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Article de méthode

Isolement et enrichissement des cellules progénitrices épithéliales pulmonaires humaines pour la culture organoïde

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DOI :

10.3791/61541

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21 juillet 2020

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1Lung and Regenerative Medicine Institutes, Department of Medicine, Cedars-Sinai Medical Center

Dans cet article

Résumé

Cet article fournit une méthodologie détaillée pour les approches de dissociation tissulaire et de fractionnement cellulaire permettant l’enrichissement de cellules épithéliales viables à partir de régions proximales et distales du poumon humain. Ici, ces approches sont appliquées pour l’analyse fonctionnelle des cellules progénitrices épithéliales pulmonaires grâce à l’utilisation de modèles de culture d’organoïdes 3D.

Résumé

Les modèles organoïdes épithéliaux sont des outils précieux pour étudier la biologie fondamentale d’un système d’organes et pour la modélisation de la maladie. Lorsqu’elles sont cultivées sous forme d’organoïdes, les cellules progénitrices épithéliales peuvent s’auto-renouveler et générer une progéniture différenciante qui présente des fonctions cellulaires similaires à celles de leurs homologues in vivo . Nous décrivons ici un protocole étape par étape pour isoler les progéniteurs spécifiques à une région du poumon humain et générer des cultures organoïdes 3D en tant qu’outil expérimental et de validation. Nous définissons les régions proximales et distales du poumon dans le but d’isoler les cellules progénitrices spécifiques à la région. Nous avons utilisé une combinaison de dissociation enzymatique et mécanique pour isoler les cellules totales du poumon et de la trachée. Des cellules progénitrices spécifiques ont ensuite été fractionnées à partir des cellules d’origine proximale ou distale à l’aide du tri cellulaire associé à la fluorescence (FACS) basé sur des marqueurs de surface spécifiques au type cellulaire, tels que le NGFR pour le tri des cellules basales et LE HTII-280 pour le tri des cellules alvéolaires de type II. Des progéniteurs isolés basaux ou alvéolaires de type II ont été utilisés pour générer des cultures organoïdes 3D. Les progéniteurs distaux et proximaux ont formé des organoïdes avec une efficacité de formation de colonies de 9 à 13% dans la région distale et de 7 à 10% dans la région proximale lorsqu’ils sont plaqués 5000 cellules / puits au jour 30. Les organoïdes distaux ont maintenu en culture des cellules alvéolaires HTII-280+ de type II, tandis que les organoïdes proximaux se sont différenciés en cellules ciliées et sécrétoires au jour 30. Ces cultures organoïdes 3D peuvent être utilisées comme outil expérimental pour étudier la biologie cellulaire de l’épithélium pulmonaire et les interactions mésenchymateuses épithéliales, ainsi que pour le développement et la validation de stratégies thérapeutiques ciblant le dysfonctionnement épithélial dans une maladie.

Introduction

Les espaces aériens du système respiratoire humain peuvent être largement divisés en zones conductrices et respiratoires qui interviennent dans le transport des gaz et leur échange ultérieur à travers la barrière épithéliale-microvasculaire, respectivement. Les voies respiratoires conductrices comprennent la trachée, les bronches, les bronchioles et les bronchioles terminales, tandis que les espaces respiratoires comprennent les bronchioles respiratoires, les canaux alvéolaires et les alvéoles. La muqueuse épithéliale de ces espaces aériens change de composition le long de l’axe proximo-distal pour répondre aux exigences uniques de chaque zone fonctionnellement distincte. L’épithélium pseudostratifié des voies respiratoires trachéo-bronchiques est composé de trois principaux types de cellules, basale, sécrétoire et ciliée, en plus des types cellulaires moins abondants, y compris la brosse, le neuroendocrinien et l’ionocyte 1,2,3. Les voies respiratoires bronchiolaires abritent des types de cellules épithéliales morphologiquement similaires, bien qu’il existe des distinctions dans leur abondance et leurs propriétés fonctionnelles. Par exemple, les cellules basales sont moins abondantes dans les voies respiratoires bronchiolaires, et les cellules sécrétoires comprennent une plus grande proportion de cellules club par rapport aux cellules séreuses et gobelet qui prédominent dans les voies respiratoires trachéo-bronchiques.  Les cellules épithéliales de la zone respiratoire comprennent un type de cellules cuboïdes mal défini dans les bronchioles respiratoires, en plus des cellules alvéolaires de type I (ATI) et de type II (ATII) des canaux alvéolaires et des alvéoles 1,4.

L’identité des types de cellules souches épithéliales et progénitrices qui contribuent au maintien et au renouvellement des épithéliums dans chaque zone est incomplètement décrite et largement déduite des études sur des modèles animaux 5,6,7,8. Des études chez la souris ont montré que les cellules basales des voies respiratoires pseudostratifiées, ou les cellules club des voies respiratoires bronchiolaires ou les cellules ATII de l’épithélium alvéolaire, servent de cellules souches épithéliales en fonction de la capacité d’auto-renouvellement illimité et de différenciation multipotente 7,9,10,11,12 . Malgré l’incapacité d’effectuer des études de traçage génétique de la lignée pour évaluer la souche des types de cellules épithéliales pulmonaires humaines, la disponibilité de modèles de culture organoïdes pour évaluer le potentiel fonctionnel des cellules souches épithéliales et progénitrices fournit un outil pour des études comparatives entre la souris et l’homme 13,14,15,16,17.

Nous décrivons des méthodes pour isoler les types de cellules épithéliales de différentes régions du poumon humain et leur culture en utilisant un système organoïde 3D pour récapituler les types de cellules régionales. Des méthodes similaires ont été développées pour l’analyse fonctionnelle et la modélisation de la maladie des cellules épithéliales d’autres systèmes d’organes 18,19,20,21. Ces méthodes fournissent une plate-forme pour l’identification des cellules progénitrices épithéliales régionales, pour effectuer des études mécanistes sur leur régulation et leur microenvironnement, et pour permettre la modélisation de la maladie et la découverte de médicaments. Même si les études sur les cellules progénitrices épithéliales pulmonaires réalisées dans des modèles animaux peuvent bénéficier de l’analyse, in vivo ou in vitro, les connaissances sur l’identité des cellules progénitrices épithéliales pulmonaires humaines ont été largement dépendantes de l’extrapolation à partir d’organismes modèles. En tant que telles, ces méthodes fournissent un pont pour relier l’identité et le comportement des types de cellules épithéliales pulmonaires humaines avec leurs études portant sur la régulation des cellules souches / progénitrices.

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Protocole

Le tissu pulmonaire humain a été obtenu auprès de donneurs de tissus décédés conformément aux procédures de consentement élaborées par l’Institut international pour l’avancement de la médecine (IIAM) et approuvées par le Conseil d’examen interne du Centre médical Cedars-Sinaï.

1. Traitement des tissus pour l’isolement des cellules pulmonaires des régions trachéo-bronchiques ou des petites voies respiratoires/parenchymateuses (petites voies respiratoires et alvéoles)

  1. Préparez et autoclavez tous les instruments de dissection, la verrerie et les solutions appropriées un jour avant l’isolement cellulaire.
  2. Lors de la réception de tissu pulmonaire, identifiez et séparez les régions proximale et distale. La trachée et les bronches sont considérées comme « proximales ». Aux fins de ce protocole, la trachée et les 2-3 premières générations de bronches sont disectées et utilisées pour l’isolement de l’épithélium « proximal » des voies respiratoires. Les petites voies respiratoires de 2 mm ou moins de diamètre et le tissu parenchymateux environnant sont, aux fins du présent protocole, considérés comme un épithélium pulmonaire « distal » (figure 1A).
    REMARQUE: Toutes les procédures impliquant le traitement du tissu pulmonaire humain doivent être effectuées dans une armoire de biosécurité avec l’utilisation de l’équipement de protection individuelle approprié.

2. Enrichissement et sous-réglage des petites voies respiratoires et des cellules progénitrices épithéliales alvéolaires du tissu pulmonaire distal

  1. Préparation des tissus distaux
    1. Placez le tissu pulmonaire distal dans une boîte de Petri stérile (150 x 15 mm). Découpez le tissu en environ 1 cm3 morceaux et placez-le dans un tube propre de 50 mL.
    2. Lavez le tissu 3x avec du HBSS réfrigéré, en jetant le lavage HBSS à chaque fois pour éliminer le sang et le liquide de la muqueuse épithéliale.
    3. Placez le tissu dans une nouvelle boîte de Petri et épongez-le avec des lingettes anti-peluches stériles. À l’aide de pinces et de ciseaux, retirez autant de plèvre viscérale (une membrane transparente délicate qui recouvre la surface du poumon) que possible.
    4. Utilisez des ciseaux pour hacher les tissus en morceaux d’environ 2 mm de diamètre. Transférer le tissu haché dans une boîte de Petri propre et hacher davantage en le coupant à une taille approximative de 1 mm avec une lame de rasoir stérile simple face.
  2. Digestion enzymatique
    REMARQUE: La solution mère de liberase est de 5 mg / mL (100x) et la souche de DNase est de 2,5 mg / mL (100x) (table des matériaux).
    1. Ajouter 50 μg/mL de liberase et 25 μg/mL de DNase dans du HBSS stérile dans un tube conique de 50 mL.
    2. Transférer environ 2 à 3 g de tissu haché dans un nouveau tube conique de 50 mL contenant 25 mL de HBSS, contenant de la libérase et de la DNase. Incuber pendant 40-60 min à 37 °C en agitant en continu à l’aide d’un mélangeur réglé à 900 tr/min. Après 30 min d’incubation, triturer les tissus digérés à l’aide d’une seringue de 30 mL sans aiguille pour éviter la formation d’amas et poursuivre l’incubation.
      REMARQUE: Le temps d’incubation avec les enzymes peut varier en fonction du type ou de l’état du tissu. Par exemple, la digestion enzymatique des tissus normaux prend environ 45 minutes. Cependant, le tissu fibrotique provenant d’échantillons de fibrose pulmonaire idiopathique peut nécessiter un temps d’incubation plus long allant jusqu’à 60 minutes. Par conséquent, surveillez attentivement les tissus pendant cette étape pour éviter d’endommager les marqueurs de surface, ce qui est crucial pour FACS.
  3. Isolation d’une seule cellule
    1. Triturez le tissu en tirant 5x à travers une aiguille de 16 G montée sur une seringue de 30 mL. Aspirer la suspension tissulaire dans une pipette à large alésage et passer à travers une série de crépines cellulaires (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm) sous pression sous vide. Lavez la passoire avec 20 mL de tampon HBSS+ pour recueillir les cellules restantes. La recette du tampon HBSS+ se trouve dans le tableau des matériaux.
    2. Ajouter un volume égal de tampon HBSS+, après 45 min au filtrat pour inhiber l’activité de la liberase et éviter une digestion excessive.
    3. Centrifugeuse filtre à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez et jetez soigneusement le surnageant. Ajouter 1 mL de tampon de lyse des globules rouges (GLOBULES ROUGES) à la pastille, bercer doucement le tube pour déloger la pastille et incuber sur de la glace pendant 1 min.
      REMARQUE: La quantité et le temps dans la solution de lyse RBC dépendent de la taille de la pastille. Il est important de maintenir les cellules sur la glace et de surveiller soigneusement le temps passé dans la solution de lyse des globules rouges afin d’éviter la lyse des cellules cibles. Si la lyse des globules rouges est insuffisante, répétez l’étape.
    4. Ajouter 10 à 20 mL de tampon HBSS+ pour neutraliser le tampon de lyse RBC. Centrifugeuse filtre à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
    5. Si les globules rouges lysés (cellules fantômes) forment une couche trouble au-dessus de la pastille cellulaire, remettez en suspension la pastille dans 10 mL de tampon HBSS+ et filtrez la suspension à travers une passoire cellulaire de 70 μm pour éliminer les cellules fantômes. Centrifuger le filtrat à 500 x g pendant 5 min à 4 °C et procéder à d’autres étapes.
  4. Épuisement des cellules immunitaires et des cellules endothéliales (étape facultative)
    1. Épuiser les cellules endothéliales CD31+ et les cellules immunitaires CD45+ du pool de cellules totales à l’aide des microbilles CD31 et CD45 conjuguées aux anticorps monoclonal anti-humains CD31 et CD45 (isotype souris IgG1) et aux colonnes LS conformément au protocole du fabricant (Table des matériaux).
    2. Recueillir le flux, composé principalement de cellules épithéliales et stromales, dans un tube stérile frais et le centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Effectuez un comptage de cellules pour déterminer le nombre total de cellules dans le flux traversant.
  5. Coloration de la surface cellulaire pour le tri cellulaire associé à la fluorescence (FACS)
    1. Remettez en suspension 1 x 107 cellules par 1 mL de tampon HBSS+. Ajouter les anticorps primaires à la concentration requise et incuber les cellules pendant 30 min à 4 °C dans l’obscurité. Dans cette étude, des anticorps primaires conjugués au fluorophore ont été utilisés, sauf indication contraire. Les détails des sources d’anticorps et des titres sont décrits dans le Tableau des matériaux.
      REMARQUE: HTII-280 est actuellement le meilleur anticorps réactif de surface qui permet le sous-réglage des cellules pulmonaires distales en fractions cellulaires principalement des voies respiratoires (HTII-280-) et alvéolaires de type 2 (HTII-280+). Une mise en garde à cette stratégie est que les cellules AT1 ne sont pas colorées à l’aide de cette méthode et sont mal représentées en raison de leur fragilité. Cependant, les cellules AT1 sont mal représentées dans les préparations pulmonaires distales, probablement en raison de leur fragilité et de leur perte lors de la sélection de cellules viables par FACS et ne représentent donc qu’un contaminant rare de la fraction cellulaire des voies respiratoires.
    2. Lavez les cellules en ajoutant 3 mL de tampon HBSS+ et centrifugez à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
    3. Si vous utilisez des anticorps primaires non conjugués, ajouter la concentration requise d’un anticorps secondaire conjugué au fluorophore approprié et incuber pendant 30 min sur de la glace. Laver l’excès d’anticorps secondaires en ajoutant 3 mL de tampon HBSS+ et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
    4. Jetez les cellules surnageantes et resuspendez dans le tampon HBSS+ par 1 x 107 cellules / mL. Filtrer les cellules dans des tubes de polystyrène de 5 mL à travers un capuchon de crépine pour assurer la formation d’une suspension à cellule unique. Ajouter le DAPI (1 μg/mL) aux cellules perméables (mortes) colorantes.
      REMARQUE: Il est essentiel d’utiliser des témoins appropriés d’une seule couleur et de fluorescence moins un (FMO) (c.-à-d. cocktail de coloration d’anticorps moins un anticorps chacun), afin de minimiser les faux positifs pendant le FACS. Dans cette étude, des billes de sélection positives et négatives ont été utilisées pour compenser empiriquement le chevauchement des spectres d’émission entre les fluorophores (Table des matériaux). FACS enrichir les types de cellules d’intérêt. Les cellules épithéliales viables sont enrichies en fonction de leur phénotype de surface cellulaire CD45 négatif, CD31 négatif, CD236 positif et de la coloration négative pour DAPI. Cette fraction de cellules épithéliales peut être sous-définie en fonction de la coloration pour les marqueurs de surface spécifiques au type de cellule, tels que la coloration spécifique pour les cellules HTII-280 positives qui sont enrichies pour les cellules AT2. En revanche, la sélection négative pour HTII-280 permet l’enrichissement de petites cellules épithéliales des voies respiratoires telles que les cellules club et ciliées (Figure 2).

3. Enrichissement et sous-réglage des cellules progénitrices épithéliales des voies respiratoires trachéo-bronchiques

  1. Préparation des tissus
    1. Disséquer les voies respiratoires proximales (trachée/bronches) des poumons. Ouvrez les voies respiratoires sur toute leur longueur à l’aide de ciseaux pour exposer la lumière et ajoutez 50 μg / mL de libérase pour couvrir complètement le tissu.
    2. Incuber pendant 20 min à 37 °C en secouant en continu à l’aide d’un thermo mélangeur réglé à 900 tr/min.
    3. Retirez les voies respiratoires proximales du tube de centrifugeuse et placez-les dans une boîte de Petri stérile (150 x 15 mm). Grattez doucement la surface des voies respiratoires à l’aide d’un scalpel pour dépouiller complètement les cellules épithéliales luminales du tissu.
    4. Lavez la boîte de Petri avec 5 mL de tampon HBSS+ stérile pour recueillir toutes les cellules épithéliales luminales délogées et transférer les cellules délogées dans un tube de centrifugeuse conique de 50 mL. Triturez la suspension en tirant une aiguille de 5 à 16 G et une aiguille de 18 G montée sur une seringue de 10 mL pour obtenir une suspension à cellule unique.
    5. Centrifuger la suspension à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Remettez en suspension la pastille dans un tampon HBSS+ frais et stockez ces cellules des voies respiratoires luminales sur de la glace, prêtes à être combinées avec la suspension à cellule unique générée par les voies respiratoires proximales hachées dans les étapes à venir.
    6. À l’aide de ciseaux, coupez le tissu trachéo-bronchique restant le long de ses anneaux pour générer de petites bandes de tissu et transférez les bandes dans une boîte de Pétri fraîche. Hachez les bandes de tissu à l’aide d’une lame de rasoir simple face pour en faire de plus petits morceaux.
      REMARQUE: Étant donné que les voies respiratoires proximales sont cartilagineuses, elles ne peuvent pas être hachées aussi finement que le tissu pulmonaire distal.
    7. Transférer le tissu haché dans les tubes C, ajouter 2 mL de liberase au tube en veillant à ce que le tissu soit submergé. Chargez le tube C sur le dissociateur automatisé et exécutez le protocole pulmonaire humain-2 pour dissocier mécaniquement davantage les tissus.
      REMARQUE: Le dissociateur utilisé dans ce protocole offre un programme optimisé appelé protocole pulmonaire humain-2 pour cette application spécifique (voir tableau des matériaux).
  2. Digestion enzymatique et isolement unicellulaire
    1. Transférer environ 2 g de tissu proximal haché du tube C dans chaque tube de centrifugeuse conique de 50 mL et ajouter 50 μg/mL de liberase et 25 μg/mL de solution de DNase à chaque tube.
      REMARQUE: Pour assurer une dissociation efficace, les tubes ne doivent pas être remplis au-delà de la marque de 30 mL.
    2. Incuber le tissu haché pendant 45 min à 37 °C en agitant continuellement à l’aide d’un mélangeur réglé à 900 tr/min.
    3. Passer la suspension tissulaire dissociée à travers une série de crépines cellulaires (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm) sous pression sous vide comme mentionné ci-dessus et recueillir le flux à travers. Lavez la passoire avec 20 mL de tampon HBSS+ pour recueillir les cellules restantes.
      REMARQUE: Étant donné que le tissu proximal est cartilagineux et volumineux par rapport au tissu distal, il existe une plus grande possibilité de colmatage des filtres. L’utilisation d’un entonnoir peut aider à prévenir le débordement du liquide lors du passage à travers les passoires.
    4. Ajouter un volume égal de tampon HBSS+ au filtrat pour inhiber l’activité de la libérase et prévenir la digestion excessive. Ajouter les cellules proximales proximales luminales isolées de 3.1.5 à la suspension cellulaire à cette étape.
    5. Centrifuger la suspension de cellule combinée à 500 x g pendant 10 min. Retirez le surnageant et répétez le lavage des cellules dans le tampon HBSS+. Effectuer l’épuisement des cellules immunitaires CD45+ et des cellules endothéliales CD31+ comme mentionné ci-dessus au point 2.4 (étape facultative).
    6. Les méthodes de coloration sont similaires au tissu pulmonaire distal, suivez les étapes décrites au point 2.5. Enrichir les cellules épithéliales viables en fonction de leur phénotype de surface cellulaire CD45 négatif, CD31 négatif, CD236 positif et de la coloration négative pour le DAPI.
    7. Sous-ensemble supplémentaire de la fraction cellulaire épithéliale basé sur la coloration des marqueurs de surface spécifiques au type cellulaire, tels que le NGFR, permettant l’enrichissement des types cellulaires basaux (NGFR positifs) et non basaux (NGFR négatif; sécrétoires, ciliés, neuroendocriniens) (Figure 3).

4. Culture organoïde

  1. Ajouter 5 000 (ce nombre peut être ajusté pour donner la densité souhaitée d’organoïdes épithéliaux) des cellules proximales ou épithéliales distales triées dans un tube stérile de 1,5 mL avec 7,5 x 104 cellules MRC-5 (lignée cellulaire de fibroblastes pulmonaires humains). Les interactions épithéliales-mésenchymateuses sont essentielles à l’expansion des cellules progénitrices.
  2. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
    REMARQUE: Il est important de confirmer manuellement le nombre de cellules obtenues à partir du trieur afin d’assurer la précision de l’efficacité de la formation de colonies organoïdes.
  3. Retirez et jetez soigneusement le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 50 μL de milieux glacés complétés par des antibiotiques. Gardez la suspension cellulaire sur la glace.
  4. Ajouter 50 μL de milieu de matrice de membrane basale glacé 1x appauvri en facteur de croissance au flacon et pipeter doucement la suspension sur de la glace pour mélanger.
    REMARQUE: Il est important d’utiliser un milieu glacé et de maintenir les cellules sur la glace pour éviter la polymérisation prématurée du milieu de la matrice de la membrane basale.
  5. Transférer la suspension cellulaire sur un insert de culture cellulaire de 0,4 μm de la taille d’un pore dans une plaque de 24 puits (1,4 x 104 cellules/cm2), en prenant soin d’éviter l’introduction de bulles d’air.
  6. Incuber à 37 °C pendant 30-45 min pour permettre à la matrice de se solidifier.
  7. Ajouter 600 μL de milieu de croissance préchauffé au puits.
    NOTE: Le milieu a été complété par des agents antimycotiques (0,4%) et un streptocoque Pen (1%) pendant les 24 premières heures après l’ensemencement et un inhibiteur de rho kinase de 10 μM pendant les 72 premières heures.
  8. Culture à 37 °C dans un incubateur à 5% de CO2 pendant 30 jours, période pendant laquelle les milieux doivent être changés toutes les 48 h.
    REMARQUE: La durée de la culture peut être modifiée en fonction du but de l’expérience. Des critères d’évaluation plus longs sont utilisés pour étudier la différenciation, tandis que des critères plus courts de 7 jours, 14 jours, etc., peuvent être utilisés si le but de l’expérience n’est pas d’obtenir une différenciation complète.
  9. Ajouter 10 μM d’inhibiteur de TGFβ au milieu de culture pendant 15 jours pour maintenir les cellules dans la phase proliférative et supprimer la prolifération des fibroblastes.
    REMARQUE: Les résultats diffèrent selon le milieu de culture utilisé pour le test. Par exemple, les résultats présentés ici ont été générés à l’aide de Pneumacult-ALI Medium, ce qui entraîne la génération de gros organoïdes à partir du poumon distal, d’organoïdes bien différenciés et plus gros à partir du poumon proximal.

5. Coloration organoïde

  1. Fixation et incorporation d’organoïdes
    1. Aspirer les milieux des chambres d’insertion transmembranaire supérieure et inférieure et rincer une fois avec du PBS chaud.
    2. Fixer les cultures en plaçant 300 μL de PFA (2 % p/v) dans l’insert et 500 μL dans le puits pendant 1 h à 37 °C. Retirez le fixateur et rincez avec du PBS chaud en prenant soin de ne pas déloger le bouchon de matrice de membrane basememt.
      REMARQUE: Les organoïdes fixes peuvent être stockés immergés dans du PBS à 4 ° C pendant une à deux semaines avant d’entamer d’autres étapes.
    3. Aspirez PBS, inversez l’insert et coupez soigneusement la membrane de l’insert autour de sa périphérie. À l’aide d’une pince, retirez la membrane transpuite, en prenant soin de ne pas déranger le bouchon de matrice.
    4. Dans une boîte de Pétri, appuyez sur l’insert pour récupérer le bouchon de matrice.
    5. Ajouter une goutte de gel de traitement d’échantillon tel que Histogel (maintenu à 37 ° C) au bouchon de matrice et maintenir à 4 ° C jusqu’à ce que le gel se solidifie.
    6. Transférer le bouchon dans une cassette d’incorporation, déshydrater en augmentant les concentrations d’éthanol (70, 90 et 100%), clair dans le xylène et incorporé dans la cire de paraffine.
    7. Coupez des sections de 7 μm sur un microtome et collectez sur des lames chargées positivement.
  2. Coloration par immunofluorescence des organoïdes
    1. Placer les glissières à 65 °C pendant 30 min pour les dégazer.
    2. Déparaffiniser les sections par immersion dans le xylène et réhydrater en diminuant les concentrations d’éthanol.
    3. Effectuer la récupération d’antigènes à haute température dans une solution de démasquage d’antigène, base d’acide citrique à l’aide d’un récupérateur disponible dans le commerce en trempant des lames dans la solution pendant 15 min (Tableau des matériaux).
    4. Entourez le tissu d’une barrière hydrophobe à l’aide d’un stylo pap.
    5. Bloquer la coloration non spécifique entre les anticorps primaires et le tissu, en incubant dans le tampon bloquant.
    6. Incuber des sections à la concentration appropriée d’anticorps primaires dilués dans une solution d’incubation pendant la nuit à 4 °C dans une chambre humidifiée.
    7. Rincer les sections 3x à température ambiante avec un tampon de lavage.
    8. Incuber à la concentration appropriée d’anticorps secondaire conjugué au fluorochrome pendant 1 h à température ambiante.
    9. Rincer les sections 3x à température ambiante avec 0,1% Tween 20-TBS. Incuber les sections pendant 5 min dans DAPI (1 μg/mL). Rincer les sections une fois dans TBS (solution saline tamponnée Tris) avec 0,1 % Tween 20, sécher et monter dans une solution de montage (Figure 4 et Figure 5).
      REMARQUE : La source et la dilution de travail optimale des anticorps primaires et secondaires utilisés pour la coloration par immunofluorescence sont incluses dans la Table des matériaux.

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Résultats

Tissu pulmonaire source
La trachée et la bronche extrapulmonaire (figure 1A) ont été utilisées comme tissu source pour l’isolement des cellules épithéliales proximales des voies respiratoires et la génération subséquente d’organoïdes proximaux. Le tissu pulmonaire distal qui comprend à la fois le parenchyme et les petites voies respiratoires de moins de 2 mm de diamètre (figure 1A) a été utilisé pour l’isolement des petites cellules épithélia...

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Discussion

Nous décrivons une méthode fiable pour l’isolement de sous-populations définies de cellules pulmonaires du tissu pulmonaire humain pour l’analyse moléculaire ou fonctionnelle et la modélisation de la maladie. Les éléments critiques des méthodes comprennent la capacité d’obtenir la dissociation tissulaire avec préservation des épitopes de surface, qui permettent l’enrichissement par anticorps de cellules fraîchement isolées, et l’optimisation des méthodes de culture pour la génération efficace d’organoïdes épithéliaux spé...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous apprécions le soutien de Mizuno Takako pour la coloration IFC et H et E, Vanessa Garcia pour la section des tissus et Anika S Chandrasekaran pour l’aide à la préparation du manuscrit. Ce travail est soutenu par les National Institutes of Health (5RO1HL135163-04, PO1HL108793-08) et le Consortium Celgene IDEAL.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Cell Isolation
10 mL Seringues stériles, Luer-Lok TipFisher scientificBD 309646
30 mL Seringues stériles, Luer-Lok TipVWRBD302832
Biohazard bagsVWR89495-440
Sacs biohazardVWR89495-440
bague de raccordementPluriselect41-50000-03
Désoxyribonucléase (lot#SLBF7798V)sigma AldrichDN25-1G
Boîtes de Pétri jetablesCorning/Falcon25373-187
EntonnoirPluriselect42-50000
HBSSCorning21-023
Liberase TM Research Gradesigma Aldrich5401127001
aiguille 16GVWR305198
18GVWR305199
PluriStrainer 100 µ ; m (Cell Strainer)Pluriselect43-50100-51
PluriStrainer 300 µ ; m (Cell Strainer)Pluriselect43-50300-03
PluriStrainer 40 µ ; m (Cell Strainer)Pluriselect43-50040-51
PluriStrainer 500 µ ; m (Cell Strainer)Pluriselect43-50500-03
PluriStrainer 70 µ ; m (Cell Strainer)Pluriselect43-50070-51
Lames de rasoirVWR55411-050
Tampon de lyse des globules rougeseBioscience00-4333-57
Équipement' s
GentleMACS C TubesMACS Miltenyi Biotec130-096-334
GentleMACS Octo DissociatorMACS Miltenyi Biotec130-095-937
Leica ASP 300s Processeur
de tissus LS ColumnsMACS Miltenyi Biotec130-042-401
MACS MultiStand**Miltenyi Biotech130-042-303
ThermomixeurEppendorf05-412-503
ThermomixeurEppendorf05-412-503
HBSS+ Tampon
Amphotéricine BThermo fisher scientific152900182ml
EDTA (0,5 M), pH 8,0, sans RNaseThermo fisher scientificAM9260G500µ ; l
Sérum fœtal bovinGemini Bio-Products100-10610ml
HBSS Hank’s Balanced Salt Solution 1X 500 mlVWR45000-456Flacon de 500ml
HEPES (1 M)Thermo fisher scientific156300805ml
Pénicilline-Streptomycine-Néomycine (PSN) Mélange d’antibiotiques Thermofisher scientific156400555ml
Liste des anticorps pour FACS
Alexa Fluor 647 anti-humain CD326 (EpCAM) AnticorpsBioLegend3698201:50
BD CompBead Anti-souris Ig, K/ Negative control particles setFisher ScientificBDB552843
CD31 MicroBead Kit, humainMiltenyi Biotec130-091-93520µ ; l/ 107 cellules totales
CD45 Microbilles, humainMiltenyi Biotec130-045-80120µ ; l/ 107 cellules totales
DAPISigma AldrichD9542-10MG1:10000
FITC anti-humain CD235aBioLegend3491041:100
FITC anti-humain CD31BioLegend3031041:100
FITC anti-humain CD45BioLegend3040541:100
FITC anti-souris IgM AnticorpsBioLegend4065061/500
Souris IgM anti humain HT2-280Terrace BiotechTB-27AHT2-2801:300
PE anti-humain CD271(NGFR)BioLegend3451061:50
Composition des milieux
MRC-5ATCCCCL-171
PneumaCult -ALI MediumStemcell Technologies5001
Petites voies respiratoires épithéliales Milieu de croissance cellulairePromoCellC-21170
ThinCert Inserts de culture tissulaire,Greiner stérile Bio-One662641
Y-27632 (inhibiteur de ROCK) 100mM stock (1000x)Stemcell Technologies72302
Souris Milieu basal :
Amphotéricine BThermo fisher scientifique1529001850 µ ; l
DMEM/F-12, HEPESThermoFisher scientific1133003250 ml
Sérum de veau fœtalGemini Bio-Products100-1065 ml
Insuline-Transferrine-Sélénium (ITS -G) (100X)ThermoFisher scientific41400045500 µ ; l
Pénicilline-Streptomycine-Néomycine (PSN) Mélange d’antibiotiquesThermo fisher scientific15640055500 µ ; l
SB431542 inhibiteur de la voie TGF-&bêta (stock 100 mM)Cellule souche722345 µ ; l
Liste des anticorps pour l’immunohistochimie
Solution de démasquage de l’antigène, à base d’acide citriqueVecteurH-3300937 µ ; l dans 100ml d’eau
HistogelThermo ScientificHG-4000-012
Anticorps
Anti HT2-280TerracebiotechTB-27AHT2-2801:500
FOXJ1 Anticorps monoclonal (2A5)Thermo Fisher Scientific14-9965-821:300
Utéroglobine/SCGB1A1 humaine AnticorpsR et D systèmesMAB42181:300
Kératine 5 Anticorps polyclonal de poulet, purifié [Poly9059]Biolegend9059011:500
MUC5AC Anticorps monoclonal (45M1)Thermo Fisher ScientificMA5-121781:300
PDPN / Podoplanin Anticorps (clone 8.1.1)LifeSpan BiosciencesLS-C143022-1001:300
Souris purifiée Anti-E-CadhérineBDbiosciences 6101821:1000
Anticorps Sox-2Santa Cruz biotechnologiessc-3659641:300
Anticorps
Âne anti-lapin lgG, 488Thermo Fisher ScientificA-212061:500
FITC anti-souris IgMAnticorps BioLegend4065061:500
Chèvre anti-hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-21113
Anticorps secondaire anti-souris IgG1 de chèvre à adsorption croisée, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-21121
Anticorps secondaire anti-souris IgG2a de chèvre à adsorption croisée 1:500, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-21131:500
Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA-211341:500
Anticorps secondaire à adsorption croisée IgG2b de chèvre, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA-21144Tampons 1:500
l’immunohistochimie3 % BSA, o.4 % Triton-x100 dans le TBS (solution saline à base de Tris)
Solution3 % BSA, ).1 % Triton-X100 dans le TBS
SolutionTBS avec 0,1 % Tween 20
aiguille de culture organoïdeprimairessecondaires Anticorps secondaire anti-IgG2a de chèvre à adsorption croisée 1, Solution de blocage de d’incubation d’immunohistochimie de lavage d’immunohistochimie

Références

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