Empreintes digitales chromatographiques par correspondance de modèle pour les données collectées par chromatographie en phase gazeuse bidimensionnelle complète

Résumé

Ce protocole présente une approche pour prendre des empreintes digitales et explorer les données multidimensionnelles collectées par chromatographie en phase gazeuse bidimensionnelle complète couplée à la spectrométrie de masse. Des algorithmes de reconnaissance de formes dédiés (correspondance de modèles) sont appliqués pour explorer les informations chimiques cryptées dans la fraction volatile extra vierge de l’huile d’olive (c’est-à-dire le volatilome).

Résumé

Le traitement et l’évaluation des données sont des étapes essentielles de la chromatographie en phase gazeuse bidimensionnelle complète (GCxGC), en particulier lorsqu’elles sont couplées à la spectrométrie de masse. Les informations riches chiffrées dans les données peuvent être très précieuses mais difficiles d’accès efficacement. La densité et la complexité des données peuvent entraîner de longs délais d’élaboration et nécessiter des procédures laborieuses et dépendantes des analystes. Des outils de traitement des données efficaces mais accessibles sont donc essentiels pour permettre la diffusion et l’acceptation de cette technique multidimensionnelle avancée dans les laboratoires pour une utilisation quotidienne. Le protocole d’analyse de données présenté dans ce travail utilise l’empreinte digitale chromatographique et l’appariement de modèles pour atteindre l’objectif de déconstruction hautement automatisée de chromatogrammes bidimensionnels complexes en caractéristiques chimiques individuelles pour une reconnaissance avancée des modèles informatifs dans les chromatogrammes individuels et dans les ensembles de chromatogrammes. Le protocole offre une cohérence et une fiabilité élevées avec peu d’intervention. Dans le même temps, la supervision des analystes est possible dans une variété de contextes et de fonctions de contrainte qui peuvent être personnalisées pour offrir la flexibilité et la capacité de s’adapter à différents besoins et objectifs. La correspondance de modèle est montrée ici comme une approche puissante pour explorer le volatilome extra vierge de l’huile d’olive. L’alignement croisé des pics est effectué non seulement pour des cibles connues, mais également pour des composés non ciblés, ce qui augmente considérablement la puissance de caractérisation pour un large éventail d’applications. Des exemples sont présentés pour prouver la performance pour la classification et la comparaison des modèles chromatographiques à partir d’ensembles d’échantillons analysés dans des conditions similaires.

Introduction

La chromatographie en phase gazeuse bidimensionnelle complète combinée à la détection spectrométrique de masse en temps de vol (GC×GC-TOF MS) est aujourd’hui l’approche analytique la plus informative pour la caractérisation chimique d’échantillons complexes^1,2,3,4,5. Dans GC×GC, les colonnes sont connectées en série et interfacées par un modulateur (p. ex., une interface de mise au point thermique ou basée sur une vanne) qui emprisonne les composants élués de la première colonne de dimension⁽¹D) avant leur réinfiltration dans la deuxième colonne de dimension⁽²D). Cette opération est effectuée dans un délai de modulation fixe(P_M),généralement compris entre 0,5 et 8 s. Par modulation thermique, le processus comprend le cryo-piégeage et la mise au point de la bande d’élution avec certains avantages pour la puissance de séparation globale.

Bien que GC×GC soit une technique de séparation bidimensionnelle, le processus produit des valeurs de données séquentielles. Le convertisseur analogique-numérique (A/N) du détecteur obtient le signal chromatographique de sortie à une certaine fréquence. Ensuite, les données sont stockées dans des formats propriétaires spécifiques qui contiennent non seulement les données numérisées, mais aussi les métadonnées connexes (informations sur les données). Le convertisseur A/N utilisé dans les systèmes GC×GC aide à mapper l’intensité du signal chromatographique à un nombre numérique (DN) en fonction du temps dans les deux dimensions analytiques. Les détecteurs à canal unique (p. ex. détecteur à ionisation de flamme (FID), détecteur à capture d’électrons (ECD), détecteur à chimiluminescence de soufre (SCD), etc.) produisent des valeurs uniques par temps d’échantillonnage, tandis que les détecteurs multicanaux (p. ex. détecteur spectrométrique de masse (MS)) produisent plusieurs valeurs (généralement sur une plage spectrale) par temps d’échantillonnage tout au long de l’analyse.

Pour visualiser les données ^2D,l’élaboration commence par la rastérisation d’une seule période de modulation (ou cycle) valeurs de données sous la forme d’une colonne de pixels (éléments d’image correspondant à des événements de détecteur). Le long de l’ordonnée (axe Y, de bas en haut), le temps de séparation ^2Dest visualisé. Les colonnes de pixels sont traitées séquentiellement afin que l’abscisse (axe X, de gauche à droite) signale le temps de séparation ^1D. Cet ordre présente les données ^2Ddans un système de coordonnées cartésiennes droitiers, avec l’ordinal de rétention ^1Dcomme premier index dans le tableau.

Le traitement des données des chromatogrammes ^2Ddonne accès à un niveau d’information plus élevé que les données brutes, ce qui permet la détection des pics ^2D,l’identification des pics, l’extraction des données de réponse pour l’analyse quantitative et l’analyse comparative croisée.

Les modèles de crête ^2Dpeuvent être traités comme l’empreinte digitale unique de l’échantillon et les composés détectés comme des caractéristiques de minutie pour une analyse comparative croisée efficace. Cette approche, connue sous le nom de prise d’empreintes digitales basée sur un modèle^6,7, a été inspirée par l’empreinte digitale biométrique⁶. Les systèmes automatiques de vérification biométrique des empreintes digitales reposent en fait sur des caractéristiques uniques du bout des doigts: bifurcations et terminaisons de crête, localisées et extraites d’impressions encrées ou d’images détaillées. Ces caractéristiques, appelées minuties features, sont ensuite croisées avec les modèles stockés disponibles^8,9.

Comme mentionné ci-dessus, chaque modèle de séparation GC×GC est composé de pics ²D répartis rationnellement sur un plan bidimensionnel. Chaque pic correspond à un seul analyte, a son potentiel informatif et peut être traité comme une caractéristique unique pour l’analyse comparative des modèles.

Ici, nous présentons une approche efficace pour l’empreinte chimique par GC×GC-TOF MS avec l’ionisation en tandem. L’objectif est de cataloguer de manière complète et quantitative les entités à partir d’un ensemble de chromatogrammes.

Par rapport aux logiciels commerciaux existants ou aux routines internes^10,11 qui utilisent une approche de fonctionnalités de pointe, la prise d’empreintes digitales basée sur un modèle se caractérise par une spécificité élevée, une efficacité et un temps de calcul limité. En outre, il dispose d’une flexibilité intrinsèque qui permet l’alignement croisé des caractéristiques de minutie (c’est-à-dire des pics ^{de 2}D) entre les chromatogrammes gravement mal alignés comme ceux acquis par différentes instrumentations ou dans des études à long terme^12,13,14.

Les opérations de base de la méthode proposée sont décrites brièvement pour guider le lecteur vers une bonne compréhension de la complexité du modèle ^2Det de la puissance de l’information. Ensuite, en explorant la matrice de données de sortie de l’instrument, l’identification chimique est effectuée et des analytes ciblés connus sont situés sur l’espace bidimensionnel. Le modèle de pics ciblés est ensuite construit et appliqué à une série de chromatogrammes acquis au sein d’un même lot analytique. Les métadonnées relatives aux temps de rétention, aux signatures spectrales et aux réponses (absolues et relatives) sont extraites des modèles réalignés des pics ciblés et adoptées pour révéler les différences de composition dans l’ensemble d’échantillons.

En tant qu’étape supplémentaire et unique du processus, une prise d’empreintes digitales combinée non ciblée et ciblée (UT) est également effectuée sur des chromatogrammes pré-ciblés pour étendre le potentiel d’empreintes digitales aux analytes connus et inconnus. Le processus produit un modèle UT pour une analyse comparative vraiment complète qui peut être largement automatisée.

En dernière étape, la méthode effectue l’alignement croisé des caractéristiques dans deux signaux de détecteur parallèles produits avec des énergies d’ionisation électronique élevées et faibles (70 et 12 eV).

Le protocole est assez flexible dans les analyses de support d’un seul chromatogramme ou d’un ensemble de chromatogrammes et avec la chromatographie variable et/ou plusieurs détecteurs. Ici, le protocole est démontré avec une suite logicielle GC×GC disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) combinée à une bibliothèque MS et à un logiciel de recherche (voir le tableau des matériaux). Certains des outils nécessaires sont disponibles dans d’autres logiciels et des outils similaires pourraient être mis en œuvre indépendamment des descriptions dans la littérature par Reichenbach et ses collègues^{15,16,17,18,19}. Les données brutes pour la démonstration sont dérivées d’une étude de recherche sur l’huile d’olive extra vierge (EVO) menée dans le laboratoire des auteurs¹⁴. En particulier, la fraction volatile (c’est-à-dire le volatilome) des huiles EVO italiennes est échantillonnée par microextraction en phase solide dans l’espace libre (HS-SPME) et analysée par GC×GC-TOF MS pour capturer les empreintes diagnostiques pour la qualité et la qualification sensorielle des échantillons. Des détails sur les échantillons, les conditions d’échantillonnage et la structure analytique sont fournis dans la table des matières.

Les étapes 1 à 6 décrivent le prétraitement des chromatogrammes. Les étapes 7 à 9 décrivent le traitement et l’analyse des chromatogrammes individuels. Les étapes 10 à 12 décrivent la création et l’appariement des modèles, qui constituent la base de l’analyse des échantillons croisés. Les étapes 13 à 16 décrivent l’application du protocole à un ensemble de chromatogrammes, avec les étapes 14 à 16 pour l’analyse UT.

Protocole

1. Importation de données brutes

Remarque : cela crée un tableau raster à deux dimensions pour la visualisation et le traitement.

1. Lancez le logiciel d’image.
2. Sélectionner un fichier | Importation; naviguez vers le fichier de données brutes acquis par le système GC×GC-TOF MS nommé « VIOLIN 101.lsc »(fichier supplémentaire 1) et choisissez-le- y; puis, cliquez sur Ouvrir. Le chromatogramme s’ouvre dans ce logiciel.
   Remarque : format de fichier de données brutes dépend du fabricant de l’instrument. Le logiciel importe une variété de formats de fichiers répertoriés dans le guide de l’utilisateur.
3. Dans la boîte de dialogue Importer, définissez la période de modulation(P_M) sur 3,5 s; puis, cliquez sur OK.
   Remarque : Certains logiciels d’acquisition peuvent ne pas enregistrer la période de modulation.
4. Sélectionner un fichier | Enregistrer l’image sous; accédez au dossier souhaité; entrez le nom « Oil 1 RAW.gci »(dossier supplémentaire 2); puis, cliquez sur Enregistrer.

2. Déplacement de la phase de modulation

Remarque : Cela met tous les pics dans chaque cycle de modulation dans la même colonne d’image, y compris les pics qui s’enroulent autour de la fin de la période de modulation dans le temps vide de la prochaine période de modulation^20.

1. Sélectionner le | de traitement Phase de décalage.
2. Dans la boîte de dialogue Phase de décalage, définissez le montant de décalage sur -0,8 s ; puis, cliquez sur OK.

3. Correction de base²¹

1. Sélectionner des | graphiques Dessiner le rectangle.
2. Cliquez et faites glisser pour dessiner un rectangle dans l’image où aucun pic n’est détecté.
3. Sélectionner les outils | Visualiser les données; noter la moyenne et l’écart type du signal du détecteur, ici, 21,850 ± 1,455 SD numéro numérique (DN) sans unité; ensuite, fermez l’outil.
4. Sélectionner le | de traitement Ligne de base correcte.

4. Coloration de l’image chromatographique à l’aide d’une carte des valeurs et d’une palette de couleurs²⁰

1. Sélectionnez Afficher les | Coloriser.
2. Dans la boîte de dialogue Coloriser, sélectionnez l’onglet Importer/Exporter ; sélectionnez la palette de couleurs personnalisée #AAAA(fichier supplémentaire 3)fournie comme matériel supplémentaire; ensuite, cliquez sur Importer.
3. Sur les contrôles mappage de valeurs, définissez la plage de valeurs sur les valeurs minimales et maximales ; puis, cliquez sur OK.

5. Détection de pics ²D (c.-à-d. blobs) pour les analytes¹⁸

1. Sélectionner le | de traitement Détecter les objets blob avec les paramètres par défaut ; ensuite, observez que certains pics sont divisés et qu’il y a de fausses détections.
2. Sélectionnez Configurer | Paramètres | Détection d’objets blob; puis définissez Lissage sur 0,1 pour la première dimension et 2,0 pour la deuxième dimension et définissez Volume minimum (c’est-à-dire seuil pour les valeurs additionnées) sur 1,00 E6; puis, cliquez sur OK.
3. Sélectionner le | de traitement Détecter les objets blob avec les nouveaux paramètres ; ensuite, observez les améliorations.

6. ²D pics de filtration

REMARQUE: Ceci est fait pour supprimer automatiquement les détections inutiles dues aux saignements de colonne le long du ¹D et aux impacts ou résidus le long du ^2D.

1. Sélectionner le | de traitement Détection interactive d’objets blob.
2. Notez les paramètres de détection d’objets blob ; puis, cliquez sur Détecter.
3. Dans le générateur de filtres avancés, cliquez sur Ajouter; puis, dans la boîte de dialogue Nouvelle contrainte, sélectionnez Rétention II; puis, cliquez sur OK.
4. Dans les curseurs Contrainte, définissez les durées de rétention minimales et maximales ^{de 2D}pour le filtre afin de réduire le nombre de faux pics sans perdre les pics vrais.
5. Cliquez sur Appliquer; ensuite, cliquez sur Oui pour enregistrer dans les paramètres de détection avec le nouveau filtre.
   REMARQUE: Des outils plus avancés peuvent être nécessaires pour faire face à des problèmes de détection particuliers, tels que la détection de pics d’ions ou la déconvolution pour les co-élutions^19.

7. Étalonnage des indices de rétention linéaires

Remarque : effectuez cette étape²² (I^T)pour les temps de rétention spécifiques sur l’ensemble des normes d’index de rétention (RI) (généralement n-alcanes).

1. Sélectionnez Configurer | | de table de l’IR Indice de rétention (Col I).
2. Dans la boîte de dialogue Configuration de la table RI, cliquez sur Importer; ensuite, sélectionnez le fichier d’étalonnage de l’instance réservée (au format CSV avec nom, temps de rétention et index de rétention) nommé « Table LRI.csv » -(Fichier supplémentaire 4).
3. Sélectionner un fichier | Enregistrer l’image A. Accédez au dossier souhaité ; inscrivez le nom « Oil 1 LRI CALIBRATED.gci »(dossier supplémentaire 5); puis, cliquez sur Enregistrer.

8. Recherche des spectres de crête dans la bibliothèque MS NIST17²³

1. Sélectionnez Configurer | Paramètres | Bibliothèque de recherche.
2. Dans la boîte de dialogue Bibliothèque de recherche, définissez Type de spectre sur Pic MS, Seuil d’intensité sur 100, Type de recherche NIST sur Simple (similarité), Type de colonne IR NIST sur Polar standard et Tolérance RI NIST sur 10; puis, cliquez sur OK. NIST MS Search offre de nombreux autres paramètres qui sont définis sur les valeurs par défaut ici.
3. Sélectionner le | de traitement Rechercher dans la bibliothèque tous les objets blob.

9. Examiner et corriger les identifications des analytes

1. Dans la palette d’outils, définissez le mode curseur sur Blob | Sélectionnez Objets blob.
2. Dans la vue Image, cliquez avec le bouton droit sur le pic souhaité.
3. Dans la boîte de dialogue Propriétés de l’objet blob, inspectez les propriétés de l’objet blob ; ensuite, cliquez sur Liste des accès.
4. Inspectez la liste d’accès; ensuite, si l’identification est incorrecte, sélectionnez la coche à côté de l’identification correcte.
5. Dans la boîte de dialogue Propriétés de l’objet blob, entrez le nom du groupe pour désigner la classe chimique et toutes les autres métadonnées souhaitées; puis, cliquez sur OK.
6. Sélectionner un fichier | Enregistrer l’image sous; accédez au dossier souhaité; entrez le nom « Huile 1 COLORISÉE pour le modèle construction.gci » (Fichier supplémentaire 6); puis, cliquez sur Enregistrer.
   Remarque : Ce fichier est inclus dans l’archive supplémentaire, qui peut être ouvert pour l’étape 10.

10. Créer un modèle avec des pics ciblés¹⁵

1. Dans la vue Image (toujours en mode Sélectionner les objets blob de l’étape 9.1), sélectionnez les pics souhaités en cliquant sur le premier pic et CTRL + cliquez sur les pics supplémentaires.
2. Dans la palette d’outils, cliquez sur le bouton Ajouter au modèle.
3. Une fois le modèle terminé, sélectionnez Fichier | Enregistrer le modèle; spécifiez le dossier et le nom du fichier ; puis, cliquez sur Enregistrer.
4. Sélectionner un fichier | Fermer l’image.
   Remarque : à ce stade, ces instructions continuent avec le modèle créé pour inclure les pics cibles souhaités, disponible en tant que « tamplate.bt ciblé » (fichier supplémentaire 7).

11. Faire correspondre et appliquer le modèle

Remarque : correspondance reconnaît le modèle de modèle dans les pics détectés un nouveau chromatogramme. L’application des identifications d’ensembles correspondants et d’autres métadonnées dans le nouveau chromatogramme à partir du modèle.

1. Sélectionner un fichier | Ouvrir l’image; accédez au fichier de chromatogramme « Oil 2 COLORIZED.gci »(Fichier supplémentaire 8)et sélectionnez-le (qui est prétraitoire); puis, cliquez sur Ouvrir.
2. Dans la palette d’outils, définissez le mode curseur sur Modèle | Sélectionnez Objets.
3. Sélectionner un modèle | Charger le modèle.
4. Dans la boîte de dialogue Charger le modèle, cliquez sur Parcourir; accédez au modèle de pics ciblés «template.bt ciblé» et sélectionnez-le(Dossier supplémentaire 7); puis, cliquez sur Ouvrir.
5. Dans la boîte de dialogue Charger le modèle, cliquez sur Charger, puis sur Ignorer.
6. Dans la vue Image, cliquez avec le bouton droit sur un pic de modèle ; ensuite, inspectez ses propriétés d’objet, y compris le qCLIC et la référence MS.
7. Sélectionner un modèle | Modèle interactif de correspondance et de transformation.
8. Dans l’interface Correspondance interactive, cliquez sur Correspondance tout; ensuite, passez en revue les résultats correspondants à la fois dans la table et dans l’image, dans laquelle chaque pic de modèle est marqué avec des cercles non remplis et, si une correspondance est effectuée, il existe un lien vers un cercle rempli pour le pic détecté.
9. Modifiez les correspondances comme vous le souhaitez; Lorsque vous êtes satisfait, cliquez sur Appliquer pour transférer les métadonnées du modèle vers le chromatogramme.
   Remarque : contraintes correspondantes, telles que le qCLIC, permettent de faire correspondre le modèle correct parmi les pics détectés du nouveau chromatogramme. Les paramètres de contrainte incluent le type de signature MS utilisé comme référence de modèle(pic MS ou BLOB MS)et les valeurs de seuil pour la similarité spectrale (Direct Match Factor (DMF) et Reverse Match Factor (RMF)). Ici, les paramètres sont fixés sur la base des études précédentes^13,14 pour limiter les correspondances faussement négatives : pic MS et DMF et seuil de similarité RMF 700.

12. Transformer le gabarit pour une chromatographie sensiblement différente

Remarque : cette étape n’est pas nécessaire, sauf si les conditions chromatographiques varient considérablement, ce qui entraîne le mauvais alignement du gabarit avec un nouveau chromatogramme, comme cela peut être le cas sur des études à long terme ou après l’installation d’une nouvelle colonne. Dans de tels cas, le gabarit peut être géométriquement transformé dans le plan temps de rétention chromatographique pour mieux s’adapter au nouveau chromatogramme^12,13. Dans cet exemple, les modèles de pic du gabarit et du chromatogramme sont similaires, mais diffèrent dans la géométrie des temps de rétention, comme cela serait le cas pour différentes conditions chromatographiques.

1. Répétez les étapes 11.2 à 11.5, sauf accédez à, sélectionnez et chargez le modèle ciblé 2.bt (Fichier supplémentaire 9).
2. Sélectionner un modèle | Modèle de match interactif; cliquez ensuite sur Modifier la transformation.
3. Dans l’interface Transformer le modèle, faites varier les échelles, les traductions et les cisaillements ^1Det ^2Dpour mieux aligner le modèle avec les pics détectés ; ensuite, cliquez sur Transformer le modèle.
4. Avec le modèle transformé, cliquez sur Modifier la correspondance; ensuite, répétez les étapes 11.8 à 11.9.

13. Effectuer une analyse combinée non ciblée et ciblée sur un ensemble de chromatogrammes

REMARQUE : Un modèle combiné non ciblé et ciblé (UT), également appelé modèle d’entité ^24,25,lorsqu’il est mis en correspondance avec chacun d’un ensemble de chromatogrammes, établit des correspondances entre les analytes non ciblés et ciblés, puis des entités d’échantillons croisés cohérentes sont extraites pour la reconnaissance de formes.

1. Effectuer le prétraitement (étapes 1 à 6) et la correspondance de modèle UT (étapes 11.1 à 11.9) pour tous les chromatogrammes de l’ensemble (c.-à-d. chromatogrammes ²D d’huiles). Vous pouvez également automatiser cette étape avec un logiciel de projet ou un logiciel similaire, non décrit ici.
2. Lancez le logiciel Investigator.
3. Sélectionner un fichier | Analyse ouverte; ensuite, sélectionnez et ouvrez « Feature Jove su 70 eV.gca »(Fichier supplémentaire 10).
4. Cliquez sur OK pour ouvrir et examiner les résultats.
5. Cliquez sur l’onglet Composés pour examiner les valeurs métriques et les statistiques pour des analytes spécifiques (c.-à-d. des analytes ciblés avec des noms chimiques associés) ou des analytes non ciblés avec des identificateurs (#) alignés sur tous les chromatogrammes, puis effectuez les étapes ci-dessous.
   1. Cliquez sur l’onglet Attributs pour examiner les valeurs et les statistiques de métriques spécifiques sur les chromatogrammes.
   2. Cliquez sur l’onglet Résumé pour consulter les statistiques récapitulatives des composés et des entités. Si les chromatogrammes proviennent de classes différentes, comme dans ce cas les huiles produites à partir d’olives récoltées dans deux régions différentes de l’Italie, l’onglet Résumé répertorie les statistiques de ratio de Fisher (F et FDR), qui fournissent des informations sur les caractéristiques permettant de distinguer les classes.
   3. Affichez divers graphiques sur tous les onglets et, si vous le souhaitez, effectuez l’analyse en composantes principales (PCA) sous l’onglet Attributs.

14. Modifier le modèle UT pour l’analyse ms parallèle

REMARQUE: L’analyse a été effectuée avec des énergies d’ionisation d’électrons de 70 eV et 12 eV (c’est-à-dire élevées et faibles)^26,27.

1. Ouvrez l’un des 12 chromatogrammes eV, par exemple« Oil 1 12 eV RAW.gci »(fichier supplémentaire 11),effectuez un prétraitement (étapes 1 à 6) et chargez le modèle UT « UT template 70 relaxed.bt »(fichier supplémentaire 12) comme décrit aux étapes 11.1 à 11.6. Les dossiers sont fournis à titre de documents supplémentaires.
2. Si nécessaire, ajustez le gabarit pour l’adapter aux pics de 12 eV détectés, comme décrit à l’étape 12. Ici, il n’y a pas de désalignement significatif car les signaux tandem sont multiplexés. Cependant, il convient de noter que parce que les différents paramètres d’ionisation produisent des fragmentations différentes, il est nécessaire d’assouplir les contraintes pour les contraintes qCLIC sur la similarité spectrale DMF et RMF (non démontrée ici).
3. Sélectionner un fichier | Enregistrer le modèle; préciser le dossier et le nom du fichier, p. ex., « modèle UT 12.bt »(dossier supplémentaire 13); puis, cliquez sur Enregistrer.

15. Effectuer une analyse combinée non ciblée et ciblée sur 12 chromatogrammes eV

1. Sélectionner un fichier | Analyse ouverte; puis sélectionnez et ouvrez « Feature Jove su 12 eV.gca » - Fichier supplémentaire 14 fourni.
2. Cliquez sur OK pour ouvrir et examiner les résultats.
3. Cliquez sur l’onglet Composés pour examiner les valeurs métriques, reportez-vous aux réponses et aux statistiques de 12 eV pour des analytes spécifiques (c.-à-d. des analytes ciblés avec des noms chimiques associés) ou des analytes non ciblés avec des identificateurs (#) alignés sur tous les chromatogrammes, puis effectuez les étapes ci-dessous.
   1. Cliquez sur l’onglet Attributs pour examiner les valeurs et les statistiques de métriques spécifiques sur les chromatogrammes.
   2. Cliquez sur l’onglet Résumé pour consulter les statistiques récapitulatives pour les composés et les caractéristiques à 12 eV. Si les chromatogrammes proviennent de classes différentes, comme dans ce cas les huiles produites à partir d’olives récoltées dans deux régions différentes de l’Italie, l’onglet Résumé répertorie les statistiques de ratio de Fisher (F et FDR), qui fournissent des informations sur les caractéristiques permettant de distinguer les classes.
   3. Affichez les différents graphiques disponibles dans tous les onglets et, si vous le souhaitez, effectuez l’analyse en composantes principales (PCA) sous l’onglet Attributs.

Résultats

Les modèles GC×GC-TOF MS de volatilome extra vierge d’huile d’olive de haute qualité présentent environ 500 ^{pics 2}D au-dessus d’un seuil de rapport signal sur bruit (SNR) de 100. Un tel seuil a été défini par des études antérieures sur les volatils alimentaires^14,27 comme le signal relatif minimal au-dessus du seuil pour obtenir des spectres fiables pour l’analyse comparative croisée. Les composants sont répartis sur l’espace chromatographique en fonction de leur rétention relative dans les deux dimensions chromatographiques, et spécifiquement en fonction de leur volatilité/polarité dans le ¹D et de leur volatilité dans le ^2D. Ici, la combinaison de colonnes est polaire × semi-polaire (c’est-à-dire Carbowax 20M × OV1701).

Le modèle ^2Dmontre un degré élevé d’ordre. Les profils de rétention relatifs pour les séries et les classes homologues sont présentés à la figure 1A avec des annotations (graphiques pour les groupes et bulles pour les pics) pour les hydrocarbures saturés linéaires (noir), les hydrocarbures insaturés (jaune), les aldéhydes saturés linéaires (bleu), les aldéhydes mono-insaturés (rouges), les aldéhydes polyinsaturés (saumon), les alcools primaires (verts) et les acides gras à chaîne courte (cyano).

Les pics ²D détectés peuvent ensuite être identifiés en comparant le spectre MS moyen extrait de l’ensemble du pic ^2D(spectreblob) ou du plus grand spectre (spectreapex). La figure 2 illustre la sortie de la recherche de spectre apex pour le blob 5 et renvoie une correspondance de similarité élevée (10 premiers résultats) pour (E)-2-hexenal. Les bases de données explorées sont celles présélectionn sélectionnées par l’analyste à l’étape 8 de la méthode.

L’identification est validée par l’indexation de rétention active. La valeur expérimentale I^T a été calculée pour les pics ²D, de sorte qu’à ce stade, la recherche dans la bibliothèque donne la priorité aux résultats avec des valeurs cohérentes de I^Ttabulé. Les fenêtres de tolérance peuvent être personnalisées en fonction de l’expérience de l’analyste, de la fiabilité des valeurs de la base de données de référence en fonction de la phase stationnaire et des conditions analytiques appliquées. De nouveaux outils pour l’étalonnage intelligent des indices de rétention linéaire sans étalonnage expérimental avec n-alcanes, ont été récemment développés et discutés dans une étude de Reichenbach et al^19.

La collecte des pics ^2Didentifiés (c’est-à-dire des pics ciblés) peut être adoptée pour construire un modèle de pics ciblés afin d’établir rapidement des correspondances fiables entre le même composé dans tous les chromatogrammes d’échantillon. La collection de pics de modèle ciblés est visualisée à la figure 1B. Les cercles rouges correspondent aux 196 composés ciblés, y compris deux normes internes (IS) liées à des pics de gabarit avec des lignes de connexion. Les SI sont utilisés pour la normalisation de la réponse et les lignes de connexion aident à visualiser lequel des SI inclus sera adopté pour normaliser chaque réponse de crête/blob ^{de 2D.}

Dans la figure 1B, lescercles remplis indiquent des correspondances positives entre le pic du modèle et le modèle réel, tandis que les cercles vides sont pour les pics du modèle pour lesquels la correspondance n’a pas été vérifiée. Les correspondances faussement négatives peuvent être limitées par une sélection appropriée des paramètres de seuil, des spectres de référence et des fonctions de contrainte^13,14,18,19. Pour les motifs complexes avec plusieurs co-élutions, les fonctions de détection de pics d’ions basées sur la déconvolution spectrale sont conseillées et pourraient être une option valide¹⁹. Les métadonnées de pic du modèle sont affichées dans le panneau agrandi de la figure 1B pour (E) - 2-hexenal.

La spécificité de l’appariement de modèle repose sur la possibilité d’appliquer des fonctions de contrainte qui limitent la correspondance positive aux pics candidats qui, relevant de la fenêtre de recherche de l’algorithme, ont une similarité spectrale MS au-dessus d’un certain seuil. Dans ce cas, à l’étape 11, les seuils de similarité²³ ont été fixés à 700 selon des expériences précédentes visant à définir des paramètres optimaux limitant les correspondances faussement négatives^14. Les zones en surbrillance des propriétés de pic du modèle dans la figure 1B affichent les informations sur la chaîne de spectre MS de référence et la fonction de contrainte qCLIC (c’est-à-dire (Match(« 

En appliquant le modèle à tous les chromatogrammes d’un ensemble, on pourrait rencontrer des situations difficiles comme dans le cas d’un désalignement partiel des motifs. Cela peut être dû à des incohérences de température du four, à des instabilités de débit/pression de gaz porteur, ou à une intervention manuelle sur le système comme dans le cas de la substitution de colonne ou du remplacement capillaire de la boucle du modulateur^14,28. La figure 3 montre une situation de désalignement partiel entre le gabarit ciblé et le chromatogramme réel. Pour un minimum de désalignements, les transformations de modèle interactives(Figure 3,panneau de configuration) peuvent repositionner les pics de modèle pour un meilleur ajustement. Une fois repositionné, le modèle peut être apparié pour établir des correspondances. Dans l’exemple, les pics du modèle(Figure 3,étape 12) correspondent correctement au modèle ^2Dréel. En cas de désalignements graves, non discutés ici, la répétition des actions match-transform-update peut adapter de manière itérative la position des pics du modèle au modèle de pic réel^12,13,14.

Ici, les pics ciblés (c.-à-d. les analytes connus) fournissent environ 40 % du résultat chromatographique (196 pics ciblés d’environ 500 pics détectables en moyenne). Les 60 % restants de composés, ainsi que les informations qu’ils apportent, ne sont pas pris en considération dans l’analyse ciblée. Pour que l’enquête soit vraiment exhaustive, il faudrait également établir un alignement croisé cohérent des pics ^2Dnon ciblés. La première application où l’appariement des gabarits a été étendue à tous les analytes détectables portait sur le volatilome complexe du café torréfié^7. Ce processus est automatisé à l’avec un logiciel (p. ex., Investigator), illustré ici aux étapes 14 à 15.

Dans ce processus, des images pré-ciblées appartenant à l’ensemble d’échantillons à l’étude (20 échantillons) sont utilisées pour définir des pics fiables par correspondance croisée de tous les modèles d’image^29. Par la suite, un chromatogramme composite est construit à partir duquel on peut identifier les pics et les régions de pics fiables UT (c’est-à-dire l’empreinte des pics ²D) dans le modèle d’entité^17.

Pour les analyses acquises à 70 eV, le procédé a déterminé 144 pics fiables avec une fiabilité détendue^{dont 29,}dont 76 appartiennent à la liste des pics ciblés. Sur la base de ces 144 pics fiables, le processus aligne tous les chromatogrammes de manière cohérente avec les temps de rétention moyens des pics fiables, puis les combine pour créer un chromatogramme composite. La figure 4 montre une liste de tous les échantillons étiquetés en fonction de la région de production de l’huile (à gauche) et la liste des pics/volumes de gouttes fiables dans chaque échantillon (à droite).

Le modèle d’entité non ciblée est composé de pics ^2Dà partir d’analytes détectés dans le chromatogramme composite, illustré à la figure 5A,qui sont appariés par le modèle de pics fiables (n = 168 – cercles rouges pour les pics ciblés et cercles verts pour les pics non ciblés). Les spectres de masse des pics composites, ainsi que leurs temps derétention, sont enregistrés dans le modèle de caractéristiques comme indiqué pour l’acétate de (Z)-3-hexenol dans la zone agrandie. Les régions de pointe sont représentées à la figure 5B sous forme de graphiques de couleur rouge ; ils sont plutôt définis par les contours de tous les pics ²D détectés dans le chromatogramme composite (n = 3578).

Lorsque la reconnaissance non supervisée des formes par l’analyse en composantes principales est appliquée à la distribution des pics ciblés dans les 20 échantillons analysés, les huiles siciliennes et toscanes se regroupent séparément, ce qui suggère que les conditions pédoclimatiques et le terroir ont un impact sur la prévalence relative des volatils. Les résultats sont présentés à la figure 6A et les résultats de l’APC de la distribution fiable des pics sont présentés à la figure 6B. Les deux approches recoupent le fait que les huiles provenant de différentes zones géographiques ont des signatures chimiques différentes, tandis que cohérentes, que les composés ciblés ou non ciblés, ou les deux, soient cartographiés.

Enfin, le logiciel permet un réalignement rapide et efficace des modèles sur des canaux de détection parallèles. Dans cette demande, le réalignement est proposé pour les signaux d’ionisation en tandem. La source d’ions des multiplexes MS entre deux énergies d’ionisation (c’est-à-dire 70 et 12 eV) à une fréquence d’acquisition de 50 Hz par canal^30. Les deux modèles chromatographiques résultants sont étroitement alignés tandis que les données spectrales (c’est-à-dire les signatures spectrales et les réponses) apportent des informations complémentaires avec différentes plages dynamiques de réponse^26,27. Les modèles alignés permettent d’extraire des entités (pics et régions de pics^2D)avec des ID univoques (c’est-à-dire des noms chimiques pour les pics ciblés et un numéro unique pour les pics et les régions de pic non ciblés).

La correspondance de modèle permet un alignement croisé efficace. Dans cette situation, il n’y a pas beaucoup de désalignement, mais les contraintes MS doivent être assouplies pour permettre des correspondances pour les pics UT. D’autre part, les régions de pointe UT en vedette, qui n’ont aucune contrainte MS, sont rapidement appariées sans aucune correspondance faussement négative. La figure 5C montre une zone agrandie d’un chromatogramme de 12 eV où le modèle d’entité construit à partir de données de 70 eV est apparié. Les pics UT fiables sont appariés positivement en raison des contraintes qCLIC abaissées (par exemple, seuil DMF à 600). À noter qu’à 12 eV, il y a moins de pics détectés en raison de la fragmentation limitée induite par une faible énergie d’ionisation.

Figure 1 : Diagramme de contour bidimensionnel et gabarit ciblé. (A) Contour de la fraction volatile d’une huile d’olive extra vierge de Toscane. Les modèles ordonnés de séries et de classes d’homologues sont mis en évidence avec différentes couleurs et lignes: hydrocarbures saturés linéaires (ligne noire et contours ²D), hydrocarbures insaturés (jaune), aldéhydes saturés linéaires (bleu), aldéhydes mono-insaturés (rouge), aldéhydes polyinsaturés (saumon), alcools primaires (vert) et acides gras à chaîne courte (cyano). (B) Modèle ciblé surimposé d’analytes connus (cercles de couleur rouge) avec des lignes de connexion reliant les normes internes (SI). Les panneaux affichent les métadonnées des propriétés de crête/blob ^2D(Decanal) ou les propriétés de pic de modèle. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2 : Recherche Apex MS. Sortie de l’apex MS search for blob 5. Liste des entrées de base de données avec la correspondance de similarité la plus élevée et des métadonnées associées disponibles dans la bibliothèque. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3 : Réalignement du modèle. Workflow illustrant les étapes qui permettent de ré-alignement du modèle par transformation. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4 : Interface de l’enquêteur du GC. Panel investigateur avec toutes les images sélectionnées étiquetées en fonction de la région de production de l’huile (à gauche) et la liste des pics / volumes de blob fiables dans chaque échantillon (à droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5 : Modèle ciblé et UT. A)des pics fiables résultant du traitement automatisé à l’étape 11; les cercles rouges correspondent aux analytes connus tandis que les cercles verts sont inconnus. Dans le panneau superposé, les propriétés de l’objet modèle sont affichées pour le (Z)-3-hexenal. (B) Zone agrandie qui montre les pics UT (cercles rouges et verts) et les régions de pic (graphiques rouges) du gabarit UT appariés sur un échantillon d’huile acquis à une énergie d’ionisation de 70 eV. (C) modèle UT apparié sur un échantillon d’huile acquis à 12 eV d’énergie d’ionisation. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6 : Placettes de chargement de l’APC. Ils montrent la conformation naturelle des échantillons (huiles de Toscane et de Sicile) comme ils résultent par (A) distribution des pics ciblés ou (B) distribution des pics UT. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

La visualisation des données gc×GC-TOF ms est une étape fondamentale pour une compréhension appropriée des résultats obtenus par des séparations bidimensionnelles complètes. Les tracés d’images avec colorisation personnalisée permettent aux analystes d’apprécier les différences de réponse des détecteurs et donc la distribution différentielle des composants de l’échantillon. Cette approche visuelle change complètement le point de vue des analystes sur l’interprétation et l’élaboration des chromatogrammes. Cette première étape, une fois comprise et utilisée avec confiance par les chromatographes, ouvre une nouvelle perspective dans la poursuite du traitement.

Un autre aspect fondamental du traitement des données est l’accessibilité à la matrice de données complète (c.-à-d. les données spectrales et les réponses ms) pour tous les points d’échantillonnage, chacun d’eux correspondant à un seul événement de détecteur. A cet ^{égard, 2}D pics d’intégration, de sorte que la collecte des événements de détecteur correspondant à un seul analyte représente une étape critique. Dans le protocole actuel, la détection des pics ²D est basée sur l’algorithme de bassin versant¹⁸ avec quelques adaptations incluses pour améliorer la sensibilité de détection en cas de composés de co-élution partielle. Pour rendre ce processus plus spécifique, il faut procéder à la déconvolution et adopter des procédures plus sophistiquées. Ceci est possible en effectuant une détection de pic d’ions pour les données MS; l’algorithme traite le tableau de données et isole la réponse à partir d’analytes simples en fonction des profils spectraux^19,31.

Une étape importante mais critique du protocole, et de tout processus d’interprétation des données GC×GC-MS, concerne l’identification des analytes. Cette procédure, proposée aux étapes 8 et 9, en l’absence d’une analyse de confirmation avec des normes authentiques, doit être menée avec soin par l’analyste. Des actions automatisées sont disponibles dans n’importe quel logiciel commercial; ils comprennent l’évaluation de la similarité des signatures spectrales MS par rapport aux spectres de référence collectés (c’est-à-dire les bibliothèques spectrales) et l’évaluation des rapports caractéristiques entre les ions qualificatifs/quantificateurs. Cependant, des critères de confirmation supplémentaires sont nécessaires pour lever l’ambiguïté de l’identification des isomères. Le protocole propose l’adoption d’indices de rétention linéaires pour hiérarchiser la liste des candidats; la limite ici concerne la disponibilité des données de conservation et leur cohérence.

La principale caractéristique qui rend cette approche unique est la correspondance de modèle^12,13,15,29. La correspondance de modèles permet la reconnaissance de formes ^2Dde manière très efficace, spécifique et intuitive. Il peut être défini, en termes de sensibilité et de spécificité, en appliquant des valeurs de seuil personnalisées et/ou des fonctions de contrainte tandis que l’analyste peut superviser la procédure en interagissant activement avec les paramètres de la fonction de transformation. La particularité de ce procédé repose sur la possibilité de croiser les informations de pics ciblés et non ciblés entre les échantillons d’un lot uniforme mais aussi entre les échantillons acquis dans les mêmes conditions nominales malgré un désalignement moyen à grave. Les avantages de cette opération sont liés à la possibilité de préserver toutes les identifications d’analytes ciblés, ce qui est une tâche fastidieuse pour l’analyste, et toutes les métadonnées enregistrées pour les pics ciblés et non ciblés des sessions d’élaboration précédentes.

La correspondance de modèle est également très efficace en termes de temps de calcul; les fichiers de données MS basse résolution se composent d’environ 1 à 2 Go de données compressées, tandis que les analyses MS haute résolution peuvent atteindre 10 à 15 Go par seule exécution analytique. La correspondance de modèle ne traite pas la matrice de données complète à chaque fois mais, dans un premier temps, effectue l’alignement du temps de rétention entre les chromatogrammes à l’aide de pics de modèle, puis traite les pics candidats dans la fenêtre de recherche pour leur correspondance de similarité avec la référence dans le modèle. En cas de désalignement grave, la situation la plus difficile, les transformations polynomiales globales du second ordre ont été plus performantes que les méthodes locales tout en réduisant le temps de calcul^13.

Pour que la technique GC×GC se répande largement au-delà du milieu universitaire et des laboratoires de recherche, les outils de traitement des données doivent faciliter les opérations de base pour la visualisation et l’inspection des chromatogrammes; l’identification des analytes devrait offrir la possibilité d’adopter des algorithmes et des procédures normalisés (p. ex., l’algorithme de recherche NIST et l’étalonnage I^T); et l’analyse comparative croisée devrait être intuitive, efficace et appuyée par des outils interactifs. L’approche proposée répond à ces besoins tout en offrant des options et des outils avancés pour faire face à des situations complexes telles que la co-élution des analytes, l’étalonnage de plusieurs analytes, l’analyse de type groupe et l’alignement de détection parallèle.

La littérature référencée couvre bien de nombreux scénarios possibles où gc×GC et, plus généralement, chromatographie bidimensionnelle complète, offrent des solutions uniques et des résultats fiables qui ne peuvent pas être obtenus par ¹D-chromatographie en une seule fois. ^5,32,33 Bien que le GC×GC soit l’outil le plus puissant qui augmente la capacité de séparation et la sensibilité, il y a toujours des limites au pouvoir de séparation, à la sensibilité et à d’autres capacités systémiques. À mesure que ces limites systémiques sont approchées, l’analyse des données devient de plus en plus difficile. Par conséquent, la recherche et le développement doivent continuer à améliorer les outils d’analyse à notre disposition.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Colonne 1D SolGel-Wax (100 % polyéthylène glycol ; 30 m & times ; 0,25 mm dc & times ; 0,25 &mu ; m df). Hélium gazeux porteur à un débit nominal constant de 1,3 mL/min.	Trajan SGE Analytical Science, Ringwood, Australie	PN 054796	Hélium gazeux porteur à un débit nominal constant de 1,3 mL/min. Programmation de la température du four réglée comme suit : 40° ; C (2 min) à 240° ; C (10 min) à 3,5° ; C/min.
Colonne 2D OV1701 (86 % polydiméthylsiloxane, 7 % phényle, 7 % cyanopropyle ; 1 m & times ; 0,1 mm dc & times ; 0,10 &mu ; m df) à partir de .	Mega, Legnano, Milan, Italie	PN MEGA-1701
Système automatisé pour la préparation d’échantillons : SPR Échantillonneur automatique pour GC	SepSolve-Analytical, Llantrisant, Royaume-Uni
Huiles d’olive extra vierges : Sicile et Toscane, Italie	Projet VIOLIN (Ager - Fondazioni in rete per la ricerca agroalimentare)		Des échantillons (n=10) ont été collectés au cours de l’année de production 2018 dans le cadre de la campagne d’échantillonnage du projet « Violon ». Les huiles ont été soumises à HS-SPME pour échantillonner les substances volatiles selon un protocole de référence validé dans une étude précédente de Stilo et al.14
Chromatographe en phase gazeuse : Modèle 7890B GC	Agilent Technologies Wilmington DE, USA
GC Image GC× ; GC edition V 2.9	GC Image LLC, Lincoln, Nebraska		https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html
Logiciel de traitement d’images	GC Image LLC, Lincoln, Nebraska		https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html
Spectromètre de masse : BenchTOF-Select	Markes International Llantrisant, Royaume-Uni
Methyl-2-octynoate (CAS 111-12-6)	Merck-Millipore/Supelco	Réf : 68982
Contrôleur de modulateur : Optimode v2.0	SRA Intruments, Cernusco sul Naviglio, Milan, Italie
Modulateur : KT 2004 type de boucle	Zoex Corporation Houston, TX, États-Unis Bibliothèque
recherche : NIST Library V 2017, Software V 2.3	National Institute of Standards and Technology (NIST), Gaithersburg MD		https://www.nist.gov/srd/nist-standard-reference-database-1a-v17
n-alcanes C8-C40 pour l’indexation de rétention	Merck-Millipore/Supelco	PN : 40147-U
n-hexane (CAS 110-54-3) Chromatographie en phase gazeuse MS SupraSolv	Merck-Millipore/Supelco	PN : 100795
Fibre de microextraction en phase solide	Merck-Millipore/Supelco	PN 57914-U
&alpha ;- /&beta ;-thuyone (CAS 546-80-5)	Merck-Millipore/Sigma Aldrich	Réf : 04314