Distinguer les cellules immunitaires intrapulmonaires des populations de cellules immunitaires intravasculaires : l’approche intrajugulaire

Résumé

L’objectif de la présente étude est de décrire un protocole permettant de différencier les cellules immunitaires intravasculaires et intraparenchymateuses dans les études sur l’inflammation pulmonaire. Nous utilisons une injection intrajugulaire d’un anticorps marqué fluorescent avant le prélèvement pulmonaire. De plus, nous utilisons un processus de digestion pulmonaire basé sur l’inflation pour améliorer le rendement des leucocytes pulmonaires.

Résumé

Les rythmes circadiens font référence aux oscillations dans divers processus biologiques qui se produisent sur une période de 24 heures. Au niveau moléculaire, ces rythmes sont constitués d’un réseau de boucles de rétroaction transcriptionnelle-translationnelle (TTFL) des gènes de l’horloge centrale. Les tissus et les systèmes organiques individuels, y compris le système immunitaire, ont leur propre horloge. Dans la circulation systémique, divers membres de la population CD45⁺ oscillent tout au long de la journée ; cependant, bon nombre de ces rythmes ne sont pas identiques ou même similaires dans la population de leucocytes CD45⁺ résidant dans les tissus. Lors de l’étude du rôle de la régulation circadienne de l’inflammation pulmonaire, il peut être nécessaire d’étudier les CD45⁺ dans les poumons. Cependant, malgré des méthodes de perfusion optimisées, les leucocytes piégés dans la circulation persistent dans les poumons. L’objectif de la conception de ce protocole était de faire la distinction entre les leucocytes intravasculaires et intraparenchymateux. À cette fin, des souris reçoivent une injection intrajugulaire d’un anticorps CD45 marqué par fluorescence peu de temps avant le prélèvement pulmonaire. Par la suite, le poumon est digéré à l’aide d’une technique de digestion pulmonaire personnalisée pour obtenir une suspension unicellulaire. L’échantillon est coloré pour le panel régulier d’anticorps contre les cellules immunitaires intraparenchymateuses (y compris un autre anticorps CD45). Les analyses par cytométrie en flux montrent une nette élucidation des populations. Ainsi, la méthode de marquage et de définition des cellules CD45⁺ intrapulmonaires sera particulièrement importante lorsque le comportement des cellules immunitaires intrapulmonaires et circulantes est numériquement et fonctionnellement distinct.

Introduction

Nous décrivons ici des méthodes efficaces et fiables pour différencier les leucocytes intravasculaires des leucocytes pulmonaires. Même avec les meilleures techniques de perfusion, des études ont révélé que les CD45⁺ résiduels de la circulation persistent dans les poumons. Cela altère la capacité de distinguer les rythmes de la circulation et des poumons. Cet effet est encore amplifié en cas d’inflammation pulmonaire. Ceci est particulièrement pertinent pour l’étude de la régulation circadienne de l’inflammation.

Les rythmes circadiens font référence aux oscillations diurnes dans divers processus biologiques qui se produisent sur une période de 24 h. Le système circadien est un mécanisme d’anticipation conservé au cours de l’évolution qui confère une protection à l’hôte lorsqu’il fait face à des changements dans son environnement, tels que la menace d’infections. Au niveau cellulaire, l’horloge est organisée en boucles de rétroaction transcriptionnelle-traductionnelle auto-entretenues comprenant les gènes de l’horloge centrale¹. Le système immunitaire a sa propre horloge qui affecte sa réponse aux agents pathogènes et aux agressions inflammatoires ^2,3. En tant qu’organe exposé en permanence à l’environnement, les rythmes circadiens sont particulièrement importants dans les poumons⁴. Divers processus immunitaires dans les poumons sont sous contrôle d’horloge ^5,6,7. Cependant, la phase des différents processus biologiques dans le poumon et la circulation systémique ne sont pas les mêmes⁸, ce qui, par extension, suggère également que les oscillations des leucocytes dans le poumon et la circulation peuvent ne pas être identiques. Ainsi, il sera essentiel de disposer d’une méthode permettant de distinguer efficacement les leucocytes pulmonaires et intravasculaires dans le contexte circadien.

Le but de cette étude était de concevoir une méthode capable de différencier de manière fiable les leucocytes intravasculaires et intraparenchymateux. Pour cela, nous avons utilisé une méthode de marquage des leucocytes intravasculaires et de digestion pulmonaire. Pour le marquage des leucocytes intravasculaires, nous utilisons l’injection intrajugulaire, qui cible un gros vaisseau sanguin et peut être utilisée de manière reproductible chez des souris de toutes souches et de toutes tailles. De nombreuses autres méthodes ont utilisé l’injection de la veine de la queue ^9,10, qui est notoirement plus difficile à réaliser chez les souris Bl6¹¹. L’injection intrajugulaire nécessite l’utilisation d’une anesthésie et est mieux effectuée sous visualisation directe avec un microscope à dissection ou des loupes grossissantes. Ainsi, la facilité et la fiabilité de l’injection intrajugulaire doivent être mises en balance avec la nécessité d’une anesthésie et d’un équipement spécial. Cependant, étant donné la disponibilité immédiate de ces équipements dans la plupart des laboratoires de recherche, nous ne considérons pas cela comme un facteur limitatif. Cependant, un examen au cas par cas semble prudent.

Protocole

Toutes les études sur les animaux ont été approuvées par le comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de Pennsylvanie et ont satisfait aux stipulations du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.

REMARQUE : L’ensemble du processus peut être divisé en 1) marquage CD45 par voie intraveineuse, 2) récolte, 3) digestion et 4) coloration et cytométrie en flux. Ces étapes ont été résumées à la figure 1.

1. Solutions/préparation des réactifs

1. Préparez le milieu de dissociation en ajoutant 5 ml de 2 mM de L-glutamine, 20 mL de sérum fœtal bovin (FBS), 1 mL de 2-mercaptoéthanol et 10 mL de Pen/Strep à 500 mL de DMEM.
   REMARQUE : Le milieu de dissociation est stable jusqu’à 2 mois lorsqu’il est stocké à 2-4 °C.
2. Préparez un tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) en ajoutant 10 ml de FBS et 500 mg d’azoture de sodium à 500 ml de PBS sans magnésium ni calcium.
   REMARQUE : Avec l’ajout d’azoture de sodium, le tampon FACS peut être stocké à 2-4 °C pendant des mois.
3. Le jour du prélèvement de l’échantillon, ajouter les solutions de DNase et de Liberase dans les milieux de dissociation à une dilution de 1:100 (c.-à-d. ajouter 10 μL de DNase et de Liberase pour 1 ml de milieu de dissociation).
   REMARQUE : Pour chaque souris, la digestion de l’ensemble du poumon nécessite 10 ml/souris et la moitié du poumon nécessite 5 ml/souris.

2. Marquage intraveineux du CD45

1. Pour cette expérience, utilisez des souris C57Bl6 adultes âgées de 8 à 12 semaines.
2. Anesthésie les souris avec les agents de leur choix. Une combinaison de xylazine et de kétamine a été utilisée à cette fin, mais d’autres agents sont également acceptables. L’objectif est d’obtenir un niveau d’anesthésie modéré à profond qui dure environ 5 à 10 minutes.
   REMARQUE : Le mélange d’anesthésie de xylazine et de kétamine est administré par voie intrapéritonéale. Utilisez 10 à 15 mg/kg de xylazine et 120 à 150 mg/kg de kétamine.
3. Une fois que le réflexe de la pédale est négatif, positionnez l’animal sur le dos et collez doucement ses membres pour garder la tête aussi centrale que possible.
4. Explicez la veine jugulaire et le muscle pectoral en soulevant la peau avec des pinces et en coupant avec des ciseaux chirurgicaux tranchants.
5. Injecter 200 μL d’anticorps anti-CD45 (anticorps de cytométrie en flux ; dilué 1:300 dans du PBS) dans la veine jugulaire à l’aide d’une aiguille de 28 G. Attendez 2 à 4 minutes pour que l’anticorps puisse circuler dans le système vasculaire.
   REMARQUE : Entrer par le muscle pectoral dans la veine jugulaire à partir d’un angle peu profond empêche les saignements considérables de se produire.
6. Par la suite, euthanasier l’animal en l’exposant au CO₂ pendant 10 minutes. Procéder à la perfusion pulmonaire et prélever les poumons et autres tissus.
   REMARQUE : Toute autre méthode d’euthanasie sans cruauté qui respecte les directives de l’AVMA pour l’euthanasie des animaux est également acceptable.

3. Dissection/récolte (figure 1)

1. Placez l’animal sur le dos sur une planche plate et épinglez les pattes vers le bas en gardant la tête centrale.
2. Vaporisez le corps avec de l’éthanol à 70 %. Ouvrez la cavité thoracique avec des pinces et des ciseaux pour exposer le poumon, le cœur et la trachée.
3. Perfuser le poumon en faisant une petite incision dans le ventricule gauche du cœur et en injectant 10 ml de PBS froid par le ventricule droit.
4. Coupez une ouverture dans la trachée et insérez une canule intraveineuse. Une fois la canule insérée, passez un cordon de suture d’environ 6 à 8 cm de long sous la trachée et attachez-le deux fois à la canule.
5. Rentrez le cordon chirurgical dans la canule et fixez-y une seringue contenant un milieu de dissociation (5 ml pour un demi-poumon ou 10 ml pour un poumon entier), comme illustré à la figure 1B.
6. Coupez doucement le poumon du reste du corps et placez la seringue avec le poumon attaché dans un tube conique de 50 ml.

4. Digestion en suspension unicellulaire

1. Incuber le poumon à 37 °C pendant 30 à 40 minutes, en instillant 1 ml (pour la moitié du poumon) ou 2 ml (pour tout le poumon) de Muscle de dissociation toutes les 5 minutes.
2. Une fois que tout le milieu est instillé, retirez la seringue et la canule, et placez le tube conique de 50 ml dans un bain-marie à 180 tr/min pour le reste de l’incubation pour un meilleur rendement.
   REMARQUE : Alternativement, les tubes peuvent être secoués manuellement toutes les 5 minutes.
3. Ajouter 10 ml de PBS et agiter vigoureusement pendant 1 minute pour arrêter la réaction.
4. Passez la solution à travers une crépine cellulaire (70 μm) dans un nouveau tube conique de 50 mL. À l’aide d’un bouchon en caoutchouc pour seringue de 5 ml, passez les amas de tissu dans la passoire. Ajouter du PBS de manière à ce que le volume final soit de 30 ml.
5. Centrifuger les échantillons pendant 10 minutes à 1 200 x g et 4 °C. Jetez le surnageant sans déranger la pastille. Pipeter toute solution restante.
6. Ajouter 1 mL de tampon de lyse des globules rouges (GR) et mélanger avec la pastille cellulaire par pipetage.
7. Incuber à température ambiante pendant 60 à 90 s. Ajouter du PBS de manière à ce que le volume final soit de 30 ml pour arrêter la réaction.
   REMARQUE : Le temps d’incubation dépend de la quantité de sang dans la pastille cellulaire ; Plus la pastille cellulaire est rouge, plus le temps d’incubation est long.
8. Centrifuger les échantillons pendant 10 minutes à 1 200 x g et 4 °C. Jetez le surnageant sans déranger la pastille. Pipeter toute solution restante.
9. Ajouter 1 mL de tampon FACs à la pastille de cellule et mélanger par pipetage.

5. Coloration des cellules pour la cytométrie en flux

1. Utilisez un compteur de cellules pour déterminer le nombre total de cellules dans la suspension de cellules.
2. Transférez la suspension cellulaire dans chaque tube FACS étiqueté de sorte qu’il y ait un total de 3 x 10⁶ cellules par échantillon.
3. Ajouter le bloc Fc (dilué 1:100) et incuber pendant 15 minutes sur de la glace.
4. Centrifugez les tubes pendant 5 minutes à 1 200 x g et 4 °C. Jetez le surnageant sans déranger la pastille.
5. Teindre les échantillons avec un mélange d’anticorps spécifié et incuber pendant 20 minutes sur de la glace à l’abri de la lumière (c.-à-d. en les recouvrant d’une feuille d’aluminium). Mélanger en soutirant les tubes contre le support de tube à mi-chemin de l’incubation.
6. Ajouter 1 mL de tampon FACS à laver et mélanger par pipetage.
7. Transférez la suspension cellulaire dans un autre tube FACS en pipetant lentement la suspension à travers une crépine de 35 μm.
8. Centrifugez les tubes pendant 5 minutes à 1 200 x g et 4 °C. Jetez le surnageant sans déranger la pastille.
9. Ajouter 150 μL de tampon FACS et mélanger par pipetage.
10. Ajoutez 10 μL de DAPI (1:100) dans chaque tube immédiatement avant de prélever les échantillons.
    REMARQUE : Les échantillons sont maintenant prêts à être analysés sur le cytomètre en flux.

Résultats

À l’aide de cette technique, le nombre total de cellules des poumons dissociés naïfs (seuls les lobes gauches ont été utilisés pour les données représentatives) se situait entre 27,3 x 10⁶ et 71,1 x 10⁶ cellules/ml. Après l’identification de la taille et l’élimination des doublets et des cellules mortes (schéma de contrôle de la figure 2), le nombre de leucocytes variait de 6,9 x 10⁶ à 13,5 x 10⁶ cellules/ml. Les leucocytes circulants qui restent p...

Discussion

Des études minutieuses de l’inflammation pulmonaire et des réponses immunitaires pulmonaires sont cruciales pour la compréhension de nombreuses maladies. La cytométrie en flux est couramment utilisée pour dénombrer et attribuer une pertinence fonctionnelle aux leucocytes pulmonaires. La fonction des leucocytes dépend au moins en partie de l’endroit où ils se trouvent. Bien qu’il y ait de plus en plus de preuves pour soutenir que même après des protocoles de perfusion parfaits, de nombreu...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Bain-marie Boekel Scientific	Medium Boekel Grant Scientific	290200
10 mL Seringues BD avec embout BD Luer-Lok	BD	309604
5 mL Seringues BD avec embout BD Luer-Lok	BD Biosciences	309646
Anti-CD45- Pac Blue	Biolegend	103114
Anti-CD45- Pe/Cy7	Biolegend	103114
Crépine à cellules 70 µ ; m Nylon	Fisher	352350
Tube à centrifuger à fond conique Corning 50 mL	Avantor	21008-714
Tube à essai Corning Falcon avec filtre cellulaire Snap Cap	à 10004637		EMSCO
Olympus		SZX-SDO2
DMEM, haute teneur en glucose	Life Technologies	11965084
Dnase	Roche
DPBS sans Ca++ & Mg++		14190136
Fc Block	Biolegend	101320
HyClone Sérum fœtal bovin	GE Healthcare	SH30071.03
L-Glutamine (200 mM)	Life Technologies	25030-081
Liberase Research Grade	Sigma	5401127001
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)	Life Technologies	15140-122
Bain d’eau à agitation de précision	Thermo Fisher	TSSWB15
Tampon de lyse des globules rouges	Sigma	R7757
Suture Soie 4-0	Roboz	SUT-15-2

Microscope dissection 10104159001