Un test ex vivo de dégranulation des mastocytes à l’aide de cellules d’exsudat péritonéale brutes et d’une stimulation antigénique naturelle

Résumé

Nous avons mis au point un test de dégranulation ex vivo des mastocytes réalisé en incubant des cellules d’exsudat péritonéale brutes isolées chez la souris, traitées avec un agent pharmacologique d’intérêt et administrées au préalable des IgE anti-dinitrophénols (DNP), avec du DNP sur une protéine porteuse.

Résumé

Les stabilisateurs de mastocytes sont un élément essentiel des médicaments contre les allergies. L’anaphylaxie systémique passive (APS) est un test animal largement utilisé pour étudier l’effet d’un agent pharmacologique d’intérêt sur les mastocytes in vivo. Comme les symptômes anaphylactiques sont principalement attribués à l’exocytose des granules des mastocytes, on conçoit que l’agent qui provoque l’amélioration des symptômes a une activité stabilisatrice des mastocytes. Malgré le fait, il est prudent de confirmer l’activité en démontrant directement le déclin de l’activité fonctionnelle des mastocytes suite à son traitement. Des essais de dégranulation in vitro utilisant une lignée de mastocytes immortalisés ou des mastocytes primaires cultivés sont couramment utilisés à cette fin. Les résultats des essais in vitro et in vivo ne sont pas toujours semblables ; Cependant, les conditions de traitement (p. ex., dose de traitement, temps, environnement environnant) pour les essais in vitro sont souvent distinctes de celles pour les essais in vivo, comme l’APS. Dans le but de réaliser un test in vitro (ou ex vivo) pour refléter plus fidèlement l’effet d’un agent pharmacologique sur les mastocytes in vivo, nous avons conçu le test de dégranulation ex vivo des mastocytes dans lequel des cellules d’exsudat péritonéale (PEC) brutes isolées des souris, traitées avec l’agent et auxquelles on a administré des IgE anti-dinitrophénols (DNP), ont été incubées directement avec du DNP sur une protéine porteuse. Il s’est avéré que le test était non seulement utile pour valider l’activité stabilisatrice des mastocytes d’un agent pharmacologique indiqué par le test in vivo, mais aussi pratique et hautement reproductible.

Introduction

Les mastocytes jouent un rôle central dans l’allergie ^1,2. Lorsque les IgE localisées à la surface des mastocytes via l’interaction avec le récepteur de haute affinité pour les IgE (FcεRI) rencontrent un allergène apparenté, une cascade de signalisation est déclenchée pour provoquer la libération des granules. Par conséquent, diverses molécules effectrices d’allergies, y compris les monoamines (p. ex., histamine, sérotonine), les cytokines (p. ex., TNF-α) et les enzymes protéolytiques (p. ex., tryptase, chymase), sont libérées pour provoquer une série de réactions immunologiqu....

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux directives fournies par l’IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) de l’Université nationale de Chungnam (numéro de protocole animal : CNU-00996).

1. Quantifier les molécules spécifiques des mastocytes dans le lysat des CEE brutes

1. Isolez les cellules de la cavité péritonéale de la souris¹².
   1. Anesthésier une souris (âgée de 8 semaines, mâle, BALB/C) avec de l’isoflurane. Euthanasier par luxation cervicale.
   2. Placez la souris sur un bloc de mousse. Essuyez l’abdomen avec ....

Résultats

Détermination du nombre optimal de CEE pour l’essai de dégranulation ex vivo des mastocytes

Mastocytes (c-kit⁺· IgE⁺ double positive)¹⁵ ne représentent qu’environ 2 % des CEE (Figure 1A). En estimant les niveaux maximaux de molécules spécifiques des mastocytes à détecter dans les surnageants de culture en supposant que 100 % des granules étaient libérés par les mastocytes dans les CEE, nous avons mesur.......

Discussion

La découverte que le test de dégranulation des mastocytes peut être effectué avec un nombre relativement faible de CEE de souris brutes est significative. Même si les CEE doivent être une excellente source de mastocytes primaires de souris, il est difficile de purifier les mastocytes dans les CEE. Bien qu’un milieu à gradient de densité tel que Percoll²⁵ ait été utilisé avec succès pour la purification des mastocytes à partir des CEE de rat, son utilisation pour l.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
	de 1 mL	1757589701
microtube de 1,5 mL	Hisol	MT-15003
Seringue		de 10 mL
tube conique de 15 mL	Thermo Fisher scientific	14-959-53A
20xPBS	Tech & Innovation	BPB-9121-500mL
4-nitrophényl-N-acétyl-&beta ;-D-glucosaminide	SIGMA	N9376
5 mL polystyrène tube à fond rond	de la vie	352003
50 mL tube conique	Thermo Fisher scientific	14-959-49A
Aluminium Fiol	BioFact	TS1-3330
Anti-souris CD117(c-kit)	Biolegend	135129	conserver à 2-8° ; C
IgE anti-souris mAbs	Thermo Fisher scientific	11-5992-81	maintenir à 2-8° ; C
Antiti-DNP-IgE	SIGMA	D8406-.2MG	se maintenir à -20° ; C
Centrifugeuse	HANIL	396150
D-(+)-gluouse	SIGMA	G8270
Dexaméthasone	SIGMA	D2915-100MG
DNP-BSA	Invitrogen	2079360	maintenir à -20° ; C
EDTA	Biofact	PB131-500
Sérum de veau fœtal	Thermo Fisher 11455035
Gélatine	SIGMA	G1890
Glycine	JUNSEI	27185-0350
hémocytomètre	ZEISS	176045
HEPES	Thermo Fisher	15630130
Histamine ELISA kit	Abcam	GK3275957-4	maintenir à 2-8° ; C
Agitateur à plaque chauffante	Lab teach	zso-9001
Isoflurance	Troikaa	I29159
ketotifen fumarate salt	SIGMA	K2628
MCPT-1 ELISA kit Thermo	Fisher scientific	88-7503-22	maintenir à 2-8° ; C
Souris Fc bloc	BD Biosciences	553141	maintenir à 2-8° ; C
Propidium iodiole	SIGMA	81845	maintenir à 2-8° ; C
Tampon de lyse RBC	Biolegend	420301
Fond rond 96 puits	SPL-sciences de la vie	30096
Filtre à seringue à usage unique	Startoriusag	16555
Microbilles de streptavidine	MilteryiBiotec	130-048-101	maintenir à 2-8° ; C
Triton X-100	JUNSEIchemical	49415-1601
TWEEN 20	SIGMA	9005-64-5
Bain-marie	CHANGSHINSCIENCE	190107

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