Criblage à haut débit des composés chimiques pour élucider leurs effets sur la persistance bactérienne

Résumé

Dans ce document de méthode, nous présentons une stratégie de criblage à haut débit pour identifier les composés chimiques, tels que les osmolytes, qui ont un impact significatif sur la persistance bactérienne.

Résumé

Les bactéries persistantes sont définies comme une petite sous-population de variantes phénotypiques ayant la capacité de tolérer des concentrations élevées d’antibiotiques. Ils constituent un problème de santé important, car ils ont été associés à des infections chroniques récurrentes. Bien que la dynamique stochastique et déterministe des mécanismes liés au stress soit connue pour jouer un rôle significatif dans la persistance, les mécanismes sous-jacents au passage phénotypique à/de l’état de persistance ne sont pas complètement compris. Bien que les facteurs de persistance déclenchés par les signaux environnementaux (p. ex. épuisement des sources de carbone, d’azote et d’oxygène) aient fait l’objet d’études approfondies, les effets des osmolytes sur la persistance n’ont pas encore été déterminés. À l’aide de puces à ADN (c.-à-d. 96 plaques de puits contenant divers produits chimiques), nous avons conçu une approche pour élucider les effets de divers osmolytes sur la persistance d’Escherichia coli de manière à haut débit. Cette approche est transformatrice car elle peut être facilement adaptée à d’autres réseaux de dépistage, tels que les panels de médicaments et les bibliothèques de gènes knock-out.

Introduction

Les cultures bactériennes contiennent une petite sous-population de cellules persistantes qui sont temporairement tolérantes à des niveaux anormalement élevés d’antibiotiques. Les cellules persistantes sont génétiquement identiques à leurs parents sensibles aux antibiotiques, et leur survie a été attribuée à l’inhibition transitoire de la croissance^1. Les cellules persistantes ont été découvertes pour la première fois par Gladys Hobby^2, mais le terme a été utilisé pour la première fois par Joseph Bigger lorsqu’il les a identifiées dans des cultures de Staphylococcus pyogenes traitées à la pénicilline

Protocole

1. Préparation du milieu de croissance, de la solution d’ofloxacine et des stocks de cellules D’E. coli

1. Milieu régulier Luria-Bertani (LB) : Ajouter 10 g/L de tryptone, 10 g/L de chlorure de sodium (NaCl) et 5 g/L d’extrait de levure dans de l’eau désionisée (DI). Stériliser le milieu par autoclavage.
2. Plaques de gélose LB : Ajouter 10 g/L de tryptone, 10 g/L de NaCl, 5 g/L d’extrait de levure et 15 g/L de gélose dans de l’eau DI et stériliser le milieu par autoclavage. À la température désirée (~55 °C), verser ~30 mL de milieu de gélose dans des plaques carrées (10 x 10 cm). Sécher les assiettes et conserver à 4 °C.
....

Résultats

La figure 1 décrit notre protocole expérimental. Les expériences sur le cycle de dilution/croissance (voir protocole 2) ont été adaptées d’une étude menée par Keren et al.⁵ pour éliminer les persistants provenant des cultures nocturnes. La figure 2A est une image représentative des plaques de gélose utilisées pour déterminer les niveaux d’UFC des cultures cellulaires avant et après le traitement ofx. Dans ces expériences, les cellules ont.......

Discussion

L’essai de persistance à haut débit décrit ici a été mis au point pour élucider les effets de divers produits chimiques sur la persistance de E. coli. En plus des plaques de particules commerciales, les puces à ADN peuvent être construites manuellement comme décrit à l’étape 4.2. De plus, le protocole présenté ici est flexible et peut être utilisé pour filtrer d’autres puces à ADN, telles que les panneaux de médicaments et les bibliothèques cellulaires, qui sont dans 96 formats de plaques de puits. Les condition.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube à essai de 14 ml	Fisher Scientific	14-959-1B
souche E. coli MG1655	Université		Obtenu du laboratoire Brynildsen
Plaque à fond plat à 96 puits	USA Scientific	5665-5161
Membrane d’étanchéité perméable aux gaz	VWR	102097-058	Stérilisé par irradiation gamma et exempt de cytotoxines
Demi-surface plaque à fond plat à 96 puits	VWR	82050-062
LB gélose	Fisher Scientific	BP1425-2	Qualité génétique moléculaire
Sel d’ofloxacine	VWR	103466-232	HPLC &ge ; 97.5
Microréseau de phénotypes (PM-9 et PM-10)	Biolog	N/A	Les plaques PM-9 et PM-10 contenaient respectivement divers osmolytes et tampons
Plaque à fond rond à 96 puits	USA Scientific	5665-0161
Chlorure de sodium	Fisher Scientific	S271-500	Certifié de qualité ACS
Nitrate de sodium	Fisher Scientific	AC424345000	de qualité réactif ACS
Nitrite de sodium	Fisher Scientific	AAA186680B	98 % de pureté
Boîte de Pétri carrée	Fisher Scientific	FB0875711A
Tryptone	Fisher Scientific	BP1421-500	Qualité de génétique moléculaire
Varioskan lux lecteur de microplaques multimode	Thermo Fisher Scientific	VLBL00D0	Utilisé pour la mesure de la densité optique à 600 nm
Extrait de levure	Fisher Scientific	BP1422-100	Grade génétique moléculaire

de Princeton