Dissection microchirurgicale et nettoyage des tissus pour une imagerie haute résolution de la rétine entière intacte et du vitré

Résumé

Voici un protocole d’imagerie de la rétine entière intacte dans lequel les couches externes opaques/pigmentées du globe oculaire sont enlevées chirurgicalement et un dégagement optique est appliqué pour rendre la rétine transparente, permettant la visualisation de la rétine périphérique et du système vasculaire hyaloïde dans la rétine intacte à l’aide de la microscopie fluorescente à feuillet de lumière.

Résumé

Les structures neuronales et vasculaires de la rétine dans des conditions physiologiques et pathologiques peuvent être mieux visualisées et caractérisées en utilisant des techniques d’imagerie de la rétine entière intacte par rapport aux préparations et coupes conventionnelles de montage plat de la rétine. Cependant, l’imagerie immunofluorescente de la rétine entière intacte est entravée par les revêtements opaques du globe oculaire, c’est-à-dire la sclère, la choroïde et l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR), ainsi que par les propriétés de diffusion de la lumière des couches rétiniennes qui empêchent l’imagerie optique haute résolution sur toute l’épaisseur. Le blanchiment chimique des couches pigmentées et les protocoles de nettoyage des tissus ont été décrits pour surmonter ces obstacles ; cependant, les méthodes actuellement décrites ne conviennent pas à l’imagerie de molécules fluorescentes endogènes telles que la protéine fluorescente verte (GFP) dans une rétine entière intacte. D’autres approches ont contourné cette limitation en enlevant chirurgicalement les couches pigmentées et le segment antérieur du globe oculaire, permettant une imagerie oculaire intacte, bien que les structures périphériques de la rétine et hyaloïdes aient été perturbées. Voici un protocole d’imagerie immunofluorescente de la rétine entière intacte et du vitré qui combine la dissection chirurgicale des couches de la sclérotique, de la choroïde et de l’épithélium pigmentaire de la rétine (EPR) avec une méthode modifiée de clarification des tissus et la microscopie fluorescente à feuillet de lumière (LSFM). La nouvelle approche offre une vue sans précédent des éléments vasculaires et neuronaux non perturbés de la rétine ainsi que du système vasculaire vitré et hyaloïde dans des conditions pathologiques.

Introduction

L’interaction entre les éléments rétiniens, neuronaux et vasculaires dans les états sains et pathologiques est traditionnellement explorée par des études immunofluorescentes sur des coupes physiques de tissu rétinien fixé en paraffine ou cryo-fixé ou sur des préparations plates de rétine¹. Cependant, la section tissulaire perturbe la continuité neuronale et vasculaire de la rétine, et bien que la reconstruction tridimensionnelle des coupes de rétine adjacentes soit suggérée comme une solution possible, elle est toujours sujette à des erreurs et des artefacts. Les préparations de montage plat de la rétine pertur....

Protocole

Toutes les expériences ont été approuvées par le comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) de la branche médicale de l’Université du Texas. L’utilisation et les soins aux animaux étaient conformes à la déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) concernant l’utilisation d’animaux dans la recherche en ophtalmologie et sur la vision. Tous les matériaux nécessaires à la réalisation de cette procédure sont répertoriés dans la table des matériaux. Portez des gants non poudrés lors de chaque étape. Pour les étapes 6 et 7, reportez-vous également au manuel d’uti....

Résultats

Une projection à angle zéro du réseau vasculaire péripapillaire et de la microglie est illustrée à la figure 3A. De plus, la distribution intacte de la microglie de la rétine entière chez une souris CX3CR1-GFP est présentée à la figure 3B. Un avantage majeur de la méthode présentée ici, est sa capacité à imager des fluorophores innés. Les figures 3C, D montrent la microglie dans des projections Z représen.......

Discussion

Le développement et les pathologies de la rétine et du vitré sont mieux étudiés avec des techniques d’imagerie de la rétine entière intacte dans lesquelles la rétine n’est pas coupée pour des coupes ou pour des préparations à montage plat. Les méthodes d’imagerie de l’œil entier intactes existantes intègrent soit le blanchiment pigmentaire, qui élimine les fluorophores innés, soit l’élimination physique des revêtements opaques du globe oculaire (EPR, choroïde et sclère) ainsi que du segm.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Experimental animal
CX3CR1-GFP Souris	The Jackson Laboratory	5582
Anesthetic
Dexmedetomidine	Par Pharmaceutical	42023-146-25
Kétamine	Fresenius Kabi
Pompe à perfusion Collecte de tissus, fixation et dissection d’échantillons
cardiaque	Fisher	scientific NC9069235
Superglue cyanoacrylate	amazon.com
Ciseaux fins - tranchants	Outils scientifiques fins	14160-10
Pince à épiler fine	Outils scientifiques fins	11412-11
Paraformaldéhyde (PFA)	Microscopie électronique sciences	15710-S
Saline tamponnée au phosphate (PBS)	Gibco	10010049
taille 1	dickblick.com
ciseaux à ressort droits	Fine Science Tools	15000-03
seringue, pointe d’aiguille, calibre 27 x 1,25	Tubes BD
1,5 ml, 15 ml, 50 ml	Thermo sceintific
Tween-20	ThermoFisher	85114
Coloration immunofluorescente
Anticorps anti-collagène IV de souris	Abcam	ab19808	dilution 1:200
Anti-lapin Alexa Fluor 568	Invitreogène	A-11011	dilution 1:200
Chèvre normale sérum	ThermoFisher	50062Z	10 % concentration
Clearing tissulaire
2,2&prime ;-thiodiethanol (TDE)	Fluka analytica	STBD7772V
Rocking	shaker Fisher scientific	02-217-765
Microscopy
Microsphères fluorescentes	TetraSpeck	T14792
Microscope fluorescent à feuillet de lumière (LSFM)	Zeiss	Z1
Énumération de la microglie
ImageJ	Institut national de la santé