Isolement de sous-populations de cellules stromales adipogènes et fibro-inflammatoires à partir de dépôts adipeux intra-abdominaux murins

Le tissu adipeux blanc (WAT) représente le principal site de stockage d’énergie chez les mammifères. Dans ce tissu, les adipocytes, ou « cellules adipeuses », stockent les calories en excès sous forme de triglycérides, emballés dans de grosses gouttelettes lipidiques uniloculaires. De plus, les adipocytes sécrètent une multitude de facteurs qui régulent divers aspects de l’homéostasie énergétique ^1,2,3. Les adipocytes constituent l’essentiel du volume de WAT ; cependant, les adipocytes ne représentent que moins de 50% du total des cellules présentes dans WAT ^4,5. Le compartiment non adipocytaire de la WAT, ou fraction stroma-vasculaire (SVF), est assez hétérogène et contient des cellules endothéliales vasculaires, des cellules immunitaires résidentes des tissus, des fibroblastes et des populations de cellules précurseurs adipocytaires (APC).

WAT est exceptionnel dans sa remarquable capacité à s’étendre en taille à mesure que la demande de stockage d’énergie augmente. Le maintien de cette plasticité tissulaire est essentiel car un stockage adéquat des lipides dans le WAT protège contre le dépôt ectopique de lipides délétères dans les tissus non adipeux⁶. La manière dont les dépôts WAT individuels subissent cette expansion en réponse à l’excès calorique est un déterminant essentiel de la sensibilité à l’insuline dans le contexte de l’obésité⁷. L’expansion pathologique des WAT, observée chez les individus obèses atteints du syndrome métabolique, est caractérisée par une expansion préférentielle des dépôts viscéraux des WAT au détriment du tissu adipeux sous-cutané métaboliquement favorable. De plus, la résistance à l’insuline dans l’obésité est associée à un remodelage pathologique du WAT. Celle-ci se caractérise par une croissance hypertrophique des adipocytes existants (augmentation de la taille), une angiogenèse inadéquate, une inflammation métabolique chronique, une accumulation de composants de la matrice extracellulaire (fibrose) et une hypoxie tissulaire ^8,9. Ces phénotypes WAT de l’obésité sont associés à une stéatose hépatique et à une résistance à l’insuline, similaires à ce qui est observé dans l’état de lipodystrophie (absence de WAT fonctionnelle). En revanche, l’expansion saine des WAT est observée dans la population obèse métaboliquement saine et est caractérisée par une expansion préférentielle des WAT sous-cutanés protecteurs et une expansion de dépôt par hyperplasie adipocytaire¹⁰. Le recrutement de nouveaux adipocytes est médié par la différenciation adipocytaire de novo à partir des cellules précurseurs adipocytaires (APC) (appelée « adipogenèse »). L’hyperplasie adipocytaire coïncide avec des degrés relativement plus faibles de fibrose WAT et d’inflammation métabolique ^6,11. Une multitude de types de cellules au sein du microenvironnement WAT influencent directement la santé et l’expansibilité de WAT dans l’obésité¹². À ce titre, la définition de la fonction des différents types de cellules présentes dans WAT reste une priorité élevée pour le domaine.

Au cours de la dernière décennie, plusieurs stratégies ont été employées pour définir et isoler les APC natifs de WAT SVF¹³ chez l’homme et la souris. De telles stratégies isolent les CPA en fonction de l’expression à la surface cellulaire de marqueurs de cellules souches mésenchymateuses et de cellules progénitrices communes à l’aide de techniques de séparation cellulaire à base d’anticorps. Ces approches comprennent le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), l’utilisation d’anticorps marqués au fluorophore ou la séparation immunomagnétique des billes (c’est-à-dire des anticorps chimiquement modifiés). Les protéines de surface cellulaire ciblées pour l’isolement des APC comprennent PDGFRα, PDGFRβ, CD34 et SCA-1. Ces approches ont contribué à enrichir pour les APC ; Cependant, les populations cellulaires isolées sur la base de ces marqueurs sont assez hétérogènes. Des études très récentes de séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) ont mis en évidence l’hétérogénéité moléculaire et fonctionnelle des cellules stromales au sein de la fraction stromale-vasculaire (SVF) isolée du WAT^murin 14,15,16,17. À partir de nos propres analyses fonctionnelles et de scRNA-seq, nous avons identifié et caractérisé des sous-populations de cellules périvasculaires PDGFRβ+ immunomodulatrices et adipogéniques fonctionnellement distinctes dans le compartiment stromal du WAT intra-abdominal chez des souris adultes¹⁵. Les précurseurs fibro-inflammatoires, ou FIP, représentent une sous-population importante de cellules PDGFRβ+ et peuvent être isolés sur la base de l’expression de LY6C (cellules LY6C+ PDGFRβ+)¹⁵. Les FIP n’ont pas de capacité adipogénique, exercent une forte réponse pro-inflammatoire à divers stimuli, produisent du collagène et sécrètent des facteurs anti-adipogènes¹⁵. L’activité pro-inflammatoire et fibrogénique de ces cellules augmente en association avec l’obésité chez la souris, impliquant ces cellules en tant que régulateurs du remodelage de WAT. La sous-population LY6C- CD9- PDGFRβ+ représente les cellules précurseurs adipocytaires (CPA). Ces APC sont enrichis dans l’expression de Pparg et d’autres gènes pro-adipogènes, et se différencient facilement en adipocytes matures in vitro et in vivo¹⁵. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l’isolement de ces populations cellulaires distinctes à partir de dépôts WAT intra-abdominaux de souris adultes à l’aide de FACS, et la séparation immunomagnétique des billes avec des anticorps biotinylés. Ce protocole peut être utilisé pour isoler des sous-populations de progéniteurs adipeux fonctionnellement distinctes à partir de plusieurs dépôts WAT intra-abdominaux de souris mâles et femelles adultes¹⁵. L’étude isolée de ces populations cellulaires fonctionnellement distinctes pourrait grandement contribuer à notre compréhension actuelle des mécanismes moléculaires qui régulent l’adipogenèse et le remodelage du tissu adipeux intra-abdominal dans la santé et la maladie.

Le protocole ci-dessous détaille l’isolement des progéniteurs adipeux à partir du WAT épididymaire murin ; cependant, la même procédure peut être utilisée pour isoler les cellules correspondantes des dépôts WAT mésentériques et rétropéritonéaux des souris mâles et femelles¹⁵. Un protocole détaillé sur la façon d’identifier et d’isoler ces dépôts chez la souris peut être trouvé dans Bagchi et ^al.18. Ce protocole a été optimisé pour l’utilisation de souris âgées de 6 à 8 semaines. La fréquence et la capacité de différenciation des CPA peuvent diminuer en association avec le vieillissement.

Tous les protocoles et procédures pour les animaux ont été approuvés par le comité institutionnel d’utilisation et de soins des animaux du Southwestern Medical Center de l’Université du Texas.

1. Isolement de la fraction vasculaire stromale (SVF) à partir du tissu adipeux blanc gonadique

1. Disséquez le tissu adipeux blanc gonadique de souris âgées de 6 à 8 semaines et placez des coussinets adipeux dans une solution 1x PBS.
2. Combinez jusqu’à 4 dépôts de graisse (2 à 4 dépôts de 1 à 2 souris recommandés) et hachez le tissu dans un bécher de 10 ml contenant 200 μL de tampon de digestion (1x HBSS, 1,5% BSA et 1 mg/mL de collagénase D).
3. Transférez le tissu haché dans un tube à centrifuger de 50 ml contenant 10 ml de tampon de digestion.
4. Incuber le mélange à 37 °C dans un bain-marie pendant 1 h en agitant.
5. Filtrez le tissu digéré à travers une passoire cellulaire de 100 μm pour éliminer les tissus non digérés.
6. Diluer l’échantillon filtré à 30 mL avec du PBS contenant 2 % de FBS, puis centrifuger à 600 x g pendant 5 min à 4 °C. Aspirez le surnageant, qui contient les adipocytes matures.
7. Passez immédiatement à la méthode d’isolement cellulaire préférée.

2. Isolation des APC et FIP à l’aide de FACS

1. Dissoudre la pastille dans 1 mL de 1 tampon de lyse RBC en secouant doucement le tube.
2. Incuber à RT pendant 1 à 2 min.
3. Ajouter 10 mL de FBS/PBS à 2 % et passer à travers une crépine à cellules de 40 μm dans un tube à centrifuger propre de 50 mL.
4. Centrifugeuse à 600 x g pendant 5 min à 4 °C.
5. Aspirer le milieu et remettre en suspension la pastille dans 400-800 μL de bloc Fc à 2 % contenant du FBS/PBS (1:200).
6. Incuber à 4 °C pendant 10 min.
7. Transférez 400 μL-800 μL de suspensions cellulaires contenant ≤10⁶ cellules par mL dans des tubes de 1,5 mL et ajoutez des anticorps. Les concentrations d’anticorps sont indiquées dans la section Tableau des matières .
   1. Préparez des tubes de contrôle séparés pour 1) les cellules non colorées, 2) les contrôles monocolores et 3) les contrôles FMO (fluorescence moins un).
   2. Colorer les échantillons avec des anticorps PDGFRβ, CD45, CD31, CD9, LY6C.
8. Incuber à 4 °C pendant 15 min à l’abri de la lumière.
9. Centrifugeuse à 600 x g pendant 5 min à 4 °C.
10. Aspirer le milieu et remettre en suspension les cellules dans 400 μL de 2 % FBS/PBS.
11. Centrifugeuse à 600 x g pendant 5 min à 4 °C.
12. Aspirer le milieu et remettre en suspension les cellules dans 400-800 μL à 2 % FBS/PBS. Passez ensuite à travers des capuchons filtrants de 40 μm dans des tubes en polystyrène à fond rond de 5 mL pour FACS.
13. Suivez les étapes suivantes pour le gating.
    1. Utilisez des commandes non colorées et unicolores pour la compensation.
    2. Utilisez les commandes FMO pour définir des portes expérimentales.
    3. Utilisez la stratégie de contrôle illustrée à la figure 1 pour obtenir des APC et des FIP. Les APC de porte sous forme de cellules CD45^- CD31^- PDGFRβ⁺ LY6C^- CD9^- et les FIP sous forme de cellules CD45^- CD31^- PDGFRβ⁺ LY6C⁺ .
14. Recueillir les cellules triées dans des tubes contenant 500 μL de sérum à 100 % et maintenir les cellules sur de la glace.
15. Cellules de centrifugation à 600 x g pendant 5 min à 4 °C. Ajouter 2 % de FBS/PBS pour laver les cellules en centrifugeant à nouveau à 600 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant, utilisez les cellules granulées.
16. Remettre en suspension les cellules granulées dans le volume approprié de milieu de culture APC gonadique (pour la culture cellulaire) ou dans un tampon approprié pour une analyse ultérieure.

3. Séparation immunomagnétique des fractions adipogéniques et non adipogènes

1. Isolez le SVF du tissu adipeux blanc gonadique en suivant les étapes 1.1-1.7.
2. Aspirez le surnageant et mettez à nouveau en suspension la pastille SVF dans 10 mL de 1 tampon MS disponible dans le commerce.
3. Filtrer la suspension cellulaire à travers une crépine de 40 μm.
4. Centrifugeuse à 600 x g pendant 5 min à 4 °C.
5. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules granulées dans 100 μL de 1x MS Buffer.
6. Effectuez la déplétion des cellules CD31⁺ et CD45⁺ comme indiqué ci-dessous (Figure 2A, étape 1). Ceci est fait pour éliminer les cellules endothéliales et hématopoïétiques.
   1. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules et ajustez la concentration à ≤ 1 x 10⁸ cellules/ml.
   2. Ajouter les anticorps CD31 et CD45 conjugués à la biotine à la suspension cellulaire, chacun à une concentration de ≤ 0,25 μg par 10⁶ cellules et incuber sur glace pendant 15 min.
   3. Lavez les cellules en ajoutant 4 ml de 1x MS Buffer.
   4. Centrifugeuse à 600 x g pendant 5 min à 4 °C.
   5. Aspirez le surnageant et remettez la pastille en suspension avec 100 μL de 1x tampon MS.
   6. Ajouter 10 μL de nanobilles de streptavidine et incuber les cellules sur de la glace pendant 15 min.
   7. Lavez les cellules en ajoutant 4 ml de 1 tampon MS.
   8. Centrifuger à 600 x g pendant 5 min à 4 °C, puis aspirer le surnageant.
   9. Remettre les cellules en suspension dans 2,5 mL de tampon 1x MS et transférer dans un tube en polypropylène de 5 mL.
   10. Placez le tube dans la grille magnétique pendant 5 min.
   11. Prélever les cellules non marquées en versant la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger propre de 15 ml.
       REMARQUE : Évitez de secouer ou d’éponger les gouttelettes suspendues car cela entraîne une contamination par une fraction cellulaire indésirable.
   12. Retirez le tube de l’aimant et répétez les étapes 3.6.9. au 3.6.11. deux fois de plus pour un total de 3 lavages.
7. Séparation des fractions adipogéniques et non adipogènes (Figure 2A, étape 2)
   1. Continuez à travailler avec la fraction non étiquetée (c’est-à-dire la fraction CD45^--CD31-).
   2. Centrifuger le tube de 15 mL contenant des cellules non marquées à 600 x g pendant 5 min à 4 °C.
   3. Aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 100 μL de 1x tampon MS.
   4. Ajouter des anticorps LY6C et CD9 conjugués à la biotine, respectivement, à une concentration de ≤ 0,25 μg par 10⁶ cellules et incuber sur glace pendant 15 min.
   5. Suivez les étapes 3.6.3. au 3.6.12. pour compléter la deuxième séparation.
   6. Collecter les fractions non liées. Les cellules non marquées (LY6C-CD9^-) représentent une fraction adipogénique contenant des APC (Figure 2A, Étape 3).
   7. Retirez le tube de l’aimant, remettez en suspension et éluez les cellules liées dans 1x tampon MS. Les éluats ou fraction marquée (LY6C⁺ CD9⁺) représentent une fraction non adipogénique contenant des FIP (Figure 2A, étape 3).
   8. Centrifuger les fractions marquées et non marquées à 600 x g pendant 5 min jusqu’aux cellules de granulés à 4 °C.
8. Passer immédiatement à la culture cellulaire (étape 6) ou utiliser des précurseurs indifférenciés pour les analyses souhaitées (étape 4 et/ou étape 5).

4. Évaluer la pureté des fractions adipogéniques et non adipogéniques par cytométrie en flux

1. Mettre en suspension des fractions cellulaires isolées par des billes dans 200 à 400 μL de bloc Fc contenant 2 % de FBS/PBS (1:200).
2. Incuber à 4 °C pendant 10 min.
3. Transférez la suspension cellulaire dans des tubes de 1,5 mL et ajoutez des anticorps. Les concentrations d’anticorps sont indiquées dans le tableau des matières.
   1. Préparez des tubes de contrôle séparés pour 1) les cellules non colorées, 2) les commandes monocolores et 3) les commandes FMO.
   2. Aux échantillons, ajoutez des anticorps CD45, CD31, CD9 et LY6C.
4. Incuber à 4 °C pendant 15 min à l’abri de la lumière.
5. Centrifuger à 600 x g pendant 5 minutes à 4 °C.
6. Aspirer des cellules surnageantes et les remettre en suspension dans 400 μL de FBS/PBS à 2 %.
7. Centrifuger la suspension à 600 x g pendant 5 min à 4 °C.
8. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 400-800 μL de 2% FBS/PBS. Filtrer à travers des capuchons filtrants de 40 μm dans des tubes à fond rond en polystyrène de 5 mL pour analyse par cytométrie en flux.
9. Analyse par cytométrie en flux pour évaluer la pureté
   1. Utilisez des commandes non colorées et unicolores pour la compensation.
   2. Utilisez les commandes FMO pour définir des portes expérimentales.
   3. Utilisez la stratégie de contrôle pour les cellules actives et uniques, comme illustré à la figure 2B.
   4. Effectuez le déclenchement comme illustré à la Figure 2B pour les CD45, CD31, LY6C et CD9.
   5. Utilisez un logiciel de cytométrie en flux pour évaluer les fréquences des cellules CD45^- CD31^- LY6C^- CD9^- (APC) et des cellules CD45^- CD31^- LY6C⁺ (FIP) au sein de fractions isolées.

5. Analyse de l’expression génique par PCR quantitative pour évaluer la pureté des FIP et des APC

1. Extraire l’ARNm de cellules isolées magnétiquement ou FACS à l’aide d’un kit d’extraction disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) en suivant les instructions du fabricant.
2. Utilisez 1 μg d’ARN pour synthétiser l’ADNc à l’aide d’un kit de transcriptase inverse de l’ADNc (voir le tableau des matériaux) en suivant les instructions du fabricant.
3. Déterminez les niveaux relatifs d’ARNm des gènes sélectifs APC et FIPs (Tableau 1) par PCR quantitative à l’aide du master mix de PCR verte SYBR.
   1. Configurez la réaction de l’échantillon pour la PCR comme suit : 5 μL de colorant vert 2x SYBR, 1 μL d’ADNc (~50 ng/μL), 0,5 μL de chaque amorce directe et inverse (10 μM) et 3 μL d’eau.
   2. Utiliser les conditions standard de PCR suivantes pour l’exécution de la PCR quantitative : étape de maintien : 50 °C pendant 2 min, 95 °C pendant 10 min ; Étape de PCR (40 cycles) : 95 °C pendant 15 s, 60 °C pendant 1 min.
4. Normalisez les valeurs aux niveaux du gène d’entretien ménager (Rps18) en calculant ΔΔ-Ct.
5. Pour évaluer la signification statistique, effectuez le test t de Student non apparié.

6. Culture cellulaire et différenciation

1. Centrifuger les cellules isolées magnétiquement ou FACS à 600 x g pendant 5 min à 4 °C.
2. Remettre la pastille en suspension dans 500 μL de milieu de culture APC gonadique et déposer une plaque de 40 000 cellules/puits à partir de chaque fraction d’une plaque de culture de 48 puits.
3. Remplacez le support tous les 1 à 2 jours. Les APC commenceront à se différencier en adipocytes à mesure qu’ils approchent de la confluence. Les PIF maintenues dans le même milieu résistent à l’adipogenèse.

Ce protocole décrit deux stratégies qui permettent d’isoler des populations distinctes de cellules stromales à partir de dépôts WAT intra-abdominaux de souris adultes. Les CPA et les FIP peuvent être isolés par FACS (Figure 1) ou par séparation immunomagnétique des billes avec des anticorps biotinylés (Figure 2). Les deux approches utilisent des réactifs et des anticorps qui sont tous disponibles dans le commerce. La séparation immunomagnétique des billes conduit à la séparation des cellules adipogènes des cellules non adipogéniques de la SVF gWAT. L’analyse par cytométrie en flux a montré que 75 % des cellules de la fraction adipogénique représentaient des APC LY6C-CD9-. >75% de la fraction non adipogénique représentait des FIP (cellules LY6C+).

Figure 1 : Isolement de sous-populations de cellules stromales β PDGFR + à partir de WAT gonadiques par FACS. (A) Vue d’ensemble schématique de la procédure : La fraction vasculaire stromale (cellules non adipocytaires) a été séparée des adipocytes matures par digestion enzymatique du tissu et centrifugation. Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) a ensuite été utilisé pour éliminer les cellules endothéliales (CD31+) et hématopoïétiques (CD45+) et isoler les cellules LY6C+ PDGFRβ+ (FIP) et les cellules LY6C-CD9- PDGFRβ+ (APC). (B) Portes de collecte représentatives du FACS. Le panneau A est reproduit à partir de la réf.11 avec autorisation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Séparation des cellules stromales adipogéniques et non adipogéniques par séparation immunomagnétique des billes. (A) Vue d’ensemble schématique de la procédure : Étape 1 : Les cellules CD31+ et CD45+ se lient à l’aimant. Cela élimine à la fois les cellules endothéliales et hématopoïétiques. L’éluat contenant des cellules CD31 et CD45 a été collecté, puis incubé avec des anticorps reconnaissant LY6C et CD9, respectivement. Étape 2 : Liaison des cellules CD9+ et LY6C+ à l’aimant. Étape 3 : Le surnageant (fraction non liée) contenant des cellules CD9- et LY6C- a été collecté car il représentait la fraction adipogénique (APC). Les cellules CD9+ et LY6C+ non adipogéniques liées à des nanosphères ont été éluées sous la forme de la fraction non APC contenant des FIP. (B) Analyse par cytométrie en flux pour évaluer la fréquence des CPA (LY6C-CD9-) et des FIPs (LY6C+) dans les fractions adipogéniques et non adipogéniques, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La microscopie optique et l’analyse de l’expression génique démontrent que les APC isolés par les FACs ou par séparation magnétique des billes de gWAT de souris âgées de 6 à 8 semaines se sont différenciés en adipocytes contenant des lipides à un degré élevé dans les 7 à 10 jours suivant l’ensemencement initial des cellules dans les milieux de culture APC Gonadal (Figure 3). En revanche, les précurseurs non adipogéniques (tels que les précurseurs fibro-inflammatoires, ou FIP) sont restés de type fibroblaste et did ne deviennent pas des adipocytes lorsqu’ils sont maintenus dans le même milieu de culture (milieu de culture Gonadal APC) (Figure 3). Il convient de noter que peu de cellules dans les cultures non APCs ont montré une certaine accumulation de lipides (Figure 3D). Ceux-ci proviennent probablement d’une contamination par l’APC pendant l’isolement de la cellule. Des lavages supplémentaires peuvent améliorer la pureté de cette fraction.

Figure 3 : Différenciation in vitro de populations de cellules stromales β PDGFR + isolées à partir de gWAT de souris adultes. (A-D) Images représentatives en fond clair de sous-populations de cellules stromales différenciées isolées par séparation immunomagnétique des billes (A-B) ou FACS (C-D) de souris âgées de 6 à 8 semaines. Les images ont été prises sept jours après le placage des cellules dans les milieux de culture APC de Gonadal. Dans les 7 à 10 jours suivant l’ensemencement, les APC subissent une différenciation adipocytaire spontanée. Grossissement 10X. Échelle = 250 μM. (E-F) Niveaux d’ARNm des gènes sélectifs des adipocytes dans les cultures différenciées montrés en A-D. Les graphiques à barres représentent la moyenne + le SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Séquences d’amorces qPCR utilisées pour valider l’isolement des FIP et des APC

T.A.P. est employé et actionnaire de Novo Nordisk A/S