Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Vitrification minimale en volume des ovocytes félins immatures

6.4K vues

⸱

DOI :

10.3791/61523

⸱

24 juin 2020

 , 
1Dipartimento di Scienze Veterinarie per la Salute, la Produzione Animale e la Sicurezza Alimentare 'Carlo Cantoni', Università degli Studi di Milano

Dans cet article

Résumé

Ce manuscrit décrit un protocole pour la vitrification minimale de volume des ovocytes immatures de chat avec des médias de laboratoire-faits sur des supports commerciaux. Il couvre chaque étape de l’isolement des ovocytes des gonades ex vivo à la vitrification et au réchauffement.

Résumé

Dans les programmes de conservation des animaux sauvages, la banque de mentières est cruciale pour protéger les ressources génétiques d’individus précieux et d’espèces rares et pour promouvoir la préservation de la biodiversité. Chez les félidés, la plupart des espèces sont menacées d’extinction, et les races domestiques sont utilisées comme modèle pour accroître l’efficacité des protocoles pour les services bancaires de germplasme. Parmi les techniques de cryoconservation des ovocytes, la vitrification est de plus en plus populaire dans la procréation assistée humaine et vétérinaire. La vitrification cryotop, qui a d’abord été développée pour les ovocytes humains et les embryons, s’est avérée bien adaptée aux ovocytes de chat. Cette méthode offre plusieurs avantages, tels que la faisabilité dans les conditions de terrain et la vitesse de la procédure, qui peut être utile lorsque plusieurs échantillons doivent être traités. Toutefois, l’efficacité dépend fortement des compétences de l’opérateur, et une normalisation intra- et inter-laboratoires est nécessaire, ainsi que de la formation du personnel. Ce protocole décrit la vitrification minimale du volume des ovocytes félins immatures sur un support commercial dans un protocole étape par étape respectueux du terrain, de la collecte des ovocytes au réchauffement. Conformément au protocole, la préservation de l’intégrité des ovocytes et la viabilité au réchauffement (jusqu’à 90 %) bien qu’il y ait encore place à l’amélioration des résultats de maturation après le réchauffement et de développement embryonnaire.

Introduction

La cryoconservation est devenue une étape clé des techniques de procréation assistée (ART). Chez l’homme, il permet la préservation de la fertilité ou le report de la parentalité pour des raisons médicales ou personnelles. Chez les animaux, il est nécessaire de surmonter la distance et le temps dans les accouplements planifiés, en particulier chez les animaux de ferme et les animaux de compagnie, ou de préserver le matériel génétique de sujets précieux dans les programmes de conservation, en particulier chez les espèces sauvages menacées. La cryoconservation des ormons est le meilleur choix lorsque les individus à élever n’ont pas encore été choisis ou afin d’éviter les problèmes éthiques associés à la congélation d’embryons, en particulier en médecine humaine1. Les spermatozoïdes sont relativement faciles à préserver et donnent des résultats satisfaisants après la décongélation, mais les ovocytes, en raison de leurs caractéristiques structurelles, pourraient être plus complexes à stocker. En effet, le faible rapport surface/volume, ainsi que la présence de la zona pellucida entourant l’ooplasma, limite le mouvement des cryoprotectants et de l’eau à travers la cellule2. En outre, chez les animaux domestiques, y compris les félidés, ils sont caractérisés par un cytoplasme riche en lipides, qui est pensé pour les rendre plus sensibles à la cryoconservation3.

La plupart des félidés sont menacés, et le chat domestique est utilisé comme un modèle pour développer des protocoles pour la préservation du germplasme grâce à la disponibilité des gonades de l’ovariectomie de routine. Chez les animaux sauvages, les gonades peuvent être obtenues après des chirurgies électives ou (plus fréquemment) post-mortem,et les gamètes immatures (vésicule germinale) peuvent être récupérés. La stimulation hormonale visant à obtenir des ovocytes matures (métaphase II) n’est pas aussi commune que dans les ARTs humains en raison des questions éthiques et de la réponse spécifique à l’espèce et à l’individu aux traitements4.

Par conséquent, le développement de stratégies de cryoconservation s’est concentré sur les gamètes immatures, qui peuvent généralement être récupérés après la mort inattendue ou soudaine d’individus rares. D’un point de vue biologique, il existe certaines différences dans la cryoconservation des gamètes immatures ou matures, chacun ayant ses avantages. Tout d’abord, l’ADN est plus protégé dans les ovocytes immatures, dont la vésicule germinale contient des chromosomes entourés d’une membrane nucléaire, tandis que le fuseau meiotique des ovocytes métaphasé II pourrait être plus vulnérable aux cryoin jurys5. Deuxièmement, les dommages causés par le cytosquelette induits par le froid pourraient affecter la rotation des fuseaux, l’extrusion du corps polaire, la migration pronucléaire et la cytokinesis, qui pourraient avoir des impacts différents selon la phase développementale des ovocytes, influençant la progression de la méiose ou les événements post-fertilisation. Enfin, et peut-être le plus important, alors que les ovocytes matures sont prêts à être fécondés, les gamètes immatures s’appuient sur le soutien des cellules cumulus environnantes pour passer par la maturation nucléaire et cytoplasmique6, et c’est la raison pour laquelle des complexes cumulus-ovocytes entiers (COC) sont cryopréservés. Cependant, la perte de cellules cumulus et/ou la perte de connexion fonctionnelle entre le ormiste et les cellules somatiques environnantes sont probablement l’effet le plus néfaste de la cryoconservation des COC immatures.

Parmi les techniques de cryoconservation, la vitrification est une que l’on peut appliquer plus facilement dans des conditions de terrain. Comparativement à la congélation lente (ou à taux contrôlé), la vitrification est plus rapide et ne nécessite pas d’équipement spécifique, comme un congélateur programmable. Afin de satisfaire les trois principes fondamentaux de la vitrification (c.-à-d. une viscosité élevée, liée à une forte concentration cryoprotecteur, de petits volumes et une diminution de température ultra-rapide), plusieurs milieux et supports ont été développés et utilisés spécialement chez les chats pour les ovocytes immatures et matures. En commençant par de simples pailles7, des dispositifs ont ensuite été développés pour atteindre l’objectif « volume minimum ». Cryoloop8, pailles à tiré ouvertes (OPS)9, gouttières en plastique (paille modifiée)10 et cryotubes11 ont été utilisés, jusqu’à ce qu’un dispositif plus efficace (c.-à-d. Cryotop) a été utilisé11, améliorant la survie et la reprise de la méiose. Cryotop (Figure supplémentaire 1) est un support disponible dans le commerce qui est devenu le système ouvert électif pour la vitrification. Développé pour la vitrification des ovocytes humains et des embryons, il se compose d’une petite bande de film attachée à un support en plastique dur, protégé par un bouchon de tube en plastique pendant le stockage12. Grâce à sa facilité d’utilisation et à la réduction extrême du volume de vitrification (aussi peu que 0,1 μL), ce qui conduit également à des taux de refroidissement et de réchauffement extrêmement rapides, ce soutien à la vitrification a été de plus en plus appliqué chez plusieurs espèces, y compris le chat domestique, dans lequel il a été utilisé avec une variété de médias13,14,15,16,17.

Le but de ce manuscrit est de décrire un protocole de réchauffement de la vitrification-vitrification de collection, avec des modifications mineures de celui initialement développé pour les ovocytes humains, qui emploie des supports de laboratoire et commerciaux pour la vitrification minimale de volume et peut être facilement appliqué dans des conditions de champ pour la cryoconservation des COC félins immatures.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Les procédures décrites par les présentes n’ont pas fait l’objet d’une approbation éthique puisque les ovaires de chat ont été recueillis dans les cliniques vétérinaires comme sous-produits de l’ovariectomie de routine ou de l’ovariohystérectomie demandée par le propriétaire.

1. Collection d’ovocytes

  1. Avant de commencer les expériences, préparer des solutions pour la collecte des ovaires et des ovocytes. Préparer une solution de collecte d’ovaires avec de la solution saline tamponnée de phosphate (PBS) avec un mélange d’antibiotiques et d’antimycotiques (100 UI/mL de pénicilline G sodium, 0,1 mg/mL de sulfate de streptomycine, 0,25 μg/mL d’amphotericine B). Préparer une solution de collecte d’ovocytes (c.-à-d. PBS/PVA) avec pbs avec 100 UI/mL de pénicilline G sodium, 0,1 mg/mL de sulfate de streptomycine et 0,1 % (w/v) d’alcool polyvinyle (APV).
  2. Stockez les solutions pour la collecte des ovaires et des ovocytes à 4 °C jusqu’à l’utilisation.
  3. Le jour de l’utilisation des reines, quelques heures avant le traitement des échantillons, prendre une partie des solutions de collecte des ovaires et des ovocytes et les laisser se réchauffer à température ambiante (RT; 25 ± 2 °C).
  4. Lorsque les échantillons arrivent au laboratoire, isoler les ovaires du tissu conjonctif environnant et de l’oviducte et les laver dans un milieu de collecte d’ovaires frais dans une boîte de Pétri.
  5. Remplissez une boîte de Pétri de 35 mm pour chaque reine avec environ 3 mL de RT PBS/PVA, et un plat de plus pour recueillir les ovocytes.
  6. Placez une paire d’ovaires dans une boîte de Pétri et émincer le cortex avec un scalpel chirurgical. Assurez-vous que tous les follicules ont été cassés à l’aide d’un stéréomicroscope (grossissement 8x).
  7. Recueillir les COC avec une pipette et les déplacer dans pbs frais / PVA dans la boîte de Pétri allouée. Choisissez de bonnes qualités COC, avec un cytoplasme homogène et sombre et entouré de plusieurs couches compactes de cellules cumulus (grade I18).

2. Vitrification

  1. Préparer les médias d’équilibre et de vitrification.
    1. Préparer une solution d’équilibre (ES) avec 7,5 % (v/v) d’éthylène glycol (EG) et 7,5 % (v/v) de diméthylsulphoxide (DMSO) dans le milieu 199, avec 20 % de sérum fœtal de bovins (FBS).
    2. Préparer la solution de vitrification (VS) avec 15% (v/v) EG, 15% (v/v) DMSO et 0,5 M de saccharose dans le moyen 199, avec 20% FBS (modifié à partir de 19).
    3. Laissez ES et VS se réchauffer à RT avant d’utiliser.
      REMARQUE : Les cryoprotectants (p. ex., EG, DMSO) sont connus pour être cytotoxiques. Une stratégie pour contrer leur toxicité est de réduire la température à laquelle les cellules sont exposées à eux20, et les ovocytes sont généralement exposés à des cryoprotectants à RT. Ainsi, l’ensemble de la procédure, de la collecte des ovocytes à la vitrification, est effectué à RT dans ce protocole pour éviter les fluctuations de température.
  2. Préparer le plat de vitrification (c.-à-d. un plat spécial composé de six puits coniques divisés en deux rangées, connu sous le nom de « plaque de repro »). Préparer une rangée (trois puits) pour chaque support de vitrification.
    1. Ajouter 20 μL d’ES au bas du premier puits.
    2. Ajouter 300 μL de VS au bas des deuxièmes (c.-à-d. 1VS) et troisième (c.-à-d. 2VS).
  3. Équilibrer les COC dans ES.
    1. Avec une pipette à petit forage (p. ex., une pipette Pasteur tirée sur un bec de Bunsen pour la rendre plus mince – le diamètre doit être d’au moins 200 μm), transférer un (ou plusieurs) COC(s) sur le fond du premier puits.
      REMARQUE : Choisissez la taille de la pipette en fonction du nombre de couches de cellules cumulus entourant les ovocytes, afin de réduire autant que possible le volume de support qui est transféré avec les COC à chaque étape. Avec le protocole actuel, les opérateurs formés peuvent vitrifier avec succès jusqu’à huit COC félins par chaque support de vitrification.
    2. Ajouter lentement 20 μL d’ES à la bordure de la goutte. Attendez 3 minutes.
    3. Ajouter lentement 20 μL d’ES à la frontière de la goutte. Attendez 3 minutes.
    4. Ajouter lentement 240 μL d’ES à la bordure de la goutte. Attends 9 minutes.
    5. En attendant, préparer une boîte avec de l’azote liquide (LN2),étiqueter un support de vitrification avec le code d’identification de l’expérience/chat et la laisser ouverte. Mettez les deux près du stéréomicroscope, de sorte qu’ils peuvent être facilement accessibles tout en travaillant.
      Attention! Portez de l’équipement de protection individuelle lors de la manipulation de LN2.
    6. Sinon, si plusieurs COC doivent être vitrifiés, commencez la première étape d’équilibre (voir l’étape 2.3.1 - 2.3.2) pour un autre groupe de COC (qui sera chargé sur un nouveau support de vitrification).
  4. Vitrifier les COC en VS en moins de 90 secondes.
    1. À l’aide de la même pipette à petit forage, remplissez-la de 1VS, prenez les COC du bas du premier puits (ES) et déplacez-les à la surface du second puits (1VS).
    2. Laver la pipette avec 1VS.
    3. Prenez les COC et déplacez-les dans une autre zone (au fond) du puits; mélanger le milieu qui les entoure avec la pipette.
    4. Remplissez la pipette de 1VS dans une autre zone du puits, prenez les COC, déplacez-les et mélangez le milieu qui les entoure avec la pipette.
    5. Répétez l’étape 2.4.4.
    6. Laver la pipette avec 2VS.
    7. Prenez les COC et déplacez-les sur le fond du troisième puits (2VS); mélanger le milieu qui les entoure avec la pipette.
    8. Remplissez la pipette de 2VS dans une autre zone du puits, prenez les COC, déplacez-les et mélangez le milieu qui les entoure avec la pipette.
    9. Répétez l’étape 2.4.8.
    10. Remplissez la pipette de 2VS dans une autre zone du puits, prenez les COC et chargez-les sur la bande du support de vitrification, aussi près que possible de la pointe. Aspirate en excès de milieu pour réduire le volume de VS autant que possible.
    11. Plongez immédiatement le support de vitrification dans LN2, le déplaçant. Fermez-le à l’aide de quelques pinces, en vous assurant qu’il reste toujours immergé dans LN2.
      REMARQUE : Le maintien du bon timing est crucial en raison de la toxicité des cellules cryoprotecantes. En raison de leur forte concentration dans les milieux vitrification, l’exposition cellulaire doit être contrôlée, également par l’exécution sans faille de la technique21. Si les échantillons sont abondants, envisagez de les diviser pour les traiter plus rapidement et de minimiser le temps entre la collecte des ovocytes et la vitrification.
  5. Conserver les supports de vitrification chargés dans un gobelet et les conserver dans un réservoir LN2 de stockage jusqu’à ce qu’ils se réchauffent.
    REMARQUE : Toutes les étapes précédentes du protocole peuvent également être appliquées dans des conditions de terrain si LN2 est disponible. Un expéditeur à sec sera nécessaire pour transporter les échantillons au laboratoire en toute sécurité, puis procéder aux phases suivantes.

3. Réchauffement

  1. Préparez les médias qui réchauffent.
    1. Préparer la solution de décongélation (TS) avec 1 M de saccharose en 199 moyen, avec 20% de FBS.
    2. Préparer la solution de dilution (DS) avec 0,5 M de saccharose en 199 moyen, avec 20% FBS.
    3. Préparer la solution de lavage (WS) avec Medium 199 avec 20% FBS.
    4. Avant utilisation, réchauffez TS à 38 °C et DS et WS à RT.
  2. Si nécessaire, préparer le milieu de culture pour l’utilisation ultérieure de COC réchauffés (p. ex., maturation in vitro, IVM).
  3. Placez le stade de chauffage près du stéréomicroscope et allumez-le (38 °C). Mettre le couvercle d’une boîte de Pétri pour réchauffer.
  4. Lorsque tout est prêt, transférer les supports de vitrification qui doivent être réchauffés du réservoir de stockage à une boîte avec LN2, et mettre la boîte près du stéréomicroscope.
  5. Préparez la « plaque Repro ». Préparez une rangée pour chaque support de vitrification qui doit être réchauffé.
    1. Ajouter 300 μL de DS au bas du premier puits.
    2. Ajouter 300 μL de WS au bas des deuxièmes (c.-à-d. 1WS) et les troisièmes (c.-à-d. 2WS).
  6. Faire une goutte de TS (100 μL) sur le couvercle de la boîte de Pétri.
  7. Avec des pinces, ouvrez un support de vitrification dans le LN2.
  8. Mettez la chute TS sous le stéréomicroscope et avec un mouvement rapide prendre le support de vitrification de la LN2 et plonger sa bande dans la goutte, le déplaçant jusqu’à ce que tous les COC se détachent. Retirez le support de la goutte dès qu’elle est vide, mais laissez les COC en TS pendant 1 minute au total (de l’immersion jusqu’à l’étape suivante).
  9. Prenez une pipette semblable à celle utilisée pour la vitrification et remplissez-la de DS. Prenez les COC de la baisse (TS) et déplacez-les vers le bas du premier puits (DS). Attendez 3 minutes.
  10. Laver la pipette avec 1WS. Prenez les COC et déplacez-les sur le bas du deuxième puits (1WS). Attendez 5 minutes.
  11. Laver la pipette avec 2WS. Prenez les COC et déplacez-les à la surface du troisième puits (2WS). Attendez qu’ils touchent le fond du puits.
  12. Répétez l’étape 3.11 à l’aide d’une autre zone du puits.
  13. Laver la pipette avec un milieu de culture et déplacer les ovocytes dans le plat de culture pour l’utilisation suivante (p. ex., IVM).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Après la vitrification et le réchauffement des ovocytes de chat selon le protocole actuel (figure 1 et figure supplémentaire 1),la grande majorité des gamètes survivent. Après la vitrification, entre autres techniques, la viabilité peut être évaluée au microscope optique comme l’intégrité morphologique22 ou avec l’utilisation de taches vitales. L’un de ces derniers est le diacétate/propidium de fluorescéine/ipodure de propidium (FDA/PI), qui permet l’...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

La cryoconservation des ovocytes est une technique cruciale de conservation du germplasme, en particulier dans les taxons où de nombreuses espèces sont en voie de disparition, comme la famille des Felidae. Dans ce manuscrit, un protocole simple et respectueux du terrain pour la vitrification des ovocytes immatures de chat a été présenté. Les médias fabriqués en laboratoire, les soutiens à la vitrification minimale en volume et le personnel formé sont les facteurs clés du succès de cette méthode, qui permet d’obtenir des ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été en partie soutenu par EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) Grant 2016 et par Università degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). Nous tenons également à remercier la Dre MariaGiorgia Morselli pour sa contribution aux expériences décrites par les présentes et à l’acquisition d’images.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Amphotéricine BSigma-AldrichA2942/
Pipettes automatiques & pointes//Nécessairepour pipeter 20, 100, 240 et 300 µ ; L
Scalpels chirurgicaux//La taille 10 est généralement acceptable
Bec Bunsen///
Pinces courtes//Certaines petites (pince anti-moustiques) pour l’isolement des ovaires, d’autres plus grandes (pince Klemmer) pour travailler dans l’azote liquide
CryotopKitazato (distributeur : MBT - Medical Biological Technologies)01.CRLes distributeurs et le numéro de catalogue peuvent changer dans différents pays
Diméthylsulfoxyde (DMSO)Sigma-AldrichD2650/
Éthylène glycol (EG)Sigma-AldrichE9129/
Sérum fœtal bovin (FBS)Sigma-AldrichF9665/
Pipettes Pasteur en verre//Longueur conseillée 230 mm (100+130)
Gobelets//Selon les bidons de la cuve de stockage
Étape de chauffage//Toutesles étapes de chauffage sont correctes, tant qu’elles peuvent garder 38º ; C
Azote liquide///Medium
199Sigma-AldrichM4530/
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Sigma-AldrichD8662/
Pénicilline Gsodique Sigma-AldrichP3032/
Alcool polyvinylique (PVA)Sigma-AldrichP8136/
Plaquede reproductionKitazato (distributeur : MBT - Medical Biological Technologies)01.K-2Les distributeurs et le numéro de catalogue peuvent changer dans différents pays
Stéréomicroscope//Tantque l’opérateur peut sélectionner les ovocytes, les autres stéréomicroscopes sont ok
Réservoir de stockage//Tout réservoir régulièrement rempli est ok
Sulfate de streptomycineSigma-AldrichS9137/
Boîte en polystyrène / boîte résistante à l’azote//Toutes les boîtes pouvant contenir de l’azote liquide sont ok, tant que l’opérateur est à l’aise. La boîte Kitazato s’appelle « Cool Rack"Sucrose
Sigma-AldrichS1888/
Timers//Tousles timers qui peuvent être réglés sur des horaires jusqu’à 9 minutes sont ok

Références

  1. Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. The social implications of embryo cryopreservation. Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).
  2. Saragusty, J., Arav, A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification. Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).
  3. Luvoni, G. C. Gamete cryopreservation in the domestic cat. Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).
  4. Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids. Theriogenology. 109, 14-21 (2018).
  5. Parks, J. E. Hypothermia and mammalian gametes. Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).
  6. Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).
  7. Murakami, M., et al. Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose. Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).
  8. Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen. Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).
  9. Luciano, A. M., et al. Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes. Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).
  10. Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 44, SUPPL. 2 269-274 (2009).
  11. Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes. Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).
  12. Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method. Theriogenology. 67 (1), 73(2007).
  13. Pope, C. E., et al. In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer. Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).
  14. Galiguis, J., Gómez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes. Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).
  15. Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique. Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).
  16. Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions. Animals. 9 (6), 329(2019).
  17. Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes. Reproduction in Domestic Animals. , (2020).
  18. Wood, T. C., Wildt, D. E. Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro. Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).
  19. Cobo, A., Kuwayama, M., Pérez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remohí, J. Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method. Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).
  20. Mullen, S. F., Critser, J. K. The science of cryobiology. Oncofertility - Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).
  21. Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of cryopreservation by vitrification. Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).
  22. Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification. Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).
  23. Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).
  24. Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives. Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).
  25. Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes. Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).
  26. Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season. International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).
  27. Nowak, A., et al. The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method. Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Cryoconservation des ovocytes félinsProtocole de vitrificationSupport CryotopSolution d'équilibrationSolution de vitrificationStockage dans l'azote liquideProcédure de réchauffementViabilité après réchauffementComplexes cumulus-ovocyte
Vitrification minimale en volume des ovocytes félins immatures
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.