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Cette étude a été menée à l’établissement d’enseignement de la faculté de médecine (MSTF, Université du Maryland, Baltimore, MD, États-Unis), qui est accrédité par l’American Association for Laboratory Animal Science. Le protocole de l’étude a été approuvé par le comité local de protection et d’utilisation des animaux de l’établissement.
1. Sélection et hébergement des animaux
- Utiliser des porcs mâles adultes (Sus Scrofa) pesant de 60 à 80 kg.
- Après l’arrivée à l’animalerie, logez les animaux un par cage, mais avec la possibilité d’interagir avec les animaux dans les cages voisines.
- Hébergez les animaux pendant un minimum de 48 heures pour assurer l’acclimatation. Laissez les animaux accéder librement à l’eau et donnez-leur un régime standard jusqu’à la veille de l’expérience, lorsque les animaux doivent être à jeun pour minimiser le risque d’aspiration pendant l’intubation.
- Surveillez régulièrement les animaux pour confirmer qu’ils sont en bonne santé.
2. Sédation et induction de l’anesthésie générale
- Endormir l’animal alors qu’il est encore dans sa zone d’hébergement par injection intramusculaire de télazol (4-5 mg/kg)/xylazine (1,8-2,2 mg/kg) caudale dans l’oreille ou dans le muscle fessier.
- Transportez l’animal de la zone d’hébergement à la salle d’opération et placez-le en position couchée dorsale sur la table d’opération.
- Placez une sonde d’oxymétrie de pouls sur l’oreille de l’animal, placez un masque facial sur le museau de l’animal et donnez de l’isoflurane à 100 % O2, jusqu’à ce que la mandibule soit détendue, pour induire l’anesthésie.
- Placez une sonde endotrachéale (TE) à l’aide d’un laryngoscope. Cela doit être réalisé en maintenant les mâchoires ouvertes, en tirant la langue, en identifiant l’épiglotte, en passant l’extrémité du laryngoscope dans l’oropharynx et en déplaçant l’épiglotte du palais mou. Faites avancer le tube ET à travers les cordes vocales de 6 à 10 cm, puis faites-le pivoter en position incurvée vers le bas par rapport au sommet de la tête de l’animal.
- Gonflez le brassard ET avec de l’air de 10 cm3, fixez le tube ET au museau de l’animal à l’aide d’attaches de gaze et auscultez la poitrine de l’animal pour confirmer le bon placement du tube.
- Connectez le tube ET à un ventilateur mécanique via un échangeur de chaleur et d’humidité.
- Confirmer les réglages appropriés du ventilateur mécanique pour fournir une fraction d’O2 inspirée de 30 %, avec un volume courant de 7 à 10 ml par kg de masse corporelle, une fréquence respiratoire de 10 à 15 respirations/min, en visant une tension deCO2 en fin d’expiration de 38 à 42 mmHg.
- Pour maintenir l’anesthésie, utilisez 1,5 à 3 % d’isoflurane. Évalue régulièrement les paramètres respiratoires de l’animal.
3. Chirurgie
- Stérilisation et préparation du site opératoire
- Retirez les poils recouvrant le site de l’incision de laparotomie et les sites d’accès percutanés à l’aide d’une tondeuse à cheveux électrique.
- Frottez tous les sites d’incision et les sites de ponction percutanée avec de la bétadine et laissez sécher.
- Placez des champs stériles autour des sites opératoires pour préserver les champs opératoires stériles et prévenir la contamination. Fixez-les en place avec des agrafes.
- Rétractez les sabots avant et arrière avec une légère flexion et maintenez-les en place avec une corde ou du ruban adhésif.
- Placez les électrodes adhésives ECG sur le membre antérieur droit, le membre antérieur gauche, le membre postérieur droit et le membre postérieur gauche et sur le xiphoïde. Fixez les sondes ECG correctes aux électrodes adhésives.
- Laparotomie
- Utilisez l’électrocautérisation pour faire une incision abdominale médiane de 20 cm.
- Utilisez l’électrocautérisation pour disséquer à travers le tissu sous-cutané et la linea alba. Entrez dans la cavité péritonéale en vision directe à l’aide de ciseaux.
- Splénectomie
- Enlever la rate pour prévenir l’autotransfusion en réponse à l’exsanguination.
- Libérez la rate dans la plaie de la ligne médiane, clampez les vaisseaux du hile avec deux hémostats et transectez entre les hémostats. Ligature des extrémités traversées avec 0 liens en soie.
- Identifiez les vaisseaux gastriques courts plus profonds, placez deux hémostats, transectez les vaisseaux entre les hémostats et ligaturez les extrémités avec 0 attaches de soie.
- Inspectez soigneusement les vaisseaux ligaturés pour assurer l’hémostase. Examinez tous les vaisseaux qui saignent.
- Examinez la rate in situ pour vous assurer qu’elle est disséquée et retirez-la.
- Cystostomie
- Introduisez la vessie par la plaie de laparotomie.
- Saisissez la partie ventrale de la vessie entre deux pinces DeBakey et faites une incision de 1 cm à l’aide de ciseaux.
- Passez un cathéter d’aspiration dans l’ouverture et retirez l’urine de la vessie.
- Placez une sonde urinaire de 14 Fr dans la vessie. Gonflez le ballonnet du cathéter avec 10 ml de solution saline.
- Placez une suture de cordon de sac à main à l’aide d’une suture en nylon 3.0 pour fixer le cathéter dans la vessie afin d’éviter les déversements d’urine.
- Connectez le cathéter à un sac de collecte.
- Fermez la plaie de laparotomie avec un point de suture en nylon 3'0.
4. Instrumentation
REMARQUE : Voir le Tableau 1 pour les étapes clés de connexion du circuit SAAP.
- Accès vasculaire percutané
- Canulation de la veine jugulaire interne droite et gauche (Figure 1)
- À l’aide d’un guidage par ultrasons (US), visualisez la veine jugulaire interne ; Il est généralement situé à environ 2-3 cm de profondeur de la peau dans le sillon jugulaire.
- Perforez la peau avec une aiguille de 18 G placée à un angle de 45° par rapport à la peau et introduisez-la dans la lumière veineuse sous vision US. Passez un fil-guide Seldinger de 0,035" dans l’aiguille.
- Retirez l’aiguille en prenant soin de laisser le fil-guide dans la lumière veineuse.
- Faites une incision cutanée de 5 mm à côté du fil et enfilez une gaine de 7 Fr avec un dilatateur dans la veine sur le fil-guide.
- Retirez le fil-guide et l’introducteur en laissant la gaine en place. Fixez la gaine en place en la suturant à la peau avec des sutures en soie 1.0.
- Répétez les étapes ci-dessus pour canuler la veine jugulaire interne controlatérale.
REMARQUE : L’une des gaines de la veine jugulaire est utilisée pour la surveillance de la pression auriculaire droite, l’autre peut être utilisée pour l’administration de médicaments selon le protocole de l’étude. Alternativement, les veines jugulaires externes peuvent être utilisées pour la canulation.
- Canulation de l’artère carotide (Figure 1)
- Localisez l’artère carotide juste latéralement à la trachée à l’aide du guidage US.
- Percez la peau avec une aiguille de 18 G placée à un angle de 45° par rapport à la peau et introduisez-la dans la lumière artérielle sous vision US, passez un fil-guide Seldinger de 0,035" à travers l’aiguille.
- Retirez l’aiguille en prenant soin de laisser le fil-guide dans la lumière artérielle.
- Faites une incision cutanée de 5 mm à côté du fil et enfilez une gaine de 7 Fr avec un dilatateur dans l’artère au-dessus du fil-guide.
- Retirez le fil-guide et l’introducteur en laissant la gaine en place. Fixez la gaine en place en la suturant à la peau avec des sutures en soie 1.0.
- Canulation des artères fémorales droite et gauche
- Localisez l’artère fémorale droite dans le canal fémoral à l’aide du guidage échographique.
- Percez la peau avec une aiguille de 18 G à un angle de 45° par rapport à la peau et introduisez-la dans la lumière artérielle sous vision US. Passez un fil-guide Seldinger de 0,035" dans l’aiguille.
- Retirez l’aiguille en prenant soin de laisser le fil-guide dans la lumière artérielle.
- Faites une incision cutanée de 10 mm à côté du fil.
- Enfilez une gaine de 14 Fr avec un dilatateur dans l’artère au-dessus du fil-guide.
- Retirez le fil-guide et l’introducteur en laissant la gaine en place. Fixez la gaine en place en la suturant à la peau avec des sutures en soie 1.0.
- Pour l’accès artériel fémoral gauche, localisez l’artère fémorale gauche dans le canal fémoral à l’aide de l’US.
- Perforez la peau avec une aiguille de 18 G à un angle de 45° et introduisez-la dans la lumière artérielle sous vision US. Passez un fil-guide Seldinger de 90 cm 0,035" dans l’aiguille.
- Retirez l’aiguille en prenant soin de laisser le fil-guide dans la lumière artérielle.
- Faites une incision cutanée de 10 mm à côté du fil.
- Enfilez une canule ECMO 15 Fr de 18 cm de long dans l’artère au-dessus du fil-guide.
- Retirez le fil-guide avec le dilatateur et clampez l’extrémité distale de la canule pour éviter le saignement du dos.
- Canulation de la veine fémorale
- Localisez la veine fémorale dans le canal fémoral à l’aide du guidage US.
- Percez la peau avec une aiguille de 18 G à un angle de 45° et introduisez-la dans la lumière veineuse sous vision US, passez un fil-guide Seldinger de 0,035" à travers l’aiguille.
- Retirez l’aiguille en prenant soin de laisser le fil-guide dans la lumière veineuse.
- Faites une incision cutanée de 5 mm adjacente au fil et enfilez un cathéter veineux central de 9 Fr avec un introducteur dans la veine au-dessus du fil-guide.
- Retirez le fil-guide et l’introducteur en laissant le cathéter en position. Fixez la ligne en place en la suturant à la peau avec des sutures en soie 1.0.
- Surveillance vasculaire percutanée (Figure 1)
- Pression de la racine aortique
- À l’aide de la fluoroscopie, introduisez un cathéter à micromanomètre dans la gaine 7 Fr de l’artère carotide droite.
- Vérifiez que l’extrémité du cathéter se trouve dans l’arc aortique en visualisant la forme d’onde de pression aortique présentée sur l’écran de collecte de données.
- Pression auriculaire droite
- À l’aide de la fluoroscopie, introduisez un cathéter micromanomètre préalablement calibré dans la gaine 7 Fr de la veine jugulaire interne droite.
- Confirmez l’emplacement de l’extrémité du cathéter dans l’oreillette droite en observant la forme d’onde de pression présentée sur l’écran de collecte de données.
5. Exsanguination
- Préparation de la configuration
- Injectez 15 000 UI d’héparine non fractionnée par le bras latéral de la gaine du VJI.
- Chargez le tube d’exsanguination dans le rouleau de la pompe péristaltique utilisée pour l’exsanguination.
- Connectez une extrémité du tube au réservoir du circuit à l’aide d’un tube IV standard.
- Connectez l’autre extrémité du tube de la pompe d’exsanguination à l’aide d’un coupleur droit et d’un segment de 2 pouces de tube de 1/4" de diamètre intérieur à l’extrémité de la canule ECMO 15 Fr dans l’artère fémorale.
- Retirez la pince de la canule 15 Fr.
- Calculez les intervalles logarithmiques du taux d’exsanguination à l’aide de la formule5. La durée de l’intervalle et le taux d’exsanguination dépendent du protocole d’étude.

- Réglez le débit de pompe souhaité selon le protocole à l’aide du logiciel informatique de pompe spécifique programmable -PUMPTERM.
- Connectez l’ordinateur à la pompe programmable à l’aide d’un port Ethernet standard. Une fois que la pompe contrôlée est programmée avec le débit initial mis à jour affiché sur l’affichage numérique, elle peut être déconnectée de l’ordinateur.
- Exsanguination contrôlée par pompe
- Commencez l’exsanguination en appuyant sur le bouton START/STOP de la pompe.
- Poursuivre l’exsanguination selon le protocole jusqu’à ce que l’AEP soit démontrée par une perte de pression aortique (TAS <10 mmHg) avec perte de pulsatilité de la forme d’onde de la pression de la racine aortique accompagnée d’un rythme ECG sinusal.
- Arrêtez l’exsanguination en appuyant manuellement sur le bouton START/STOP de la pompe.
6. Le SAAP
- Préparation du circuit SAAP
- Construisez le tube du circuit à l’aide de connecteurs en Y et droits cannelés et d’un tube de 3/8" de diamètre intérieur pour incorporer un membre de reperfusion, un membre de perfusion principal, un membre de perfusion SAAP et un membre de perfusion périphérique (Figure 2). Fixez les connexions avec des colliers de serrage.
- Connectez la tubulure proximale au réservoir de sang.
- Connectez le tube à la pompe centrifuge.
- Connectez le tube à l’oxygénateur.
- Connectez l’oxygénateur à la source d’oxygène à l’aide d’un tube d’oxygène standard en l’insérant dans l’orifice de perfusion d’oxygène de l’oxygénateur.
- Chargez la branche de perfusion principale du circuit dans la tête de pompe péristaltique.
- Délivrez l’oxygène à 6 L/min en tournant le cadran de la bouteille d’oxygène.
- Ajoutez 15 000 UI d’héparine non fractionnée dans le réservoir du circuit.
- Vérifiez que le membre de perfusion du circuit est clampé et que le membre de reperfusion est ouvert lorsque le sang versé est pompé dans le réservoir de sang pendant l’exsanguination. Activez la pompe centrifuge dans le circuit SAAP en appuyant sur le bouton START/STOP et réglez le débit à n’importe quel taux. Cela permettra au sang de circuler, empêchant la coagulation.
- Marquez la longueur d’insertion du ballon en le plaçant à l’extérieur contre des repères anatomiques. Visez à ce que le ballonnet se trouve dans l’aorte thoracique proximale.
- Rincez le cathéter SAAP et confirmez qu’il est équipé d’un robinet d’arrêt à 3 voies fixé au moyeu du cathéter.
- Vérifiez que le ballonnet est complètement dégonflé et que le cathéter est doté d’un robinet d’arrêt à 2 voies au niveau de l’orifice du ballonnet.
- Préremplir une seringue de 60 mL avec une solution de 0,1 mg d’épinéphrine (dans 1 mL), 10 mL de produit de contraste et 49 mL de solution saline. Cette solution est le bolus de fermeture de la valve aortique (AV) qui sera injecté immédiatement avant la perfusion SAAP pour éviter le remplissage rétrograde du ventricule gauche.
- Préremplissez une autre seringue avec 15 ml de solution saline/de contraste (1:1). Celui-ci sera utilisé pour gonfler le ballonnet du cathéter.
- Réglez la pompe péristaltique dans le circuit SAAP pour délivrer le perfusat (sang oxygéné) à un taux de 10 ml/kg du poids corporel de l’animal en programmant manuellement la pompe à l’aide des boutons « haut » et « bas » sur le cadran de la pompe.
- Livraison SAAP
- Insérez le cathéter SAAP dans la gaine de 14 Fr de l’artère fémorale jusqu’à une longueur préalablement déterminée, fixez la seringue préremplie de 15 ml de solution saline de contraste à l’orifice du ballonnet (figure 2) et injectez le volume de la seringue pour gonfler le ballonnet.
- Confirmez la mise en place du ballonnet par fluoroscopie.
- Connectez le membre de perfusion SAAP au cathéter SAAP et le membre de perfusion périphérique au cathéter veineux (Figure 3).
- Fermez la branche de reperfusion du circuit SAAP en y appliquant la pince et ouvrez la branche de perfusion en retirant la pince (Figure 2).
- Fixez la seringue de 60 ml préalablement préremplie avec bolus de fermeture AV à l’orifice latéral du robinet d’arrêt à trois voies au niveau de la lumière artérielle du cathéter SAAP (Figure 3) et injectez rapidement manuellement tout le volume de la seringue, puis fermez l’orifice latéral de la seringue.
- Ouvrez immédiatement l’orifice d’extrémité du robinet d’arrêt de l’orifice artériel.
- Démarrez la pompe péristaltique dans le circuit SAAP en appuyant sur le bouton RUN/STOP .
- Après soixante secondes, arrêtez la pompe péristaltique en appuyant sur le bouton RUN/STOP .
- Dégonflez le ballon SAAP en aspirant tout le volume à partir de l’orifice du ballon SAAP.
- Fermez l’écoulement vers le cathéter à l’aide d’un robinet d’arrêt au niveau de la lumière artérielle du cathéter.
- Évaluez le rythme de la TAS et de l’ECG.
REMARQUE : Si, après 2 minutes après le début du SAAP, la TAS < 90 mmHg, jusqu’à 7 bolus de 200 mL de sang hépariné versé ou de sang total citrated pré-acheté peuvent être perfusés via le SAAP pour maintenir la TAS >90 mmHg.
- Si le sang stocké est utilisé pour le SAAP, une co-perfusion avec du gluconate de calcium est nécessaire pour empêcher la liaison du citrate-calcium dans le myocarde. Injectez du gluconate de calcium immédiatement avant la perfusion SAAP à l’aide d’une seringue fixée à l’orifice latéral du robinet d’arrêt à 3 voies relié au cathéter SAAP. Utilisez 1 gramme de gluconate de calcium par unité de globules rouges emballés et 3 grammes par unité de sang total5.
- Si l’animal développe une fibrillation ventriculaire ou une tachycardie ventriculaire, tenter la défibrillation en plaçant des palettes sur le sternum et l’apex et, après autorisation du personnel, établir un contact avec l’animal.
- Continuez la ventilation, immédiatement avant d’administrer les chocs, déconnectez les transducteurs de pression des unités de conditionnement de signal - reconnectez-les immédiatement après avoir administré le choc.
- Administrez un choc à l’aide d’un défibrillateur biphasique à partir de 150 J, réévaluez le rythme jusqu’à une minute par la suite. En cas de tachycardie ventriculaire ou de fibrillation, administrez jusqu’à deux autres chocs à 200 J après une minute d’évaluation du rythme après chaque choc.
REMARQUE : L’algorithme de défibrillation utilisé ici est pour un défibrillateur biphasique, les défibrillateurs monophasiques nécessiteront généralement moins d’énergie. Si d’autres rythmes cardiaques sont identifiés, la fibrillation auriculaire, l’AEP, etc., la défibrillation ne doit pas être tentée et l’animal doit être traité selon un protocole d’étude spécifique.
7. Perfusion périphérique
REMARQUE : Après une réanimation SAAP réussie selon le protocole de l’étude, le remplacement du volume peut être poursuivi en périphérie à l’aide du circuit SAAP.
- Clamp le membre de perfusion SAAP du membre de perfusion principal.
- Confirmez que le membre de perfusion périphérique du circuit SAAP est relié au bras latéral du cathéter dans la veine fémorale et que les robinets d’arrêt et la tubulure sont ouverts.
- Assurez-vous que le liquide de réanimation et le volume appropriés se trouvent dans le réservoir SAAP.
- Assurez-vous que la branche de recirculation du circuit SAAP est serrée.
- Infusez le fluide selon les besoins du protocole en réglant les paramètres de débit appropriés sur la pompe péristaltique.
8. Euthanasie
- À la fin de l’expérience, euthanasier l’animal en injectant >2 mmol/kg de chlorure de potassium dans une veine centrale et attendre 1 minute d’asystole.