tissus ont été limitées par la dissection à la main d’échantillons, qui prend beaucoup de temps, qui demande beaucoup de main-d’œuvre, présente un risque élevé de contamination et ne peut utiliser que des échantillons qu’un agent humain est suffisamment habile pour récolter. LCM est une technique précise et sans contact pour recueillir les cellules à partir de sections de tissus fixes à l’aide d’un faisceau laser actionné mécaniquement sous visualisation microsc.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acide acétique 100 % ACS/R.	AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)	VWRC20104.323
AdhesiveCap 200 opaque	Zeiss	415190-9181-000
Moules à base transparente 8 X 10	Leica	3803015
Pyrocarbonate de diéthyle	Sigma-Aldrich	40718-25ML
ScreenTape d’ARN haute sensibilité	Agilent	5067-5579
Low­ ; profil disp.lames DB80LS	Leica	14035843489
MembraneSlide 1.0 PEN	Zeiss	415190-9041-000
MessageAmp II aRNA Amplification Kit	Ambion (ThermoFisher)	AMB17515
On-Column DNase I Digestion Set	Sigma-Aldrich	DNASE70
Ovation RNA-Seq System V2	NuGen (Integrated Science)	7102-08
Paraffine (Surgipath Paraplast)	Leica	39601006
PicoPure Kit d’isolement d’ARN	ABI (ThermoFisher)	KIT0214
RNaseZap RNase Solution de décontamination	Ambion (ThermoFisher)	AM9780
Xylene	AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)	VWRC28975.360
Leica Processeur de tissus de paillasse	Leica Biosystems	TP1020
Module d’enrobage de paraffine chauffée	Leica Biosystems	EG1150H
Leica Plaque froide	Leica Biosystems	EG1150C
Safemate Classe 2 Enceintes de sécurité biologique	LAF Technologies Pty Ltd	Safemate 1.5
Microtome rotatif Leica entièrement automatisé	Leica	Biosystems RM2265	avec logiciel PALMRobo v 4.6
			Zeiss PALM MicroBeam LCM
TapeStation Agilent		TapeStation 2200