Isolement et enrichissement des cellules progénitrices épithéliales pulmonaires humaines pour la culture organoïde

Bindu Konda; Apoorva Mulay; Changfu Yao; Stephen Beil; Edo Israely; Barry  R. Stripp

doi:10.3791/61541

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Article de méthode

Isolement et enrichissement des cellules progénitrices épithéliales pulmonaires humaines pour la culture organoïde

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DOI :

10.3791/61541

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21 juillet 2020

Bindu Konda¹ , Apoorva Mulay¹ , Changfu Yao¹ , Stephen Beil¹ , Edo Israely¹ , Barry R. Stripp¹

¹Lung and Regenerative Medicine Institutes, Department of Medicine, Cedars-Sinai Medical Center

Dans cet article

Résumé

Cet article fournit une méthodologie détaillée pour les approches de dissociation tissulaire et de fractionnement cellulaire permettant l’enrichissement de cellules épithéliales viables à partir de régions proximales et distales du poumon humain. Ici, ces approches sont appliquées pour l’analyse fonctionnelle des cellules progénitrices épithéliales pulmonaires grâce à l’utilisation de modèles de culture d’organoïdes 3D.

Résumé

Les modèles organoïdes épithéliaux sont des outils précieux pour étudier la biologie fondamentale d’un système d’organes et pour la modélisation de la maladie. Lorsqu’elles sont cultivées sous forme d’organoïdes, les cellules progénitrices épithéliales peuvent s’auto-renouveler et générer une progéniture différenciante qui présente des fonctions cellulaires similaires à celles de leurs homologues in vivo . Nous décrivons ici un protocole étape par étape pour isoler les progéniteurs spécifiques à une région du poumon humain et générer des cultures organoïdes 3D en tant qu’outil expérimental et de validation. Nous définissons les régions proximales et distales du poumon dans le but d’isoler les cellules progénitrices spécifiques à la région. Nous avons utilisé une combinaison de dissociation enzymatique et mécanique pour isoler les cellules totales du poumon et de la trachée. Des cellules progénitrices spécifiques ont ensuite été fractionnées à partir des cellules d’origine proximale ou distale à l’aide du tri cellulaire associé à la fluorescence (FACS) basé sur des marqueurs de surface spécifiques au type cellulaire, tels que le NGFR pour le tri des cellules basales et LE HTII-280 pour le tri des cellules alvéolaires de type II. Des progéniteurs isolés basaux ou alvéolaires de type II ont été utilisés pour générer des cultures organoïdes 3D. Les progéniteurs distaux et proximaux ont formé des organoïdes avec une efficacité de formation de colonies de 9 à 13% dans la région distale et de 7 à 10% dans la région proximale lorsqu’ils sont plaqués 5000 cellules / puits au jour 30. Les organoïdes distaux ont maintenu en culture des cellules alvéolaires HTII-280⁺ de type II, tandis que les organoïdes proximaux se sont différenciés en cellules ciliées et sécrétoires au jour 30. Ces cultures organoïdes 3D peuvent être utilisées comme outil expérimental pour étudier la biologie cellulaire de l’épithélium pulmonaire et les interactions mésenchymateuses épithéliales, ainsi que pour le développement et la validation de stratégies thérapeutiques ciblant le dysfonctionnement épithélial dans une maladie.

Introduction

Les espaces aériens du système respiratoire humain peuvent être largement divisés en zones conductrices et respiratoires qui interviennent dans le transport des gaz et leur échange ultérieur à travers la barrière épithéliale-microvasculaire, respectivement. Les voies respiratoires conductrices comprennent la trachée, les bronches, les bronchioles et les bronchioles terminales, tandis que les espaces respiratoires comprennent les bronchioles respiratoires, les canaux alvéolaires et les alvéoles. La muqueuse épithéliale de ces espaces aériens change de composition le long de l’axe proximo-distal pour répondre aux exigences uniques de chaque zone fonctionnellement distin....