Article de méthode

Dissection microchirurgicale et nettoyage des tissus pour une imagerie haute résolution de la rétine entière intacte et du vitré

DOI :

10.3791/61595

⸱

11 mars 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Neuroscience, University of Minnesota, 2Department of Neuroscience, Cell Biology, and Anatomy, University of Texas Medical Branch, 3Biomedical Engineering and Imaging Sciences Group, University of Texas Medical Branch, 4Department of Ophthalmology, University of Texas Medical Branch

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voici un protocole d’imagerie de la rétine entière intacte dans lequel les couches externes opaques/pigmentées du globe oculaire sont enlevées chirurgicalement et un dégagement optique est appliqué pour rendre la rétine transparente, permettant la visualisation de la rétine périphérique et du système vasculaire hyaloïde dans la rétine intacte à l’aide de la microscopie fluorescente à feuillet de lumière.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les structures neuronales et vasculaires de la rétine dans des conditions physiologiques et pathologiques peuvent être mieux visualisées et caractérisées en utilisant des techniques d’imagerie de la rétine entière intacte par rapport aux préparations et coupes conventionnelles de montage plat de la rétine. Cependant, l’imagerie immunofluorescente de la rétine entière intacte est entravée par les revêtements opaques du globe oculaire, c’est-à-dire la sclère, la choroïde et l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR), ainsi que par les propriétés de diffusion de la lumière des couches rétiniennes qui empêchent l’imagerie optique haute résolution sur toute l’épaisseur. Le blanchiment chimique des couches pigmentées et les protocoles de nettoyage des tissus ont été décrits pour surmonter ces obstacles ; cependant, les méthodes actuellement décrites ne conviennent pas à l’imagerie de molécules fluorescentes endogènes telles que la protéine fluorescente verte (GFP) dans une rétine entière intacte. D’autres approches ont contourné cette limitation en enlevant chirurgicalement les couches pigmentées et le segment antérieur du globe oculaire, permettant une imagerie oculaire intacte, bien que les structures périphériques de la rétine et hyaloïdes aient été perturbées. Voici un protocole d’imagerie immunofluorescente de la rétine entière intacte et du vitré qui combine la dissection chirurgicale des couches de la sclérotique, de la choroïde et de l’épithélium pigmentaire de la rétine (EPR) avec une méthode modifiée de clarification des tissus et la microscopie fluorescente à feuillet de lumière (LSFM). La nouvelle approche offre une vue sans précédent des éléments vasculaires et neuronaux non perturbés de la rétine ainsi que du système vasculaire vitré et hyaloïde dans des conditions pathologiques.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’interaction entre les éléments rétiniens, neuronaux et vasculaires dans les états sains et pathologiques est traditionnellement explorée par des études immunofluorescentes sur des coupes physiques de tissu rétinien fixé en paraffine ou cryo-fixé ou sur des préparations plates de rétine1. Cependant, la section tissulaire perturbe la continuité neuronale et vasculaire de la rétine, et bien que la reconstruction tridimensionnelle des coupes de rétine adjacentes soit suggérée comme une solution possible, elle est toujours sujette à des erreurs et des artefacts. Les préparations de montage plat de la rétine perturbent également de manière marquée l’intégrité des éléments vasculaires et neuronaux de la rétine et la connexion géographique entre les zones rétiniennes adjacentes2. Alternativement, l’imagerie de la rétine entière intacte a récemment été introduite pour visualiser les projections tridimensionnelles des composants neuronaux et vasculaires de la rétine dans leur position anatomique naturelle 2,3,4,5.

Dans l’imagerie de la rétine entière intacte, les signaux fluorescents des éléments vasculaires et neuronaux des zones rétiniennes adjacentes (tuiles) d’une rétine entière intacte sont capturés à l’aide d’un microscope à feuillet de lumière ; Ces tuiles sont ensuite « cousues » ensemble pour reconstruire une vue tridimensionnelle de l’ensemble de la rétine 2,3,4,5,6. L’imagerie de la rétine entière intacte fournit une vue sans précédent de la rétine pour l’étude de la pathogenèse des maladies vasculaires, dégénératives et inflammatoires rétiniennes 2,3,4,5,6. Par exemple, Prahst et al. ont révélé une morphologie nouée auparavant « non appréciée » de touffes vasculaires pathologiques, une motilité cellulaire anormale et une dynamique de filopodie altérée dans un modèle de rétinopathie induite par l’oxygène (OIR) en utilisant l’imagerie en direct d’une rétine entière intacte2. De même, Henning et al., Singh et al., et Chang et al. ont démontré le réseau vasculaire rétinien tridimensionnel complexe dans des rétines entières intactes 3,4,6. Vigouroux et al. ont utilisé une méthode d’imagerie de l’œil entier intact pour montrer l’organisation de la rétine et les projections visuelles dans la période périnatale5. Afin de pouvoir créer des vues tridimensionnelles de la rétine sans pareil, les protocoles d’imagerie de la rétine entière intacte ont surmonté deux limitations majeures : 1) la présence de revêtements opaques et pigmentés du globe oculaire (sclère, choroïde et EPR) et 2) la pénétration limitée de la lumière à travers toute l’épaisseur de la rétine causée par les propriétés de diffusion de la lumière des couches nucléaires et plexiformes de la rétine. Henning et al. et Vigouroux et al. ont appliqué un blanchiment H2O2 des pigments choroïdes/EPR afin de pouvoir imager une rétine intacte 3,5. Cependant, le blanchiment ne convient pas aux souches animales avec des fluorophores endogènes tels que la protéine fluorescente verte (GFP) ou après des colorations immunofluorescentes in vivo 3,5,7. De plus, la méthode de traitementH2O2 de Henning et al. a été réalisée dans des conditions aqueuses qui peuvent générer des microbulles entraînant un décollement de la rétine. De plus, le traitementH2O2 a été effectué à 55 °C, une condition qui détériore encore l’affinité tissulaire des anticorps. De plus, le blanchiment peut introduire une forte autofluorescence provenant de la mélanine8 oxydée. D’autres protocoles de dépigmentation pour les sections oculaires utilisant du permanganate de potassium et de l’acide oxalique ont permis d’éliminer les pigments EPR dans les coupes embryonnaires, mais il a également été démontré que cette méthode de dépigmentation réduit l’efficacité de l’immunomarquage 9,10. Comme alternative au blanchiment, Prahst et al., Singh et al., et Chang et al. ont enlevé la sclérotique, la choroïde et la cornée pour rendre une rétine entière accessible à la lumière du microscope 2,4,6. Cependant, l’ablation de la cornée, du cristallin et de la rétine périphérique peut déformer et perturber la rétine périphérique et les vaisseaux hyaloïdes, ce qui rend ces méthodes inadaptées à l’étude de la rétine périphérique et du système vasculaire hyaloïde.

Tous les protocoles d’imagerie de l’œil entier intact actuellement disponibles incluent l’utilisation d’une étape de nettoyage optique des tissus pour surmonter les propriétés de diffusion de la lumière des couches rétiniennes 2,3,4,5. Le nettoyage optique tissulaire rend la rétine transparente à la lumière du microscope en égalisant l’indice de réfraction d’un tissu donné, ici la rétine, à travers tous ses éléments cellulaires et intercellulaires afin de minimiser la diffusion et l’absorption de la lumière11. La choroïde et l’EPR doivent être enlevées ou blanchies avant l’application d’un nettoyage optique tissulaire sur la rétine, car les revêtements pigmentés du globe oculaire (choroïde et EPR) ne peuvent pas être suffisamment éliminés 6,12,13,14,15,16,17,18.

La participation et les contributions du système vasculaire vitré et hyaloïde dans des conditions pathologiques telles que la rétinopathie du prématuré (RDP), la vascularisation fœtale persistante (PFV), la maladie de Norrie et la maladie de Stickler sont mieux étudiées lorsque la rétine et les vaisseaux hyaloïdes ne sont pas perturbés dans la préparation des tissus 19,20,21,22,23. Les méthodes existantes pour l’imagerie de la rétine entière intacte enlèvent le segment antérieur de l’œil, ce qui perturbe naturellement le vitré et son système vasculaire, ou appliquent des agents de blanchiment, qui peuvent éliminer les fluorophores endogènes. Il n’existe pas de méthodes publiées pour visualiser le corps vitré et le système vasculaire dans leur état intact et intact. Nous décrivons ici une méthode d’imagerie complète de la rétine et du vitré qui consiste en une dissection chirurgicale de revêtements pigmentés et opaques du globe oculaire, une clarification optique tissulaire modifiée optimisée pour la rétine et une microscopie fluorescente à feuillet de lumière. Les étapes de préparation des échantillons, de clarification optique des tissus, de microscopie à feuille de lumière et de traitement d’images sont détaillées ci-dessous.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les expériences ont été approuvées par le comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) de la branche médicale de l’Université du Texas. L’utilisation et les soins aux animaux étaient conformes à la déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) concernant l’utilisation d’animaux dans la recherche en ophtalmologie et sur la vision. Tous les matériaux nécessaires à la réalisation de cette procédure sont répertoriés dans la table des matériaux. Portez des gants non poudrés lors de chaque étape. Pour les étapes 6 et 7, reportez-vous également au manuel d’utilisation officiel du microscope.

1. Préparation des animaux

  1. Euthanasier les souris expérimentales conformément au protocole applicable approuvé par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (une anesthésie avec une combinaison de kétamine 60 mg/kg et de dexmédétomidine 0,5 mg/kg suivie d’une luxation cervicale a été utilisée ici). Procéder immédiatement à la stabilisation de l’animal sur une plate-forme de dissection et de perfusion cardiaque.
    REMARQUE : Les animaux de laboratoire sont choisis en fonction de la conception de l’étude individuelle.
  2. Disséquez l’abdomen et le thorax pour exposer le cœur. Effectuez la perfusion cardiaque en transfusant le cœur à l’aide d’une aiguille de 27 G placée dans le ventricule gauche et créez une petite incision (~1 mm) dans l’oreillette droite pour permettre la sortie du sang24.
    1. Tout d’abord, transfuser 30 à 50 ml de solution saline équilibrée au phosphate (PBS) glacée, puis 30 à 50 ml de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) fraîchement préparé.
    2. Pour vérifier si une transfusion de PFA a réussi, vérifiez la présence de contractions musculaires visibles dans tout le corps et la queue. Passez à l’étape de l’énucléation.

2. Énucléation et fixation du globe oculaire

  1. À l’aide d’une pince de bijoutier incurvée, poussez doucement sur la paupière supérieure ou inférieure pour forcer le globe oculaire à sortir de son orbite. Utilisez une autre pince de bijoutier ou similaire pour percer la conjonctive sur le côté et tenir le globe du côté du nerf optique. Soulevez lentement le globe de sa cavité jusqu’à ce qu’il soit séparé du nerf optique.
  2. Transférez le globe dans un tube contenant du PFA glacé à 4 % fraîchement préparé. Étiquetez le tube en conséquence. Laisser le globe conserver dans 4 % de PFA dans un réfrigérateur à 4 °C pendant 12 h (toute la nuit).
    REMARQUE : Utilisez une pipette de transfert en plastique avec une pointe coupée pour transférer le globe. Élargissez l’ouverture de la pointe coupée avec une deuxième pointe de pipette pour éviter d’endommager l’échantillon avec des arêtes vives.

3. Dissection de l’échantillon (Figure 1 et Figure 2)

  1. Au stéréomicroscope, localisez la jonction cornée-sclérotique (figure 1A) et, à l’aide de la pointe tranchante d’une aiguille de 30 G, faites une incision très superficielle au niveau de la sclérotique à environ 0,5 à 1 mm en arrière de la jonction cornée-sclérotique (figure 1B).
  2. Avancez l’une des lames d’une pointe pointue en disséquant des ciseaux à travers l’incision qui vient d’être pratiquée dans l’espace potentiel entre la sclère/choroïde/EPR et la rétine (Figure 1C). Avancez les ciseaux et coupez circonférentiellement jusqu’à ce que la sclère/choroïde/EPR puisse être décollée de la surface externe de la rétine (Figure 1D,E).
    REMARQUE : Il est important d’effectuer cette étape lentement et doucement pour éviter de percer la rétine. Les premières coupures sont particulièrement critiques pour éviter de couper la rétine.
  3. Si nécessaire, faites des coupes radiales relaxantes sur la sclère/choroïde/EPR pour faciliter le processus de coupe circonférentielle et le pelage ultérieur du nerf optique et de la sclérotique/choroïde/EPR. Retirez les petites taches d’EPR (figure 1F) à l’aide d’un pinceau de taille 1 imbibé de PBS.
  4. Transférez l’ensemble du globe oculaire intact dans un tube contenant du PBS. Passer immédiatement à l’étape suivante ou conserver à 4 °C pour l’immunomarquage.
    REMARQUE : Des marques peuvent être placées sur le globe oculaire après l’énucléation, puis après la dissection pour préserver l’orientation de l’œil si nécessaire. Le protocole peut être interrompu ici, et les échantillons peuvent être conservés toute la nuit dans un réfrigérateur à 4 °C avant de passer aux étapes suivantes.

4. Coloration vasculaire

  1. Perméabiliser le tissu en l’immergeant dans du PBS contenant 0,2 % de Tween-20 à température ambiante pendant 20 min.
  2. Lavez l’échantillon avec du PBS 3 fois sur un agitateur pendant 10 min.
  3. Incuber l’échantillon avec 5 % de sérum de chèvre normal (NGS) dans du PBS contenant 0,25 % de Triton X-100 à température ambiante pendant 1 h.
  4. Incuber avec l’anticorps primaire à 4 °C pendant la nuit. Ici, un anticorps anti-collagène IV de souris a été utilisé (la concentration finale a été préparée dans du PBS contenant 0,2 % de Tween-20).
  5. Laver 3 fois avec du PBS, pendant 5 min par lavage.
  6. Incuber l’échantillon avec des anticorps secondaires marqués par fluorescence. Ici, un anti-lapin Alexa Fluor 568 a été utilisé pendant 12 h à 4 °C (dilution 1:200 dans du PBS contenant 0,2 % de Tween-20).
  7. Lavez avec du PBS 3 fois, pendant 1 h chacune, puis procédez aux étapes de nettoyage des tissus.

5. Compensation optique avec du 2,2′-thiodiéthanol (TDE)

  1. Préparer les concentrations de TDE de travail en utilisant une solution mère de TDE avec du PBS pour une concentration finale de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % et 60 % de volume à volume (v/v). Préparez au moins 2 ml de solution pour chaque échantillon d’œil afin de permettre à l’excès de volume de pénétrer dans le tissu.
  2. Incuber les échantillons dans une plaque à 6 ou 12 puits à une concentration croissante de TDE. Commencez par immerger les globes oculaires entiers intacts dans une solution de TDE à 10 % pendant 2 à 4 h sur un agitateur à température ambiante. Transférer successivement l’échantillon à une concentration plus élevée de TDE pendant 2 à 4 h pour chaque concentration de TDE (figure 2C).
    REMARQUE : La rétine commence à s’éclaircir à des concentrations de 40 à 50 %, mais l’éclaircissement maximal se produit après l’incubation dans une solution à 60 %. La rétine devient moins transparente à des concentrations de 70 % et plus (figure 2D).
  3. Arrêtez le processus de compensation pendant la nuit, si nécessaire, à l’une des étapes successives d’échange de compensation.

6. Imagerie de l’œil entier à l’aide d’une microscopie à feuillet de lumière

  1. Monter les échantillons entiers intacts en tenant compte de la configuration de la plate-forme de microscope à feuillet de lumière utilisée. Suivez les instructions du microscope et du logiciel d’acquisition pour configurer les paramètres d’acquisition, y compris l’alignement de la feuille de lumière, l’éclairage et la détection des chemins optiques.
    REMARQUE : Les échantillons utilisés dans cette expérience ont été collés du côté de la cornée à l’extrémité d’une aiguille hypodermique sur une seringue à insuline (figure 2E). L’échantillon a ensuite été suspendu à l’intérieur de la chambre du microscope.
  2. Remplissez la chambre du microscope avec 60 % de TDE comme solution de clarification.
  3. Immerger l’échantillon dans la chambre du microscope à feuillet de lumière dans une solution TDE à 60 % (concentration finale de clarification).
  4. Imagez l’œil dégagé au moyen d’une variété de microscopes confocaux et à feuillet de lumière commerciaux ou personnalisés. Dans ce protocole, un microscope à feuillet de lumière à éclairage double face est utilisé.
  5. Utilisez l’imagerie à faible résolution et à faible grossissement (5x, NA 0,16) pour imager la morphologie cellulaire et le traçage des processus cellulaires, en particulier lorsqu’elle est associée à la mosaïque. Utilisez l’imagerie à haute résolution et à grossissement (20x, NA 1.0) pour imager à la fois la morphologie cellulaire et les grands organites subcellulaires tels que les noyaux et les amas mitochondriaux.

7. Traitement d’image post-acquisition

REMARQUE : Le traitement post-acquisition dépend du type de fichier et du logiciel compatible avec les fichiers imagés.

  1. Appliquez un floutage ou une déconvolution pour augmenter davantage les images brutes avant d’assembler les tuiles imagées. Un filtre Weiner peut être appliqué pour déflouter les images. Alternativement, les images peuvent être déconvolutées de manière itérative après débruitage avec la déconvolution de Richardson-Lucy et une PSF théorique ou mesurée expérimentalement à l’aide d’outils de modélisation tels que le plugin ImageJ PSFgenerator 25.
  2. Effectuez l’assemblage de piles z prétraitées et des transformations de volumes affines et non rigides, suivies de l’enregistrement et de la fusion de volumes multi-vues à l’aide d’une variété de progiciels commerciaux ou du domaine public (ImageJ – plug-in BigStitcher)26.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une projection à angle zéro du réseau vasculaire péripapillaire et de la microglie est illustrée à la figure 3A. De plus, la distribution intacte de la microglie de la rétine entière chez une souris CX3CR1-GFP est présentée à la figure 3B. Un avantage majeur de la méthode présentée ici, est sa capacité à imager des fluorophores innés. Les figures 3C, D montrent la microglie dans des projections Z représen...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le développement et les pathologies de la rétine et du vitré sont mieux étudiés avec des techniques d’imagerie de la rétine entière intacte dans lesquelles la rétine n’est pas coupée pour des coupes ou pour des préparations à montage plat. Les méthodes d’imagerie de l’œil entier intactes existantes intègrent soit le blanchiment pigmentaire, qui élimine les fluorophores innés, soit l’élimination physique des revêtements opaques du globe oculaire (EPR, choroïde et sclère) ainsi que du segm...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aucun conflit d’intérêts commercial pertinent.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été effectué à la branche médicale de l’Université du Texas. Les auteurs apprécient Harald
Junge, PhD, Debora Ferrington, PhD, et Heidi Roehrich, Université du Minnesota pour leur aide dans la préparation de la figure 1 et du film 2. LO a été soutenu par la subvention de formation NIEHS T32 T32ES007254.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Experimental animal
CX3CR1-GFP SourisThe Jackson Laboratory5582
Anesthetic
DexmedetomidinePar Pharmaceutical42023-146-25
KétamineFresenius Kabi
Pompe à perfusion Collecte de tissus, fixation et dissection d’échantillons
cardiaqueFisherscientific NC9069235
Superglue cyanoacrylateamazon.com
Ciseaux fins - tranchantsOutils scientifiques fins14160-10
Pince à épiler fineOutils scientifiques fins11412-11
Paraformaldéhyde (PFA)Microscopie électronique sciences15710-S
Saline tamponnée au phosphate (PBS)Gibco10010049
taille 1dickblick.com
ciseaux à ressort droitsFine Science Tools15000-03
seringue, pointe d’aiguille, calibre 27 x 1,25Tubes BD
1,5 ml, 15 ml, 50 mlThermo sceintific
Tween-20ThermoFisher85114
Coloration immunofluorescente
Anticorps anti-collagène IV de sourisAbcamab19808dilution 1:200
Anti-lapin Alexa Fluor 568InvitreogèneA-11011dilution 1:200
Chèvre normale sérumThermoFisher50062Z10 % concentration
Clearing tissulaire
2,2&prime ;-thiodiethanol (TDE)Fluka analyticaSTBD7772V
Rockingshaker Fisher scientific02-217-765
Microscopy
Microsphères fluorescentesTetraSpeckT14792
Microscope fluorescent à feuillet de lumière (LSFM)ZeissZ1
Énumération de la microglie
ImageJInstitut national de la santé
Pinceau à peinture "

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Usui, Y., et al. Neurovascular crosstalk between interneurons and capillaries is required for vision. Journal of Clinical Investigation. 125, 2335-2346 (2015).
  2. Prahst, C., et al. Mouse retinal cell behaviour in space and time using light sheet fluorescence microscopy. eLife. 9, 49779(2020).
  3. Henning, Y., Osadnik, C., Malkemper, E. P. EyeCi: Optical clearing and imaging of immunolabeled mouse eyes using light-sheet fluorescence microscopy. Experimental Eye Research. 180, 137-145 (2019).
  4. Chang, C. C., et al. Selective Plane Illumination Microscopy and Computing Reveal Differential Obliteration of Retinal Vascular Plexuses. bioRxiv. , (2020).
  5. Vigouroux, R. J., César, Q., Chédotal, A., Nguyen-Ba-Charvet, K. T. Revisiting the role of DCC in visual system development with a novel eye clearing method. eLife. 9, 51275(2020).
  6. Singh, J. N., Nowlin, T. M., Seedorf, G. J., Abman, S. H., Shepherd, D. P. Quantifying three-dimensional rodent retina vascular development using optical tissue clearing and light-sheet microscopy. Journal of Biomedical Optics. 22, 076011(2017).
  7. Kim, S. Y., Assawachananont, J. A new method to visualize the intact subretina from retinal pigment epithelium to retinal tissue in whole mount of pigmented mouse eyes. Translational Vision Science and Technology. 5, 1-8 (2016).
  8. Kayatz, P., et al. Oxidation causes melanin fluorescence. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 42, 241-246 (2001).
  9. Iwai-Takekoshi, L., et al. Retinal pigment epithelial integrity is compromised in the developing albino mouse retina. Journal of Comparative Neurology. 524, 3696-3716 (2016).
  10. Alexander, R. A., Cree, I. A., Foss, A. J. The immunoalkaline phosphatase technique in immunohistochemistry: the effect of permanganate-oxalate melanin bleaching upon four final reaction products. British Journal of Biomedical Science. 53, 170-171 (1996).
  11. Ueda, H. R., et al. Whole-Brain Profiling of Cells and Circuits in Mammals by Tissue Clearing and Light-Sheet Microscopy. Neuron. 106, 369-387 (2020).
  12. Hillman, E. M. C., Voleti, V., Li, W., Yu, H. Light-Sheet Microscopy in Neuroscience. Annual Review of Neuroscience. 42, 295-313 (2019).
  13. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method. Cell Research. 28, 803-818 (2018).
  14. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  15. Hohberger, B., Baumgart, C., Bergua, A. Optical clearing of the eye using the See Deep Brain technique. Eye. 31, London, England. 1496-1502 (2017).
  16. Kuwajima, T., et al. ClearT: A detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development (Cambridge). 140, 1364-1368 (2013).
  17. Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biology. 14, 48(2014).
  18. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13, 859-867 (2016).
  19. Hegde, S., Srivastava, O. Different gene knockout/transgenic mouse models manifesting persistent fetal vasculature: Are integrins to blame for this pathological condition. Life Sciences. 171 (15), 30-38 (2016).
  20. Hartnett, M. E., Penn, J. S. Mechanisms and Management of Retinopathy of Prematurity. New England Journal of Medicine. 367, 2515-2526 (2012).
  21. Pierce, E. A., Foley, E. D., Smith, L. E. H. Regulation of vascular endothelial growth factor by oxygen in a model of retinopathy of prematurity. Archives of Ophthalmology. 114, 1219-1228 (1996).
  22. Ash, J., McLeod, D. S., Lutty, G. A. Transgenic expression of leukemia inhibitory factor (LIF) blocks normal vascular development but not pathological neovascularization in the eye. Molecular Vision. 11, 298-308 (2005).
  23. Reichel, M. B., et al. High frequency of persistent hyperplastic primary vitreous and cataracts in p53-deficient mice. Cell Death and Differentiation. 5, 156-162 (1998).
  24. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), 3564(2012).
  25. Kirshner, H., Aguet, F., Sage, D., Unser, M. 3-D PSF fitting for fluorescence microscopy: Implementation and localization application. Journal of Microscopy. 249, 13-25 (2013).
  26. Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nature Methods. 16, 870-874 (2019).
  27. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chemical Biology. 23, 137-157 (2016).
  28. Tian, B., et al. Efficacy of novel highly specific bromodomain-containing protein 4 inhibitors in innate inflammation–driven airway remodeling. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 60, 68-83 (2019).
  29. Zaman, R. T., et al. Changes in morphology and optical properties of sclera and choroidal layers due to hyperosmotic agent. Journal of Biomedical Optics. 16, 077008(2011).
  30. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
  31. Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159, 896-910 (2014).
  32. Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5, 9808(2015).
  33. Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. A rapid optical clearing protocol using 2,2'-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain. PLoS One. 10, 0116280(2015).
  34. Icha, J., et al. Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development. Journal of Visualized Experiments. (110), e53966(2016).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Microscopie feuille de lumi redissection de la scl rede la choro de et de l EPRimagerie vasculaire r tinienneimagerie des structures neuronalesimagerie par fluorescence endog neimagerie de la r tine GFPr tine haute r solution
Vidéo bientôt disponible

Articles connexes