Construction de mutants dans la souche 519/43 de Streptococcus pneumoniae de sérotype 1

Résumé

Ici, nous décrivons une souche 519/43 de sérotype 1 de S. pneumoniae qui peut être génétiquement modifiée en utilisant sa capacité à acquérir naturellement de l’ADN et un plasmide suicide. Comme preuve de principe, un mutant isogénique dans le gène de la pneumolysine (pli) a été fabriqué.

Résumé

Streptococcus pneumoniae sérotype 1 reste un énorme problème dans les pays à revenu faible ou intermédiaire, en particulier en Afrique subsaharienne. Malgré son importance, les études sur ce sérotype ont été entravées par le manque d’outils génétiques pour le modifier. Dans cette étude, nous décrivons une méthode pour modifier génétiquement un isolat clinique de sérotype 1 (souche 519/43). Fait intéressant, cela a été réalisé en exploitant la capacité du pneumocoque à acquérir naturellement de l’ADN. Cependant, contrairement à la plupart des pneumocoques, l’utilisation de l’ADN linéaire n’a pas été couronnée de succès; Pour muter cette souche importante, un plasmide suicide a dû être utilisé. Cette méthodologie a permis de mieux comprendre ce sérotype insaisissable, tant sur le plan biologique que pathogénique. Pour valider la méthode, la principale toxine pneumococcique connue, la pneumolysine, a été mutée car elle a un phénotype bien connu et facile à suivre. Nous avons montré que le mutant, comme prévu, a perdu sa capacité à lyser les globules rouges. En étant capable de muter un gène important dans le sérotype d’intérêt, nous avons pu observer différents phénotypes de mutants de perte de fonction sur les infections intrapéritonéales et intranasales de ceux observés pour d’autres sérotypes. En résumé, cette étude prouve que la souche 519/43 (sérotype 1) peut être génétiquement modifiée.

Introduction

Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, le pneumocoque) est l’une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. Jusqu’à récemment, près de 100 sérotypes de S. pneumoniae ont été découverts 1,2,3,4,5,6,7. Chaque année, les pneumococcies invasives (IIP) font environ 700 000 morts chez les enfants de moins de 5 ans⁸. S. pneumoniae est la principale cause de pne....

Protocole

1. Génération de l’amplicon mutant par SOE-PCR²³ et amplification de la cassette de spectinomycine

1. Commencer par effectuer la PCR pour l’amplification des bras d’homologie (pli 5' (488 pb) et pli3' (715 pb) respectivement) des régions flanquantes du gène pli de la souche 519/43. Utilisez les amorces plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG), ply5'R1_BamHI (CGAAATATAGACCAAAGGACGC GGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA), ply3'F1_BamHI (TCAAGGTCAAGTTTGGTTCTGGATCC GCGTCCTTTGGTCTATATTTCG) et plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTCTACCTTATCCTCTACC).
2. Utiliser les conditions PCR suivantes pour le pli 5': dénaturat....

Résultats

Le protocole décrit ici commence par l’utilisation de la PCR pour amplifier les bras d’homologie gauche et droit, tout en supprimant simultanément 191 pb de la région médiane du gène du pli . Lors de l’exécution de la PCR, un site BamHI est introduit au 3' du bras d’homologie gauche et à l’extrémité 5' du bras d’homologie droit (Figure 1A). Ceci est suivi par PCR-SOE où les bras d’homologie gauche et droite sont fusionnés en un amplicon (Figure 1B). Cet.......

Discussion

Streptococcus pneumoniae, en particulier le sérotype 1, continue d’être une menace mondiale causant des pneumococcies invasives et la méningite. Malgré l’introduction de divers vaccins qui devraient protéger contre le sérotype 1, en Afrique, ce sérotype est encore capable de provoquer des épidémies entraînant une morbidité et une mortalité élevées¹³. La capacité de manipuler génétiquement ce sérotype est d’une importance cruciale en raison de sa pertinence clinique. La méthode décrite dan.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
AccuPrime Pfx ADN polymérase	Invitrogen	12344024	Utilisé pour l’amplification des fragments
Ampicilline sel sodique	Sigma Aldrich	A9518	Utilisé pour la sélection bactérienne au stade 1 (pSD1)
Gélose sanguine Base	Oxoid	CM0055	Utilisé pour plaquer S. pneumoniae transformants
Sérum bovin Albumine	sigma	55470	utilisé pour S. pneumoniae Transformation
Cerveau Cœur Perfusion	Oxoid	CM1135	utilisé pour la croissance S. pneumoniae
Chlorure de calcium Cacl2	Sigma	449709	utilisé pour S. pneumoniae Transformation
Compétence stimulant peptide 1	AnaSpec	AS-63779	utilisé pour S. pneumoniae Transformation
l’agar-gélose au bouillon Luria	Gibco	22700025	utilisé pour le placage et la sélection de la base de bouillon Luria pSD1 et pSD2
(formulation de Miller)	Gibco	12795027	utilisé pour le placage et la sélection du kit d’extraction de gel de monarque pSD1 et pSD2
	NEB	T1020S	Utilisé pour extraire les bandes du plasmide de monarque de gel d’ADN
Miniprep Kit	NEB	T1010S	Utilisé pour extraire le plasmide des cellules
pGEM T-easy	Promega	A1360	utilisé comme plasmide suicide
S.O.C.	Invitrogen	15544034	utilisé pour la récupération des cellules après transformation
Hydroxyde de sodium (NaOH)	Sigma	S0899	utilisé pour S.pneumoniae Transformation
Chlorhydrate de spectinomycine	SigmaAldrich	PHR1426	Utilisé pour la sélection bactérienne
Efficacité de sous-clonage DH5&alpha ; Cellules	Invitrogen	18265017	utilisées pour la création de pSD1 et pSD2