Ce manuscrit décrit un protocole pour la vitrification minimale de volume des ovocytes immatures de chat avec des médias de laboratoire-faits sur des supports commerciaux. Il couvre chaque étape de l’isolement des ovocytes des gonades ex vivo à la vitrification et au réchauffement.
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Article de méthode
Vitrification minimale en volume des ovocytes félins immatures
Dans cet article
Résumé
Résumé
Dans les programmes de conservation des animaux sauvages, la banque de mentières est cruciale pour protéger les ressources génétiques d’individus précieux et d’espèces rares et pour promouvoir la préservation de la biodiversité. Chez les félidés, la plupart des espèces sont menacées d’extinction, et les races domestiques sont utilisées comme modèle pour accroître l’efficacité des protocoles pour les services bancaires de germplasme. Parmi les techniques de cryoconservation des ovocytes, la vitrification est de plus en plus populaire dans la procréation assistée humaine et vétérinaire. La vitrification cryotop, qui a d’abord été développée pour les ovocytes humains et les embryons, s’est avérée bien adaptée aux ovocytes de chat. Cette méthode offre plusieurs avantages, tels que la faisabilité dans les conditions de terrain et la vitesse de la procédure, qui peut être utile lorsque plusieurs échantillons doivent être traités. Toutefois, l’efficacité dépend fortement des compétences de l’opérateur, et une normalisation intra- et inter-laboratoires est nécessaire, ainsi que de la formation du personnel. Ce protocole décrit la vitrification minimale du volume des ovocytes félins immatures sur un support commercial dans un protocole étape par étape respectueux du terrain, de la collecte des ovocytes au réchauffement. Conformément au protocole, la préservation de l’intégrité des ovocytes et la viabilité au réchauffement (jusqu’à 90 %) bien qu’il y ait encore place à l’amélioration des résultats de maturation après le réchauffement et de développement embryonnaire.
Introduction
La cryoconservation est devenue une étape clé des techniques de procréation assistée (ART). Chez l’homme, il permet la préservation de la fertilité ou le report de la parentalité pour des raisons médicales ou personnelles. Chez les animaux, il est nécessaire de surmonter la distance et le temps dans les accouplements planifiés, en particulier chez les animaux de ferme et les animaux de compagnie, ou de préserver le matériel génétique de sujets précieux dans les programmes de conservation, en particulier chez les espèces sauvages menacées. La cryoconservation des ormons est le meilleur choix lorsque les individus à élever n’ont pas encore été choisis ou afin d’éviter l....
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Protocole
Les procédures décrites par les présentes n’ont pas fait l’objet d’une approbation éthique puisque les ovaires de chat ont été recueillis dans les cliniques vétérinaires comme sous-produits de l’ovariectomie de routine ou de l’ovariohystérectomie demandée par le propriétaire.
1. Collection d’ovocytes
- Avant de commencer les expériences, préparer des solutions pour la collecte des ovaires et des ovocytes. Préparer une solution de collecte d’ovaires avec de la solution saline tamponnée de phosphate (PBS) avec un mélange d’antibiotiques et d’antimycotiques (100 UI/mL de pénicilline G sodium, 0,1 mg/mL de sulfate de streptomycine, 0,25....
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Résultats
Après la vitrification et le réchauffement des ovocytes de chat selon le protocole actuel (figure 1 et figure supplémentaire 1),la grande majorité des gamètes survivent. Après la vitrification, entre autres techniques, la viabilité peut être évaluée au microscope optique comme l’intégrité morphologique22 ou avec l’utilisation de taches vitales. L’un de ces derniers est le diacétate/propidium de fluorescéine/ipodure de propidium (FDA/PI), qui permet l’.......
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Discussion
La cryoconservation des ovocytes est une technique cruciale de conservation du germplasme, en particulier dans les taxons où de nombreuses espèces sont en voie de disparition, comme la famille des Felidae. Dans ce manuscrit, un protocole simple et respectueux du terrain pour la vitrification des ovocytes immatures de chat a été présenté. Les médias fabriqués en laboratoire, les soutiens à la vitrification minimale en volume et le personnel formé sont les facteurs clés du succès de cette méthode, qui permet d’obtenir des .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été en partie soutenu par EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) Grant 2016 et par Università degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). Nous tenons également à remercier la Dre MariaGiorgia Morselli pour sa contribution aux expériences décrites par les présentes et à l’acquisition d’images.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Amphotéricine B | Sigma-Aldrich | A2942 | / |
| Pipettes automatiques & pointes | / | /Nécessaire | pour pipeter 20, 100, 240 et 300 µ ; L |
| Scalpels chirurgicaux | / | / | La taille 10 est généralement acceptable |
| Bec Bunsen | / | / | / |
| Pinces courtes | / | / | Certaines petites (pince anti-moustiques) pour l’isolement des ovaires, d’autres plus grandes (pince Klemmer) pour travailler dans l’azote liquide |
| Cryotop | Kitazato (distributeur : MBT - Medical Biological Technologies) | 01.CR | Les distributeurs et le numéro de catalogue peuvent changer dans différents pays |
| Diméthylsulfoxyde (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | / |
| Éthylène glycol (EG) | Sigma-Aldrich | E9129 | / |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | / |
| Pipettes Pasteur en verre | / | / | Longueur conseillée 230 mm (100+130) |
| Gobelets | / | / | Selon les bidons de la cuve de stockage |
| Étape de chauffage | / | /Toutes | les étapes de chauffage sont correctes, tant qu’elles peuvent garder 38º ; C |
| Azote liquide | / | / | /Medium |
| 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | / |
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | / |
| Pénicilline G | sodique Sigma-Aldrich | P3032 | / |
| Alcool polyvinylique (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | / |
| Plaque | de reproductionKitazato (distributeur : MBT - Medical Biological Technologies) | 01.K-2 | Les distributeurs et le numéro de catalogue peuvent changer dans différents pays |
| Stéréomicroscope | / | /Tant | que l’opérateur peut sélectionner les ovocytes, les autres stéréomicroscopes sont ok |
| Réservoir de stockage | / | / | Tout réservoir régulièrement rempli est ok |
| Sulfate de streptomycine | Sigma-Aldrich | S9137 | / |
| Boîte en polystyrène / boîte résistante à l’azote | / | / | Toutes les boîtes pouvant contenir de l’azote liquide sont ok, tant que l’opérateur est à l’aise. La boîte Kitazato s’appelle « Cool Rack"Sucrose |
| Sigma-Aldrich | S1888 | / | |
| Timers | / | /Tous | les timers qui peuvent être réglés sur des horaires jusqu’à 9 minutes sont ok |
Références
- Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. The social implications of embryo cryopreservation. Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).
- Saragusty, J., Arav, A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification.
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Réimpressions et autorisations
