Article de méthode

Criblage à haut débit des composés chimiques pour élucider leurs effets sur la persistance bactérienne

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DOI :

10.3791/61597

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23 février 2021

 , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Houston

Dans cet article

Résumé

Dans ce document de méthode, nous présentons une stratégie de criblage à haut débit pour identifier les composés chimiques, tels que les osmolytes, qui ont un impact significatif sur la persistance bactérienne.

Résumé

Les bactéries persistantes sont définies comme une petite sous-population de variantes phénotypiques ayant la capacité de tolérer des concentrations élevées d’antibiotiques. Ils constituent un problème de santé important, car ils ont été associés à des infections chroniques récurrentes. Bien que la dynamique stochastique et déterministe des mécanismes liés au stress soit connue pour jouer un rôle significatif dans la persistance, les mécanismes sous-jacents au passage phénotypique à/de l’état de persistance ne sont pas complètement compris. Bien que les facteurs de persistance déclenchés par les signaux environnementaux (p. ex. épuisement des sources de carbone, d’azote et d’oxygène) aient fait l’objet d’études approfondies, les effets des osmolytes sur la persistance n’ont pas encore été déterminés. À l’aide de puces à ADN (c.-à-d. 96 plaques de puits contenant divers produits chimiques), nous avons conçu une approche pour élucider les effets de divers osmolytes sur la persistance d’Escherichia coli de manière à haut débit. Cette approche est transformatrice car elle peut être facilement adaptée à d’autres réseaux de dépistage, tels que les panels de médicaments et les bibliothèques de gènes knock-out.

Introduction

Les cultures bactériennes contiennent une petite sous-population de cellules persistantes qui sont temporairement tolérantes à des niveaux anormalement élevés d’antibiotiques. Les cellules persistantes sont génétiquement identiques à leurs parents sensibles aux antibiotiques, et leur survie a été attribuée à l’inhibition transitoire de la croissance1. Les cellules persistantes ont été découvertes pour la première fois par Gladys Hobby2, mais le terme a été utilisé pour la première fois par Joseph Bigger lorsqu’il les a identifiées dans des cultures de Staphylococcus pyogenes traitées à la pénicilline3. Une étude séminale publiée par Balaban et al.4 a découvert deux types de persister : les variantes de type I qui sont principalement formées par le passage à travers la phase stationnaire, et les variantes de type II qui sont continuellement générées pendant la croissance exponentielle. Les persistants sont détectés par des tests de survie clonogènes, dans lesquels des échantillons de culture sont prélevés à divers intervalles pendant les traitements antibiotiques, lavés et plaqués sur un milieu de croissance typique pour compter les cellules survivantes qui peuvent coloniser en l’absence d’antibiotiques. L’existence de persisters dans une culture cellulaire est évaluée par une courbe de mise à mort biphasique4,5 où la décroissance exponentielle initiale indique la mort des cellules sensibles aux antibiotiques. Cependant, la tendance à tuer diminue au fil du temps, conduisant éventuellement à une région de plateau qui représente les cellules persistantes survivantes.

Les cellules persistantes ont été associées à diverses maladies telles que la tuberculose6,la mucoviscidose7,la candidose8 et les infections des voies urinaires9. Presque tous les micro-organismes testés jusqu’à présent se sont avérés pour générer des phénotypes persistants, y compris mycobacterium tuberculosishautement pathogène6, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 et Candida albicans8. Des études récentes fournissent également des preuves de l’augmentation des mutants multirésistants dans les sous-populations persistantes11,12. Des efforts considérables dans ce domaine ont révélé que les mécanismes de persistance sont très complexes et divers; des facteurs stochastiques et déterministes associés à la réponse SOS13,14,aux espèces réactives de l’oxygène (ROS)15,aux systèmes toxine/antitoxine (TA)16,à l’autophagie ou à l’auto-digestion17 et à la réponse stricte liée au ppGpp18 sont connus pour faciliter la formation de persister.

Malgré des progrès significatifs dans la compréhension du phénotype de persistance, les effets des osmolytes sur la persistance bactérienne n’ont pas été entièrement compris. Étant donné que le maintien d’une pression osmotique optimale est une nécessité pour la croissance, le bon fonctionnement et la survie des cellules, une étude approfondie des osmolytes pourrait conduire à des cibles potentielles pour les stratégies anti-persister. Bien que laborieux, le criblage à haut débit est une approche très efficace pour identifier les métabolites et autres produits chimiques qui jouent un rôle crucial dans le phénotype de persistance19,20. Dans ce travail, nous discuterons de notre méthode publiée19, où nous avons utilisé des puces à ADN, c’est-à-dire 96 plaques de puits contenant divers osmolytes (par exemple, chlorure de sodium, urée, nitrite de sodium, nitrate de sodium, chlorure de potassium), pour identifier les osmolytes qui influencent considérablement la persistance de E. coli.

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Protocole

1. Préparation du milieu de croissance, de la solution d’ofloxacine et des stocks de cellules D’E. coli

  1. Milieu régulier Luria-Bertani (LB) : Ajouter 10 g/L de tryptone, 10 g/L de chlorure de sodium (NaCl) et 5 g/L d’extrait de levure dans de l’eau désionisée (DI). Stériliser le milieu par autoclavage.
  2. Plaques de gélose LB : Ajouter 10 g/L de tryptone, 10 g/L de NaCl, 5 g/L d’extrait de levure et 15 g/L de gélose dans de l’eau DI et stériliser le milieu par autoclavage. À la température désirée (~55 °C), verser ~30 mL de milieu de gélose dans des plaques carrées (10 x 10 cm). Sécher les assiettes et conserver à 4 °C.
  3. Milieu LB modifié : Ajouter 10 g/L de tryptone et 5 g/L d’extrait de levure dans de l’eau DI. Stériliser le milieu par autoclavage.
  4. Milieu LB modifié comprenant un osmolyte : Mélanger 2x milieu LB modifié avec une solution 2x osmolyte en volumes égaux. Pour préparer 2x milieu LB modifié, ajouter 20 g/L de tryptone et 10 g/L d’extrait de levure dans de l’eau DI et stériliser par autoclavage. Pour préparer la solution d’osmolyte 2x, dissoudre l’osmolyte d’intérêt (2x quantité) dans de l’eau DI, puis filtrer stériliser la solution.
    NOTA : L’osmolyte d’intérêt et ses concentrations peuvent être déterminés à partir des tests de dépistage des puces à adn phénotypique (voir le protocole 4). Cependant, l’osmolyte testé et la concentration 2x associée peuvent être ajustés en fonction de la nature de la recherche. Par exemple, pour étudier l’impact du chlorure de sodium 1 mM, une solution d’osmolyte 2x serait une solution de chlorure de sodium 2 mM.
  5. Solution mère d’ofloxacine (5 mg/mL) : Ajouter 5 mg de sel d’ofloxacine (OFX) dans 1 mL d’eau DI. Ajouter 10 μL d’hydroxyde de sodium 10 M pour augmenter la solubilité de l’OFX dans l’eau, puis filtrer stériliser la solution. Préparer les aliquotes et conserver à -20 °C.
    REMARQUE: L’ofloxacine est un antibiotique quinolone qui a été largement utilisé pour les cellules bactériennes en croissance et non en croissance14,21. La concentration inhibitrice minimale (CMI) d’OFX pour les cellules E. coli MG1655 se situe dans la plage de 0,039 à 0,078 μg/mL19,20. Notez également que d’autres antibiotiques tels que l’ampicilline et la kanamycine sont couramment utilisés dans la recherche sur les persistants. Le choix des antibiotiques dépend de la nature de l’étude.
  6. E. coli Stocks de cellules MG1655 : Inoculer 2 mL de milieu LB régulier avec une seule colonie dans un tube à essai de 14 mL (encchique) et faire la culture des cellules dans un agitateur orbital à 250 tr/min et 37 °C. Lorsque les cellules atteignent la phase stationnaire, mélanger 500 μL de la culture cellulaire avec 500 μL de glycérol à 50 % (stérile) dans un flacon cryogénique et conserver à -80 °C.

2. Propagation des cellules pour éliminer les persistants préexistants

  1. Pour préparer une culture pendant la nuit, grattez une petite quantité de cellules d’un stock de cellules congelées avec une pointe de pipette stérile (ne décongelez pas le stock de cellules de glycérol) et inoculez les cellules dans 2 mL de milieu LB modifié dans un tube à essai à bouchon cassé de 14 mL. Culturer les cellules dans un agitateur orbital à 250 rpm et 37 °C pendant 12 h.
  2. Première propagation
    1. Après 12 h, transférer 250 μL de culture pendant la nuit dans 25 mL de milieu LB modifié frais dans une fiole déconcertée de 250 mL recouverte d’une feuille d’aluminium stérile.
    2. Cultiver la culture cellulaire dans un agitateur orbital à 250 tr/min et à 37 °C jusqu’à ce que les cellules atteignent la phase exponentielle moyenne (DO600 = 0,5).
    3. Mesurer la densité optique à 600 nm (OD600)à l’aide d’un lecteur de microplaques toutes les 30 min.
  3. Deuxième propagation
    1. À600 DO = 0,5, diluer 250 μL de culture cellulaire de la première fiole dans 25 mL de milieu LB modifié frais dans une fiole déconcertée de 250 mL.
    2. Cultiver la deuxième culture cellulaire dans un agitateur orbital à 250 tr/min et 37 °C jusqu’à600DO = 0,5.
    3. Mesurer la densité optique toutes les 30 minutes.
      REMARQUE: Une culture de nuit peut avoir une quantité importante de cellules persistantes4,5,22. La méthode du cycle de dilution/croissance5 décrite ci-dessus peut être utilisée pour éliminer ces persistants préexistants avant de transférer les cellules dans des puces à ADN. Leur élimination peut être validée en quantifiant les niveaux de persistance des cultures de nuit avec le dosage décrit dans le protocole 3. Cette méthode a déjà été validée dans une étude précédente19.

3. Validation de l’élimination des cellules persistantes préexistantes

  1. Après la deuxième multiplication (voir étape 2.3), diluer 250 μL de la culture cellulaire (DO600 = 0,5) dans 25 mL de milieu LB modifié frais dans une fiole déconcertée de 250 mL.
    NOTA : Pour les témoins, diluer 250 μL de culture pendant la nuit (voir l’étape 2.1) dans 25 mL de milieu LB modifié frais dans une fiole déconcertée de 250 mL. Avant de transférer les cellules dans le ballon, la densité cellulaire de la culture de nuit doit être ajustée dans un milieu LB modifié frais pour obtenirla DO 600 = 0,5.
  2. Ajouter 25 μL de solution mère OFX (5 mg/mL) dans la suspension cellulaire et agiter doucement le ballon pour rendre la culture d’essai homogène. La concentration finale d’OFX est de 5 μg/mL dans la culture d’essai.
  3. Incuber la culture d’essai dans un agitateur orbital à 250 tr/min et 37 °C.
  4. À chaque heure pendant le traitement (y compris 0 h, le point de temps avant l’ajout d’OFX dans la culture d’essai), transférer 1 mL de la culture d’essai du ballon dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
  5. Centrifuger la culture d’essai dans le tube de microcentrifugation à 17 000 x g pendant 3 min.
  6. Retirez soigneusement 950 μL du surnageant sans perturber la pastille cellulaire.
  7. Ajouter 950 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans le tube à microcentrifugation.
  8. Répétez les étapes de lavage 3.5-3.7 pour 3x au total jusqu’à ce que la concentration d’antibiotique soit inférieure à la concentration minimale inhibitrice (MIC).
  9. Après le lavage final, ressusciter la pastille cellulaire dans 100 μL de solution de PBS, ce qui donne un échantillon concentré 10 fois.
  10. Prendre 10 μL de la suspension cellulaire et diluer en série six fois dans 90 μL de solution de PBS à l’aide d’une plaque inférieure ronde à 96 puits.
  11. Repérez 10 μL de suspensions de cellules diluées sur des plaques de gélose fraîches sans antibiotiques. Pour augmenter la limite de détection, plaquez les 90 μL restants de suspension cellulaire sur une plaque de gélose fraîche.
  12. Incuber les plaques de gélose à 37 °C pendant 16 h, puis compter les unités formant colonies (UFC). Tenir compte des taux de dilution lors du calcul du nombre total d’UFC dans 1 mL de culture d’essai. Les courbes de mise à mort sont générées en traçant les valeurs logarithmiques de l’UFC par rapport à la durée du traitement antibiotique.
    REMARQUE : Un traitement OFX de 6 h est suffisant pour obtenir une courbe de mise à mort biphasique pour les cellules E. coli 19,20. Le niveau de persistance des cellules propagées (tel que mesuré par le nombre d’UFC à 6 h) devrait être significativement inférieur à celui de la culture de nuit. Les procédures décrites dans les protocoles 2 et 3 peuvent être effectuées avec un LB régulier selon le plan de recherche.

4. Criblages de plaques de microréseaux

  1. Préparation de cultures de cellules de puces à ADN
    1. Transférer 250 μL de cellules en phase exponentielle vers 25 mL de milieu LB modifié frais dans un tube de centrifugation de 50 mL. Mélangez doucement la suspension cellulaire pour la rendre homogène.
      Remarque : les cellules de phase exponentielle (OD600 = 0,5) sont obtenues à partir de la deuxième étape de propagation (voir étape 2.3).
    2. Transférer la suspension de cellules diluées dans un réservoir stérile de 50 mL.
    3. À l’aide d’une pipette multicanal, transférer 150 μL de la suspension cellulaire dans chaque puits d’un microréseau, c’est-à-dire une plaque de 96 puits contenant divers osmolytes.
      Remarque : les puits qui n’ont pas d’osmolytes servent de contrôles.
    4. Couvrez la puce à ADN avec une membrane d’étanchéité perméable aux gaz.
    5. Incuber la plaque dans un agitateur orbital à 37 °C et 250 tr/min pendant 24 h.
      NOTA : Dans le cadre de ces expériences, des plaques disponibles dans le commerce ont été utilisées, comme des puces à adn phénotypiques (PM-9 et PM-10) qui comprennent une vaste gamme d’osmolytes, de tampons de pH et d’autres produits chimiques à l’état séché à diverses concentrations. Ces puces à ADN sont dans des formats de plaque de puits demi-zone 96. Les volumes de culture doivent être ajustés en fonction du type de plaques utilisées. Les puces à ADN peuvent également être générées manuellement (voir ci-dessous).
  2. Préparation manuelle de plaques de puces à ADN
    1. Transférer 75 μL de solutions d’osmolyte 2x dans les puits d’une plaque de puits de 96 demi-surface.
    2. Transférer 500 μL de cellules en phase exponentielle vers 25 mL de milieu LB modifié 2x dans un tube à centrifuger de 50 mL. Mélangez doucement la suspension cellulaire pour la rendre homogène.
      NOTA : Le taux d’inoculation a été ajusté pour être conforme au protocole de dépistage des puces à ADN décrit à la section 4.1.
    3. Ajouter 75 μL de la suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque de puits 96 demi-zone contenant 2x solutions d’osmolyte.
    4. Incuber la plaque dans un agitateur orbital à 37 °C et 250 tr/min pendant 24 h.
  3. Préparation de plaques d’essai de persister
    1. Préparer 25 mL de milieu LB modifié contenant 5 μg/mL d’OFX dans un tube centrifuge de 50 mL et transférer ce milieu dans un réservoir stérile.
    2. Transférer 190 μL de milieu LB modifié avec OFX du réservoir dans chaque puits d’une plaque générique à fond plat de 96 puits (plaque de dosage persistant) à l’aide d’une pipette multicanal.
    3. Retirez la puce à ADN du shaker (après culture pendant 24 h) et transférez 10 μL de cultures cellulaires de la puce à ADN vers les puits de la plaque d’analyse du persister, contenant du milieu LB modifié avec OFX.
    4. Prendre 10 μL de suspensions cellulaires de la plaque d’essai du persister et diluer en série trois fois dans 290 μL de solution de PBS à l’aide d’une plaque de puits à fond rond de 96 et d’une pipette multicanal.
    5. Après la dilution en série, placez 10 μL de toutes les suspensions cellulaires diluées en série sur des plaques de gélose fraîches sans antibiotiques à l’aide d’une pipette multicanal.
    6. Incuber la plaque d’essai du persister (préparée à l’étape 4.3.3) dans un agitateur orbital à 37 °C et 250 tr/min pendant 6 h après avoir recouvert la plaque d’une membrane d’étanchéité perméable aux gaz.
    7. Après 6 h d’incubation dans un agitateur, retirez la plaque de dosage du persister et répétez les étapes 4.3.4-4.3.5.
    8. Incuber les plaques de gélose pendant 16 h à 37 °C, puis compter les UFC. Les niveaux de CFU avant et 6 h après le traitement antibiotique permettent de calculer la fraction persistante dans chaque puits. Le dénombrement de l’UFC avant le traitement ofx aide également à évaluer les effets des osmolytes et sur la viabilité d’E. coli.

5. Validation des conditions identifiées

  1. Transférer 250 μL des cellules de phase exponentielle de l’étape 2.3 à 25 mL de milieu LB modifié frais contenant l’osmolyte identifié lors du criblage des puces à ADN (voir le protocole 4).
  2. Incuber le ballon dans un agitateur orbital à 250 tr/min et 37 °C pendant 24 h.
  3. Après 24 h, retirer le ballon du agitateur et transférer 250 μL de la culture cellulaire dans 25 mL de milieu LB modifié frais dans une fiole déconcertée de 250 mL.
  4. Ajouter 25 μL de solution mère d’OFX (5 mg/mL) dans la suspension cellulaire et agiter doucement le ballon pour rendre la culture d’essai homogène. Incuber le ballon dans un agitateur à 37 °C et 250 tr/min.
  5. À chaque heure pendant le traitement, transférer 1 mL de la culture d’essai du ballon dans un tube de microcentrifuge de 1,5 mL.
  6. Centrifuger la culture d’essai dans le tube de microcentrifugation à 17 000 x g pendant 3 min.
  7. Retirer 950 μL de surnageant et ajouter 950 μL de PBS.
  8. Répétez les étapes de lavage 5.6 et 5.7 pour 3x.
  9. Après le lavage final, ressusciter la pastille cellulaire dans 100 μL de solution de PBS.
  10. Prendre 10 μL de la suspension cellulaire et diluer en série 6x dans 90 μL de solution de PBS à l’aide d’une plaque inférieure ronde de 96 puits.
  11. Repérez 10 μL des suspensions de cellules diluées sur une plaque de gélose fraîche sans antibiotiques. Pour augmenter la limite de détection, plaquez les 90 μL restants de suspension cellulaire sur une plaque de gélose fraîche.
  12. Incuber la plaque de gélose à 37 °C pendant 16 h, puis compter les UFC.

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Résultats

La figure 1 décrit notre protocole expérimental. Les expériences sur le cycle de dilution/croissance (voir protocole 2) ont été adaptées d’une étude menée par Keren et al.5 pour éliminer les persistants provenant des cultures nocturnes. La figure 2A est une image représentative des plaques de gélose utilisées pour déterminer les niveaux d’UFC des cultures cellulaires avant et après le traitement ofx. Dans ces expériences, les cellules ont...

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Discussion

L’essai de persistance à haut débit décrit ici a été mis au point pour élucider les effets de divers produits chimiques sur la persistance de E. coli. En plus des plaques de particules commerciales, les puces à ADN peuvent être construites manuellement comme décrit à l’étape 4.2. De plus, le protocole présenté ici est flexible et peut être utilisé pour filtrer d’autres puces à ADN, telles que les panneaux de médicaments et les bibliothèques cellulaires, qui sont dans 96 formats de plaques de puits. Les condition...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier les membres d’Orman Lab pour leurs précieuses contributions au cours de cette étude. Cette étude a été financée par le nih/niaid K22AI125468 prix de transition de carrière et une subvention de démarrage de l’Université de Houston.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube à essai de 14 mlFisher Scientific14-959-1B
souche E. coli MG1655UniversitéObtenu du laboratoire Brynildsen
Plaque à fond plat à 96 puitsUSA Scientific5665-5161
Membrane d’étanchéité perméable aux gazVWR102097-058Stérilisé par irradiation gamma et exempt de cytotoxines
Demi-surface plaque à fond plat à 96 puitsVWR82050-062
LB géloseFisher ScientificBP1425-2Qualité génétique moléculaire
Sel d’ofloxacineVWR103466-232HPLC &ge ; 97.5
Microréseau de phénotypes (PM-9 et PM-10)BiologN/ALes plaques PM-9 et PM-10 contenaient respectivement divers osmolytes et tampons
Plaque à fond rond à 96 puitsUSA Scientific5665-0161
Chlorure de sodiumFisher ScientificS271-500Certifié de qualité ACS
Nitrate de sodiumFisher ScientificAC424345000de qualité réactif ACS
Nitrite de sodiumFisher ScientificAAA186680B98 % de pureté
Boîte de Pétri carréeFisher ScientificFB0875711A
TryptoneFisher ScientificBP1421-500Qualité de génétique moléculaire
Varioskan lux lecteur de microplaques multimodeThermo Fisher ScientificVLBL00D0Utilisé pour la mesure de la densité optique à 600 nm
Extrait de levureFisher ScientificBP1422-100Grade génétique moléculaire
de Princeton

Références

  1. Lewis, K. Persister cells, dormancy and infectious disease. Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).
  2. Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. Observations on the Mechanism of Action of Penicillin. Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).
  3. Bigger, J. Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation. The Lancet. 244 (6320), 497-500 (1944).
  4. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).
  5. Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. Persister cells and tolerance to antimicrobials. FEMS Microbiology Letters. 230 (1), 13-18 (2004).
  6. Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters. mBio. 2 (3), (2011).
  7. Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa Strains Producing High Levels of Persister Cells in Patients with Cystic Fibrosis. Journal of Bacteriology. 192 (23), 6191-6199 (2010).
  8. LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).
  9. Allison, K. R., Brynildsen, M. P., Collins, J. J. Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides. Nature. 473 (7346), 216-220 (2011).
  10. Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).
  11. Barrett, T. C., Mok, W. W. K., Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic. Nature Communications. 10 (1), 1177(2019).
  12. Windels, E. M., et al. Bacterial persistence promotes the evolution of antibiotic resistance by increasing survival and mutation rates. ISME Journal. 13 (5), 1239-1251 (2019).
  13. Dörr, T., Lewis, K., Vulić, M. SOS response induces persistence to fluoroquinolones in Escherichia coli. PLoS Genetics. 5 (12), 1000760(2009).
  14. Völzing, K. G., Brynildsen, M. P. Stationary-phase persisters to ofloxacin sustain DNA damage and require repair systems only during recovery. mBio. 6 (5), (2015).
  15. Grant, S. S., Kaufmann, B. B., Chand, N. S., Haseley, N., Hung, D. T. Eradication of bacterial persisters with antibiotic-generated hydroxyl radicals. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (30), 12147-12152 (2012).
  16. Gerdes, K., Maisonneuve, E. Bacterial Persistence and Toxin-Antitoxin Loci. Annual Review of Microbiology. 66 (1), 103-123 (2012).
  17. Orman, M. A., Brynildsen, M. P. Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli. Nature Communications. 6 (1), 7983(2015).
  18. Korch, S. B., Henderson, T. A., Hill, T. M. Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis. Molecular Microbiology. 50 (4), 1199-1213 (2003).
  19. Karki, P., Mohiuddin, S. G., Kavousi, P., Orman, M. A. Investigating the effects of osmolytes and environmental ph on bacterial persisters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), 02393(2020).
  20. Mohiuddin, S. G., Hoang, T., Saba, A., Karki, P., Orman, M. A. Identifying Metabolic Inhibitors to Reduce Bacterial Persistence. Frontiers in Microbiology. 11, 472(2020).
  21. Brooun, A., Liu, S., Lewis, K. A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (3), 640-646 (2000).
  22. Luidalepp, H., Jõers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence. Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).
  23. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, 0008(2006).
  24. Zaslaver, A., et al. A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli. Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).
  25. Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy. Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).

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Mots-clés

Effets des osmolytesplaque micro r seauxessai de persistancedilution en s rieunit s formant coloniestraitement l ofloxacinemilieu LB modifimembrane perm able aux gaz

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