Ce protocole décrit l’approche technique permettant d’isoler des sous-populations de cellules stromales adipogènes et fibro-inflammatoires à partir de dépôts de tissu adipeux blanc (WAT) intra-abdominal murin par tri cellulaire activé par fluorescence ou séparation immunomagnétique des billes.
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Article de méthode
Isolement de sous-populations de cellules stromales adipogènes et fibro-inflammatoires à partir de dépôts adipeux intra-abdominaux murins
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
La fraction stromo-vasculaire (SVF) du tissu adipeux blanc (WAT) est remarquablement hétérogène et se compose de nombreux types de cellules qui contribuent fonctionnellement à l’expansion et au remodelage du WAT à l’âge adulte. Un obstacle considérable à l’étude des implications de cette hétérogénéité cellulaire est l’incapacité à isoler facilement des sous-populations cellulaires fonctionnellement distinctes de la FVS WAT pour les analyses in vitro et in vivo. La technologie de séquençage unicellulaire a récemment permis d’identifier des sous-populations de cellules périvasculaires PDGFRβ+ fibro-inflammatoires et adipogéniques fonctionnellement distinctes dans les dépôts WAT intra-abdominaux de souris adultes. Les progéniteurs fibro-inflammatoires (appelés « FIP ») sont des cellules productrices de collagène non adipogéniques qui peuvent exercer un phénotype pro-inflammatoire. Les cellules précurseurs adipocytaires (APC) PDGFRβ+ sont hautement adipogènes à la fois in vitro et in vivo lors de la transplantation cellulaire. Ici, nous décrivons plusieurs méthodes pour l’isolement de ces sous-populations de cellules stromales à partir de dépôts WAT intra-abdominaux murins. Les FIP et les APC peuvent être isolés par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) ou en tirant parti de la technologie des billes immunomagnétiques à base d’anticorps biotinylés. Les cellules isolées peuvent être utilisées pour l’analyse moléculaire et fonctionnelle. L’étude isolée des propriétés fonctionnelles de la sous-population de cellules stromales élargira nos connaissances actuelles sur le remodelage du tissu adipeux dans des conditions physiologiques ou pathologiques au niveau cellulaire.
Introduction
Le tissu adipeux blanc (WAT) représente le principal site de stockage d’énergie chez les mammifères. Dans ce tissu, les adipocytes, ou « cellules adipeuses », stockent les calories en excès sous forme de triglycérides, emballés dans de grosses gouttelettes lipidiques uniloculaires. De plus, les adipocytes sécrètent une multitude de facteurs qui régulent divers aspects de l’homéostasie énergétique 1,2,3. Les adipocytes constituent l’essentiel du volume de WAT ; cependant, les adipocytes ne représentent que moins de 50% du total des cellules présentes da....
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Protocole
Tous les protocoles et procédures pour les animaux ont été approuvés par le comité institutionnel d’utilisation et de soins des animaux du Southwestern Medical Center de l’Université du Texas.
1. Isolement de la fraction vasculaire stromale (SVF) à partir du tissu adipeux blanc gonadique
- Disséquez le tissu adipeux blanc gonadique de souris âgées de 6 à 8 semaines et placez des coussinets adipeux dans une solution 1x PBS.
- Combinez jusqu’à 4 dépôts de graisse (2 à 4 dépôts de 1 à 2 souris recommandés) et hachez le tissu dans un bécher de 10 ml contenant 200 μL de tampon de digestion (1x HBSS, 1,5% BSA et 1 mg/mL de collagé....
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Résultats
Ce protocole décrit deux stratégies qui permettent d’isoler des populations distinctes de cellules stromales à partir de dépôts WAT intra-abdominaux de souris adultes. Les CPA et les FIP peuvent être isolés par FACS (Figure 1) ou par séparation immunomagnétique des billes avec des anticorps biotinylés (Figure 2). Les deux approches utilisent des réactifs et des anticorps qui sont tous disponibles dans le commerce. La séparation immunomagnétique des billes condui.......
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Discussion
La souche C57BL/6 de souris est la souche de souris la plus utilisée dans les études sur l’obésité induite par l’alimentation. Les souris C57BL/6 prennent rapidement du poids lorsqu’elles sont soumises à un régime riche en graisses (HFD) et développent certaines des caractéristiques principales du syndrome métabolique associé à l’obésité (par exemple, la résistance à l’insuline et l’hyperlipidémie). Notamment, l’expansion de WAT se produisant en association avec une alimentation riche en graisses (HFD) se produit d’une m.......
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Déclarations de divulgation
T.A.P. est employé et actionnaire de Novo Nordisk A/S
Remerciements
Les auteurs sont reconnaissants à Lisa Hansen et Kirsten Vestergaard pour leur excellente assistance technique, ainsi qu’à P. Scherer, N. Joffin et C. Crewe pour la lecture critique du manuscrit. Les auteurs remercient le Flow Cytometry Core de l’UTSW pour ses excellents conseils et son aide dans l’élaboration des protocoles décrits ici. R.K.G. est pris en charge par NIDDK R01 DK104789, NIDDK RC2 DK118620 et NIDDK R01 DK119163. J.P. est financé par une bourse pré-doctorale du Fonds d’innovation du Danemark.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| forte et isolation SVF | |||
| 40 et 100 & micro ; Filtres à cellules m | Fisher Scientific | 352340/352360 | |
| 1X Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) | Fisher Scientific | 21040CV | |
| 5ml Tubes en polypropylène | Fisher Scientific | 352053 | |
| Digestion Buffer (pour 10mL) | |||
| 10 ml HBSS | Sigma | H8264 | |
| 10 mg de collagénase D (1 mg/ml cc final) | Roche | 11088882001 | |
| 0,15 g BSA (1,5 % cm³ final) | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
| Séparation immunomagnétique des APC et des non-APC | |||
| 5X MojoSort Buffer (tampon MS) | BioLegend | 480017 | |
| 5 ml MojoSort Magnet (aimant MS) | BioLegend | 480019 | |
| 100 µ ; L MojoSort Streptavidin Nanobeads | BioLegend | 480015 | |
| Purity Check et FACS | |||
| 10X Red Blood Cell Lysis | Buffer eBioscience | 00-4300-54 | |
| Fc block (Souris CD16/CD32) | eBioscience | 553141 | |
| Antibodies | |||
| Biotine CD45 | BioLegend | 103103 | Concentration : &le ; 0,25 & micro ; g pour 10^6 cellules Espèce : Souris Clone : 30-F11 |
| Biotine CD31 | BioLegend | 102503 | Concentration : &le ; 0,25 µ ; g pour 10^6 cellules Espèce : Souris Clone : MEC13.3 |
| Biotine CD9 | BioLegend | 124803 | Concentration : &le ; 0.25 µ ; g pour 10^6 cellules Espèce : Souris Clone : MZ3 |
| Biotine LY6C | BioLegend | 128003 | Concentration : &le ; 0,25 µ ; g par 10^6 cellules Espèce : Souris Clone : HK1.4 |
| CD31-PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 102419 | Concentration : Dilution 1:400 Espèce : Souris Clone : 390 |
| CD45-PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 103131 | Concentration : Dilution 1:400 Espèce : Souris Clone : 30-F11 |
| CD140b PDGFR&beta ;-PE | BioLegend | 136006 | Concentration : Dilution 1:50 Espèce : Souris Clone : APB5 |
| LY6C-APC | BioLegend | 128016 | Concentration : Dilution 1:400 Espèce : Souris Clone : HK1.4 |
| CD9-FITC | BioLegend | 124808 | Concentration : Dilution 1:400 Espèce : Souris Clone : MZ3 |
| Culture cellulaire et Différenciation | |||
| Milieu de culture Gonadal APC (pour 500mL) | |||
| 288 mL de DMEM avec 1 g/L de glucose | Corning | 10-014-CV | |
| 192 mL MCDB201 | Sigma | M6770 | |
| 10 mL Sérum de veau fœtal (FBS)** lot #14E024 | Sigma | 12303C | |
| 5 mL Prémélange 100 % ITS | BD Bioscience | 354352 | |
| 5 mL 10 mM Acide L-ascorbique-2-2phosphate | Sigma | A8960-5G | |
| 50 µ ; L 100 g/ml FGF-basic | R& D systems | 3139-FB-025/CF | |
| 5 mL Stylo/Strep | Corning | 30-001-CI | |
| 500 µ ; L Gentamycin | Gibco | 15750-060 | |
| **REMARQUE : La capacité adipogénique des APC primaires peut varier d’un lot à l’autre de FBS commerciaux. Plusieurs lots/sources de FBS doivent être testés. |
Références
- Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nature Reviews Immunology. 11 (2), 85-97 (2011).
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Funcke, J. B., Scherer, P. E.....
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Réimpressions et autorisations
Étiquettes
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