Article de méthode

Analyse du réseau α-Actinine dans les cardiomyocytes dérivés de l’iPSC à l’aide d’une microscopie de localisation à molécule unique

DOI :

10.3791/61605

⸱

3 novembre 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiac Surgery, Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Rostock University Medical Center, 2Faculty of Interdisciplinary Research, Department Life, Light & Matter, University Rostock, 3Department of Cardiology, Rostock University Medical Center

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La formation d’un réseau de sarcomère approprié est importante pour la maturation des cardiomyocytes dérivés d’iPSC. Nous présentons une approche super résolution qui permet l’évaluation quantitative de la maturation structurelle des cardiomyocytes dérivés de cellules souches, afin d’améliorer les conditions de culture favorisant le développement cardiaque.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La maturation des cardiomyocytes dérivés de l’iPSC est un problème critique pour leur application dans la thérapie régénérative, le dépistage des drogues et la modélisation de la maladie. Malgré le développement de multiples protocoles de différenciation, la génération de cardiomyocytes iPSC ressemblant à un phénotype semblable à un adulte demeure difficile. Un aspect majeur de la maturation des cardiomyocytes implique la formation d’un réseau sarcomère bien organisé pour assurer une grande capacité de contraction. Ici, nous présentons une approche super résolution-basée pour l’analyse semi-quantitative du réseau de α-actinine dans les cardiomyocytes. À l’aide d’une microscopie de localisation photoactivée, une comparaison de la longueur du sarcomère et de l’épaisseur du disque z des cardiomyocytes et des cellules cardiaques dérivés de l’iPSC, isolées du tissu néonatal, a été effectuée. En même temps, nous démontrons l’importance de conditions d’imagerie appropriées pour obtenir des données fiables. Nos résultats montrent que cette méthode est appropriée pour surveiller quantitativement la maturité structurelle des cellules cardiaques à haute résolution spatiale, permettant la détection de changements même subtils de l’organisation du sarcomere.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les maladies cardiovasculaires (MALADIES cardiovasculaires) telles que l’infarctus du myocarde ou la cardiomyopathie demeurent la principale cause de décès dans le monde occidental1. Comme le cœur humain ne possède qu’une faible capacité de régénération, il est nécessaire de stratégies pour promouvoir la récupération des maladies cardiovasculaires. Cela comprend les thérapies de remplacement cellulaire pour reconstituer les cardiomyocytes perdus (CM), ainsi que le développement de nouveaux médicaments anti-arythmiques pour une intervention pharmaceutique efficace et sûre. Les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) se sont avérées être une source de cellules prometteuses pour la génération illimitée de CM humain in vitro, adaptée aux thérapies régénératrices, à la modélisation de la maladie, et au développement d’essais de dépistage des médicaments2,3,4.

Bien qu’il existe de nombreux protocoles de différenciation cardiaque différents, cm dérivé de l’iPSC manquent encore certains aspects phénotypiques et fonctionnels qui entravent l’application in vitro et in vivo5,6. À côté des changements électrophysiologiques, métaboliques et moléculaires, le processus de maturation cardiaque implique l’organisation structurelle des sarcomeres, qui sont les unités fondamentales requises pour la génération de force et la contraction cellulaire7. Alors que les CM adultes présentent un appareil contractile bien organisé, les CM dérivés d’iPSC démontrent généralement des filaments de sarcomères désarrangés, associés à une capacité de contraction réduite et à une dynamique de contraction altérée8,9. Contrairement à cm mature qui montrent le modèle de contraction uniaxiale, les structures désorientées dans cm immatures a comme conséquence une contraction radiale de la cellule entière ou favorisent l’apparition des points focaux de contraction9,10.

Pour améliorer la maturation cardiaque, de multiples approches ont été appliquées, y compris les méthodes de culture cellulaire 3D, la stimulation électrique et mécanique, ainsi que l’utilisation de matrices extracellulaires imitant les conditions in vivo11,12,13. Pour évaluer le succès et l’efficacité de ces différentes conditions culturelles, des techniques sont nécessaires pour surveiller et estimer le degré de maturation structurelle de l’iPSC CM, par exemple, par des techniques microscopiques. Contrairement à l’imagerie confocale conventionnelle, la résolution en cas de microscopie de localisation photoactivée (PALM) est environ 10x plus élevée. Cette technique permet à son tour une analyse plus précise, détectant même des altérations subtiles des structures cellulaires14. Compte tenu de la haute résolution de l’imagerie basée sur PALM, l’objectif global de cette méthode était l’évaluation microscopique de la maturité sarcomère dans les CM dérivés d’iPSC par une détermination précise de l’épaisseur du z-Disc et de la longueur du sarcomère. Dans des études antérieures, ces caractéristiques structurelles se sont avérées être des paramètres appropriés pour évaluer la maturité cardiaque15. Par exemple, iPSC-CM malade manquant de dystrophine pleine longueur présentent une longueur de sarcomère réduite et la largeur de la bande z par rapport aux cellules de type sauvage16. De même, la longueur des sarcomeres individuels a été mesurée pour étudier l’impact des signaux topographiques sur le développement cardiaque16. Par conséquent, nous avons appliqué cette approche pour évaluer la maturation structurelle du réseau sarcomère dans iPSC-CM en mesurant quantitativement la longueur du sarcomère et l’épaisseur du disque z.

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Protocole

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Toutes les étapes de ce protocole impliquant des souris néonatales et adultes ont été effectuées conformément aux lignes directrices éthiques pour les soins aux animaux du Centre médical de l’Université Rostock.

1. Culture et dissociation des cardiomyocytes dérivés de l’iPSC

  1. Différenciez hiPSC-CM pendant 25 jours à l’aide d’une méthode de monocouche 2D comme décrit précédemment17.
  2. Préwarm dissociation moyenne à 37 °C et soutenir la température moyenne à la température ambiante.
  3. Laver les cellules deux fois avec PBS.
  4. Ajouter le milieu de dissociation préguerre aux cellules et incuber pendant 12 min à 37 °C et 5 % de CO2.
  5. Ajoutez un support aux cellules.
    REMARQUE : Le volume du support supplémentaire doit être deux fois plus élevé que le volume de milieu de dissociation utilisé à l’étape 1.4.
  6. Déloger les cellules à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL.
  7. Cellules de centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min et resuspendent le granulé dans 3 mL de milieu de culture hiPSC-CM17.
  8. Cellules de semence dans 8 chambres de fond de verre de puits à une densité cellulaire de 75.000 cellules/puits et culture pendant 3 jours.

2. Isolement cardiomyocyte adulte

  1. L’isolement et la culture des cardiomyocytes adultes de souris NMRI ont été exécutés comme rapporté précédemment18.
  2. Cellules de graines dans 8 toboggan de chambre de verre de puits et la culture pendant une journée.

3. Isolement et culture des cardiomyocytes néonatals

  1. La procédure d’isolement des cardiomyocytes néonatals, obtenus de souris de NMRI, a été exécutée comme décrit précédemment19.
  2. Cellules isolées de graine dans la glissière de chambre de verre de 8 puits à une densité cellulaire de 75.000 cellules/puits et la culture pendant 3 jours dans le milieu néonatal de culture de CM19.

4. Étiquetage de l’immunofluorescence du réseau α-actinine

REMARQUE : Pour des résultats optimaux, les cellules sont cultivées dans 8 chambres de fond de verre de puits. L’étiquetage doit être effectué un jour avant l’imagerie.

  1. Préguerre 4% PFA à 37 °C.
  2. Fixer iPSC-CM en ajoutant 4% de paraformaldéhyde directement dans le milieu de culture (dilution 1:1) et incuber à 37 °C pendant 15 min. La concentration finale de PFA pour la fixation est de 2%.
  3. Incuber les cellules fixes dans 0,2% Triton-X, diluées en PBS, pendant 5 min à température ambiante.
  4. Laver les cellules deux fois avec pbs, 5 min chacun.
  5. Ajouter 1% de solution BSA (diluée en PBS) et incuber pendant 60 min à température ambiante.
  6. Préparer 150 μL de solution d’anticorps primaires en diluant α-actinine anticorps 1:100 dans 1% BSA, contenant 0,05% Triton-X. Ajouter aux cellules et incuber à température ambiante pendant 60 min.
  7. Laver les cellules deux fois avec 0,2% de solution BSA, 5 min chacune.
  8. Préparer 150 μL de solution d’anticorps secondaires en diluant l’anticorps Alexa647 de chèvre-souris 1:100 dans 1% BSA, contenant 0.05% Triton-X. Ajouter aux cellules et incuber à température ambiante pendant 40 min.
  9. Laver les cellules deux fois avec 0,2% de solution BSA, 5 min chacune.
  10. Laver les cellules deux fois avec pbs, 5 min chacun. Gardez les cellules étiquetées dans l’obscurité à 4 °C jusqu’à l’imagerie PALM.

5. Préparation de la mémoire tampon d’imagerie PALM

REMARQUE : Il est essentiel de préparer fraîchement la mémoire tampon d’imagerie PALM pour chaque expérience.

  1. Préparer une solution de glucose à 50 % en dissolvant 25 g de glucose dans 50 mL d’eau distillée.
  2. Préparer un tampon de base contenant 50 mM Tris-HCl, 10% de glucose et 10 mM de chlorure de sodium.
    1. Ajuster le niveau de pH à ~8.0 à l’aide d’acide chlorhydrique.
  3. Préparer la solution de pyranose oxydase en dissolvant 0,6 mg de pyranose oxydase dans 316 μL de tampon de base.
  4. Préparer la solution de catalase en dissolvant 7 mg de catalase dans 500 μL de tampon de base. Bien mélanger et centrifuger à 10 000 x g pendant 3 min. Gardez le supernatant pour une utilisation ultérieure. La solution Catalase peut être conservée à 4 °C pendant plusieurs jours.
  5. Préparer 500 μL de tampon d’imagerie PALM en mélangeant 316 μL de solution de pyranose oxidase, 25 μL de solution de catalase, 100 μL de solution de glucose de 50%, 50 μL de cystéamine, 5 μL de cyclooctatetraène et 3,5 μL de β-Mercaptoethanol. L’activité catalytique finale de la pyranose oxidase et de la catalase doit être de 7,5 U, 35,00U respectivement.
    REMARQUE : La mémoire tampon d’imagerie PALM fournit des conditions d’imagerie optimales pour 3-5 h. Si la capacité de clignotement du colorant fluorescent diminue, préparez un nouvel aliquot tampon.

6. Acquisition d’image PALM

  1. Allumez le microscope au moins 3 h avant l’utilisation et apportez l’échantillon à la température ambiante avant l’imagerie pour permettre l’équilibre thermique. Si le microscope est équipé d’une chambre d’incubation, ajuster la température à 30 °C.
  2. Nettoyez l’objectif et le fond de la glissière de chambre à l’aide d’un solvant de nettoyage approprié.
  3. Ajoutez 300 μL de tampon d’imagerie PALM dans un puits de cellules étiquetées et insérez la lame de chambre dans le support de scène du microscope.
  4. Définissez les paramètres d’acquisition d’images PALM.
    1. Sélectionnez l’objectif d’exploitation de l’huile 1.57 N.A. 100x pour l’acquisition.
    2. Sélectionnez le mode PALM et activez les paramètres TIRF.
    3. Ajuster le nombre d’images à acquérir. Habituellement 5 000-10 000 images sont suffisantes pour obtenir des résultats optimaux. Toutefois, le nombre de cadres acquis dépend fortement de l’efficacité de l’étiquetage et de la capacité de clignotement du colorant fluorescent et peut être ajusté par l’utilisateur.
    4. Réglez la puissance du laser UV à 0,1 % et 647 laser à 0,2 %.
    5. Réglez le niveau de gain à 50-100.
    6. Allumez l’éclairage laser et sélectionnez une cellule cible. Le niveau de gain peut être augmenté si l’intensité du signal est faible (selon l’étiquetage de fluorescence).
    7. Éteindre l’éclairage laser
  5. Acquisition d’images PALM
    1. Réduire le gain à 0 et augmenter la puissance laser (ex 647) à 100%.
    2. Blanchir la cellule cible pour ~5 s.
    3. Augmentez le gain à 50 et commencez l’acquisition d’image PALM.
      REMARQUE : Le gain doit être ajusté pour obtenir une intensité de signal suffisante, tandis que les pixels sursaturés doivent être évités. Si l’intensité du signal diminue, augmentez le niveau de gain.
  6. En option, augmenter progressivement la puissance du laser UV (0,1%-10%) pour augmenter l’intensité du signal et pour favoriser le clignotement du fluorophore.

7. Reconstruction des données PALM

  1. Ouvrez le logiciel Image J et importez des données PALM.
  2. Open Thunderstorm Plugin et "Run analysis»
    1. Dans le menu «Configuration de l’appareil photo», entrez la taille des pixels et le gain EM.
      REMARQUE : Lorsque vous utilisez des objectifs 100x et une lentille de grossissement de 1,6 x, la taille de 100 nm est appropriée. Toutefois, comme la taille du pixel dépend des caractéristiques matérielles du microscope et de la caméra utilisées pour l’imagerie PALM, les utilisateurs doivent vérifier et adapter soigneusement ce paramètre. Les valeurs de gain EM peuvent être obtenues à partir des métadonnées.
    2. Dans le menu "Exécuter l’analyse" définir les paramètres comme suit: B-spline ordre: 3, échelle B-spline: 2.0, seuil d’intensité de pointe: stf(Wave.F1), rayon d’ajustement: 3, sigma initial: 1.6, grossissement: 5.0, fréquence de mise à jour: 50, décalages latéraux: 2. Confirmer en cliquant sur le bouton "Ok« .
  3. Post-traitement de l’image PALM reconstruite
    1. Dans le menu "Plot histogramme« , sélectionnez le paramètre "Sigma« .
    2. Utilisez l’outil «Rectangle» pour sélectionner un retour sur investissement, à l’exclusion des artefacts possibles et appliquer le retour sur investissement sur le filtre. Les valeurs de retour sur investissement s’affichent dans la zone de commande du filtre.
    3. Ajoutez "& incertitude <25" aux valeurs de retour sur investissement. Une commande de filtre possible ressemblera à ceci : « sigma > 48.6821 & sigma < 1117.40) & incertitude <25 « . Appliquez des valeurs sigma sélectionnées.
    4. Dans le menu «Supprimer les doublons», entrez un seuil de distance de « 10 nm » et appliquez.
    5. Dans le menu "Fusion « ,définissez la distance maximale à " 20 « , les cadres maximum par molécule à " 0 " et le maximum des cadres à " 1 « . Appliquez les paramètres.
    6. Dans le menu "Correction dedérive « , sélectionnez corrélation croisée et définissez " Nombre debacs" sur " 5 " et "Grossissement" sur " 5.0 « . Appliquez des paramètres de correction de dérive.
    7. Enregistrez l’image PALM finale et exportez les données traitées après l’exportation si vous le souhaitez.

8. Analyse des filaments de sarcomère

  1. Analyse de la longueur du sarcomère
    1. Ouvrez le logiciel Image J et importez l’image PALM reconstruite.
    2. Tracer une ligne entre les structures de sarcomère sélectionnées perpendiculaires au disque z pour mesurer la distance la plus courte entre les filaments d’actinine.
    3. Sélectionnez "Plot profile" dans le menu "Analyser" et acquérir la longueur entre deux pics. Comme la longueur du sarcomère peut varier au sein d’une cellule, un minimum de 20 sarcomeres doit être mesuré dans différentes zones de la cellule cible.
  2. Analyse de l’épaisseur du disque z
    1. Ouvrez le logiciel Image J et importez l’image PALM reconstruite.
    2. Convertissez l’image PALM reconstruite en image en mode 8 bits.
    3. Ouvrez le plugin de détection de crête et entrez les paramètres suivants : largeur de ligne : 20, contraste élevé : 230, contraste bas : 10, sigma : 0,79, seuil inférieur : 25,84, longueur minimale de ligne : 20.
    4. Définir "Estimation largeur« , "Extend line" et " Displayresults« .
    5. Cliquez sur "Ok" et utilisez "Largeur moyennede ligne " à partir du tableau des résultats pour d’autres analyses.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour estimer le degré de maturation structurelle de CM, néonatal, adulte pleinement mature, et iPSC CM ont été initialement étiquetés le CM avec α-actinine anticorps pour visualiser le réseau sarcomère. Après l’acquisition de PALM, les images ont été reconstruites, et l’épaisseur du disque z a été mesurée à l’aide d’un logiciel de traitement d’image à base de plugins pour la détection automatique de la largeur des filaments individuels. La longueur du sarcomère a été calculée en mesurant la distance entre deux pics d’int...

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Discussion

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La génération de CM in vitro fonctionnel dérivé de l’iPSC est importante pour les thérapies régénératives, la modélisation des maladies et le développement de plates-formes de dépistage des médicaments. Cependant, la maturité insuffisante de ces CM est un obstacle majeur dans la recherche cardiovasculaire20. À cet égard, des techniques d’imagerie à haute résolution sont nécessaires pour permettre la surveillance de l’état de maturation structurale du CM dérivé de l’iPSC. Dans le même temps, la mic...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a été soutenue par le Fonds structurel de l’UE (FSE/14-BM-A55-0024/18). En outre, H.L. est soutenu par le programme FORUN du Centre médical universitaire de Rostock (889001 et 889003) et la Fondation Josef et Käthe Klinz (T319/29737/2017). C.I.L. est soutenu par le Programme de cliniciens-chercheurs du Centre médical de l’Université Rostock. R.D est soutenu par la DFG (DA1296/6-1), la fondation DAMP, la Fondation allemande du cœur (F/01/12) et la BMBF (VIP+ 00240).

Nous remercions Madeleine Bartsch pour son soutien technique dans la culture cellulaire iPSC et la différenciation cardiaque.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
lignée cellulaire iPSC humaineTakaraY00325
µ ;-Slide 8 Puits Fond de verreibidi80827
0.5ml eppendorf tubeEppendorf30121023
Albumine sérique bovineSigma AldrichA906
Kit de dissociation des cardiomyocytesStem Cell Technologies05025
CatalaseSigma AldrichC40-1G
CyclooctatétraèneSigma Aldrich138924-1G
CysteamineSigma Aldrich30070-10g
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco sans Ca2+ et Mg2+Thermo Fisher14190169
F(ab')2-Goat anti-Souris IgG Alexa Fluor 647Thermo FisherA-21237
Fidji logiciel de traitement d’images (Image J)
GlucoseCarl RothX997.2
Acide chlorhydriqueSigma AldrichH1758
LSM 780 ELYRA PS.1 systèmeZeiss
ParaformaldéhydeMerck8187150100
Pyranose oxydaseSigma AldrichP4234-250UN
anticorps anti-alpha-actinine sarcomérique [EA-53]Abcamab9465
Chlorure de sodiumSigma AldrichS7653
eau stérileCarl Roth3255.1
Triton X-100Sigma AldrichX100
Base TrizmaSigma AldrichT1503
&beta ;-MercaptoethanolSigma AldrichRéférence 63689

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McAloon, C. J., et al. The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data. International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).
  2. Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us. Cells. 8 (11), 1331(2019).
  3. Ylä-Herttuala, S. iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients. Molecular Therapy. 26 (9), 2077(2018).
  4. Kadota, S., Shiba, Y. Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment. Current Cardiology Reports. 21 (8), 73(2019).
  5. Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
  6. Feric, N. T., Radisic, M. Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).
  7. Ali, H., Braga, L., Giacca, M. Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture. The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).
  8. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
  9. Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).
  10. Dai, Y., et al. Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
  11. Huang, C. Y., et al. Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).
  12. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  13. Lee, S., et al. Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness. Biomaterials. 131, 111-120 (2017).
  14. Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
  15. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  16. Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells. Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).
  17. Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819(2020).
  18. Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  19. Lemcke, H., et al. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).
  20. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  21. Krysiak, J., et al. Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes. Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).
  22. Zaunbrecher, R. J., et al. Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function. Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).
  23. Fornasiero, E. F., Opazo, F. Super-resolution imaging for cell biologists. BioEssays. Fornasiero, E. F., Opazo, F. , Wiley Online Library. (2015).
  24. Jeziorowska, D., et al. Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173(2017).
  25. Kroll, K., et al. Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).
  26. Zuppinger, C., et al. Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes. European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).
  27. Jradi, F. M., Lavis, L. D. Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy. ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).
  28. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  29. Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
  30. Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy. Neurophotonics. 3 (4), 041810(2016).
  31. Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
  32. Olivier, N., Keller, D., Gönczy, P., Manley, S. Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers. PLoS One. 8 (7), 0069004(2013).
  33. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  34. Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).
  35. Venkataramani, V., et al. Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins. Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).
  36. Erdélyi, M., et al. Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy. Methods. 88, 122-132 (2015).
  37. McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy. Optics Letters. 39 (2), 275(2014).
  38. Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
  39. Pioner, J. M., et al. Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).

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R seau d alpha actininemicroscopie de localisation photoactiv eanalyse de la longueur des sarcom resmesure de l paisseur du disque Zvaluation de la maturation des cardiomyocytesimagerie super r solutionreconstruction d images PALMlocalisation de mol cules fluorescentes

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