Étude de la fonction du gène cible dans un modèle de colite induite par un anticorps agoniste CD40 à l’aide de technologies basées sur CRISPR/Cas9

Résumé

Ici, nous décrivons la méthodologie permettant d’inactiver un gène d’intérêt dans le système immunitaire à l’aide de technologies basées sur des répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées (CRISPR) et des endonucléases associées à CRISPR (Cas9) et l’évaluation de ces souris dans un modèle de colite induite par des anticorps agonistes de différenciation 40 (CD40).

Résumé

Le système immunitaire fonctionne pour défendre les humains contre les envahisseurs étrangers tels que les bactéries et les virus. Cependant, les troubles du système immunitaire peuvent entraîner une auto-immunité, une maladie inflammatoire et un cancer. Les maladies inflammatoires de l’intestin (MICI), la maladie de Crohn (MC) et la colite ulcéreuse (CU), sont des maladies chroniques marquées par une inflammation intestinale récurrente. Bien que les MII soient les plus répandues dans les pays occidentaux (1 sur 1 000), les taux d’incidence augmentent dans le monde entier. Grâce à des études d’association, les chercheurs ont lié des centaines de gènes à la pathologie des MICI. Cependant, la pathologie élaborée à l’origine des MICI et le nombre élevé de gènes potentiels posent des défis importants pour trouver les meilleures cibles thérapeutiques. De plus, les outils nécessaires à la caractérisation fonctionnelle de chaque association génétique introduisent de nombreux facteurs limitant le taux tels que la génération de souris génétiquement modifiées pour chaque gène. Pour étudier le potentiel thérapeutique des gènes cibles, un système modèle a été développé à l’aide de technologies basées sur des répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées (CRISPR)/endonucléases associées à CRISPR (Cas9) et un anticorps agoniste de différenciation 40 (CD40). La présente étude montre que l’édition médiée par CRISPR/Cas9 dans le système immunitaire peut être utilisée pour étudier l’impact des gènes in vivo. Limitée au compartiment hématopoïétique, cette approche modifie de manière fiable le système immunitaire reconstitué qui en résulte. Les souris modifiées par CRISPR/Cas9 sont générées plus rapidement et sont beaucoup moins chères que les souris génétiquement modifiées traditionnelles. De plus, l’édition CRISPR/Cas9 des souris présente des avantages scientifiques significatifs par rapport à la génération et à la reproduction de souris génétiquement modifiées, tels que la capacité d’évaluer des cibles létales embryonnaires. En utilisant CD40 comme cible modèle dans le modèle de colite induite par des anticorps agonistes CD40, cette étude démontre la faisabilité de cette approche.

Introduction

Les maladies auto-immunes font référence à des conditions dans lesquelles le système immunitaire d’un patient attaque ses propres cellules et organes, entraînant une inflammation chronique et des lésions tissulaires. Près de 100 types différents de maladies auto-immunes ont été décrits à ce jour, affectant 3 à 5 % de la population humaine¹. De nombreuses maladies auto-immunes, y compris le lupus érythémateux disséminé et les MII, manquent de traitements efficaces et présentent d’importants besoins médicaux non satisfaits. Touchant actuellement environ 1,5 million de personnes rien qu’aux États-Unis, la MICI est une maladie dévastatrice caractérisée par une inflammation intestinale progressive, persistante et récurrente sans remède disponible. Il est nécessaire de démêler la pathogenèse et la physiopathologie sous-jacentes pour mettre en œuvre les nouvelles stratégies de traitement et de prévention dont les patients atteints de MICI ont besoin ^2,3.

Plus de 230 loci différents de MII ont été identifiés par des analyses d’association pangénomique (GWAS)⁴. Bien que ces associations aient permis d’élucider de nouveaux gènes qui sont potentiellement des acteurs importants dans les mécanismes et les voies clés des MICI, seuls quelques gènes de ces loci ont été étudiés. Certains gènes ont été impliqués dans des voies spécifiques. Par exemple, la voie de détection des microbes a été liée à la protéine 2 contenant le domaine d’oligomérisation de liaison aux nucléotides (NOD2) ; la voie de l’autophagie a été liée à 16 like 1 (ATG16L1), à la famille M de la GTPase liée à l’immunité (IRGM) et au membre de la famille 9 du domaine de recrutement des caspases (CARD9) ; et la voie pro-inflammatoire a été liée aux réponses des lymphocytes T induites par l’interleukine (IL)-23⁴. Divers modèles de souris in vivo ont été utilisés pour caractériser fonctionnellement les gènes identifiés par GWAS ^5,6.

L’un des principaux modèles utilisés pour étudier la pathogenèse des MII ^7,8 est le modèle CD40 de la colite, qui induit une inflammation intestinale immunitaire innée à la suite de l’injection d’un anticorps agoniste CD40 chez des souris immunodéficientes (cellules T et B). Principalement utilisé pour examiner la contribution de l’immunité innée au développement des MICI, principalement des macrophages et des cellules dendritiques⁹, il n’est pas clair si la maladie peut être induite chez les souris de type sauvage (WT) entièrement immunocompétentes. En plus des modèles animaux, des outils spécifiques aux gènes sont également nécessaires pour la caractérisation fonctionnelle d’un gène, y compris des composés chimiques et des produits biologiques. Plus important encore, les animaux génétiquement modifiés sont essentiels pour révéler la fonction d’un gène spécifique. Cependant, les stratégies généralement utilisées pour faire des souris génétiquement modifiées - injection d’embryons et reproduction - prennent souvent plus d’un an et entraînent un coût financier important. Ce processus de limitation du taux présente un défi important dans la quête visant à élucider les fonctions des gènes liés aux MII identifiés par GWAS.

Le protocole présenté ici offre une alternative viable à l’élevage de souris génétiquement modifiées. Tout d’abord, comme le montre le schéma de la figure 1 , des cellules de tyrosine kinase positives pour la lignée 1, des cellules tyrosine kinase positives pour la tyrosine kinase (Sca1+c-Kit+ ou LSK) sont isolées de la moelle osseuse de souris Cas9 knockin (KI) portant un allèle spécifique (CD45.2) pour permettre le suivi des cellules immunitaires du donneur. Ensuite, ces cellules sont exposées à des lentivirus portant différents ARN guides (ARNg) et un marqueur fluorescent, la protéine fluorescente verte excitée par le violet (VexGFP), pour permettre le suivi des cellules transduites. Deux jours plus tard, les cellules VexGFP+ sont triées et injectées dans des souris Ly5.1 Pep Boy receveuses irradiées létalement, qui sont des souris C57Bl/6 portant l’allèle CD45.1 pour permettre le suivi des cellules immunitaires du receveur. Douze semaines plus tard, le système immunitaire est entièrement reconstitué et les souris peuvent être inscrites dans des modèles in vivo.

En plus de l’avantage de réaliser des économies et d’accélérer le délai de génération par rapport à la génération et à la reproduction d’animaux génétiquement modifiés, cette méthodologie est idéale pour les cibles à létalité embryonnaire, car elle cible spécifiquement le compartiment hématopoïétique. De plus, pour les cibles où il n’y a pas d’outils disponibles, comme un anticorps, ce système offre une approche réalisable. En résumé, pour relever les défis décrits jusqu’à présent, une plateforme d’édition du génome in vivo basée sur CRISPR/Cas9 a été développée pour générer rapidement des modèles animaux génétiquement modifiés 10,11,12,13,14. Cette étude démontre que l’inflammation intestinale chez les souris WT C57Bl/6 peut être induite par un anticorps agoniste CD40. CD40 est un régulateur clé de la maladie dans ce modèle et a donc été utilisé comme cible modèle pour valider l’inactivation et la perte de fonction génique basées sur CRISPR/Cas9.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux effectuées selon ce protocole doivent être approuvées par le comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) concerné. Toutes les procédures décrites ici ont été approuvées par l’IACUC d’AbbVie.

1. Production des lentivirus nécessaires et obtention d’animaux donneurs et receveurs

REMARQUE : La table des matériaux comprend les détails de la source et du numéro de commande de tous les animaux, instruments et réactifs utilisés dans ce protocole.

1. Construisez les plasmides à l’aide d’un vecteur lentiGuide-puro modifié en VexGFP ou mCherry.
   1. Clonez l’ARNg brouillé non ciblé (SgNone) ou l’ARNg ciblant CD40 dans le vecteur modifié.
      REMARQUE : Dans cette étude, les séquences de chaque ARNg étaient les suivantes : SgNone, CTATGATTGCAACTGTGCAG ; SgCD40.1, AGCGAATCTCTCTGTTCCAC ; SgCD40.2, GACAAACAGTACCTCCACGA ; et SgCD40.3, ACGTAACACACTGCCCTAGA.
   2. Produire les particules lentivirales comme décrit précédemment¹⁵.
      1. Co-transfectez les plasmides codant pour l’ARNg dans des cellules 293T avec des plasmides d’emballage VSV-G et pLex.
      2. Changer le milieu de culture après 18 h de transfection et recueillir les surnageants contenant le virus après 24 à 48 h après le changement de milieu.
      3. Pour évaluer l’efficacité de l’ARNg CD40, générez une lignée cellulaire 293T stable CD40 par transfection d’un plasmide pcDNA3.1 qui code pour CD40.
   3. Transfectez les cellules à l’aide des lentivirus décrits et évaluez-les par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) deux semaines plus tard.
      REMARQUE : Des souris Cas9 KI ont été utilisées comme souris donneuses. Assurez-vous que les souris Cas9 KI se trouvent sur un fond C57Bl/6 (et qu’elles expriment l’allèle CD45.2) lors de l’utilisation de souris Pep Boy C57Bl/6-Ly5.1 (exprimant l’allèle CD45.1) comme receveuses, afin d’éviter la GvHD et de suivre les cellules donneuses et receveuses.
2. Concevez l’expérience. Pour l’inactivation génique (KO), utilisez 3 à 6 ARNg par gène. Pour chaque ARNg, préparez 20 % de souris receveuses supplémentaires pour tenir compte de la perte d’animaux pendant et après la transplantation.
   REMARQUE : Le modèle de colite induite par l’anticorps agoniste CD40 nécessite un minimum de 8 souris par groupe pour l’alimentation statistique. Par conséquent, 10 souris par ARNg ont été préparées dans cette étude. Le nombre de souris nécessaires pour d’autres modèles in vivo variera en fonction du modèle utilisé.
3. Utilisez des souris donneuses et receveuses de même sexe âgées de 8 à 12 semaines.
   REMARQUE : Les souris ont été euthanasiées conformément aux directives approuvées par l’IACUC en utilisant un minimum de 5 % d’isoflurane et confirmées avec une luxation cervicale comme méthode secondaire.

2. Prélèvement de moelle osseuse et préparation au tri cellulaire

1. À l’aide de pinces et de ciseaux, prélevez les os de chaque souris donneuse (fémur, tibia, humérus et cubitus), en retirant soigneusement autant de muscle et de tissu que possible.
2. Percez le fond d’un tube de microcentrifugation de 0,6 mL avec une aiguille de 23 G et placez le tube à l’intérieur d’un tube à centrifuger de 1,5 mL. Faites 2 ensembles par animal.
3. Ouvrez une extrémité des os et placez 4 à 8 os à l’intérieur du tube de microcentrifugation, les extrémités ouvertes tournées vers le trou de l’aiguille de 23 G.
   REMARQUE : Le nombre d’os par tube dépend de l’os, par exemple, 8 tibias, humérus et cubitus ou 4 fémurs conviendront.
4. Centrifuger les tubes (avec le tube de microcentrifugation de 0,6 mL contenant les os à l’intérieur du tube de centrifugation de 1,5 mL) à 300 × g pendant 2 min à température ambiante (RT).
5. Jetez le tube de microcentrifugation de 0,6 ml, qui contient maintenant des os sans moelle, ne laissant que le tube de centrifugeuse de 1,5 ml maintenant rempli de moelle. Ajouter 1 mL de tampon de lyse des globules rouges (contenant du chlorure d’ammonium) dans chaque tube à centrifuger et remettre la pastille en suspension par pipetage. Incuber à RT pendant 1 min. Répétez l’étape de lyse si nécessaire.
6. Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 ml et ajoutez la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) sans calcium ni magnésium (au moins le double du volume de la suspension cellulaire) pour neutraliser le tampon de lyse. Cellules à granulés à 300 × g pendant 5 min. Aspirez complètement le surnageant.
7. Chargez un filtre de 70 μm sur un tube conique de 50 mL et filtrez les cellules à travers, en utilisant DPBS pour laver le tube et le filtre. Jetez le filtre et comptez les cellules.
   REMARQUE : L’utilisation de 30 souris donneuses (âgées de 12 semaines) donnera en moyenne 200 à 300 × 10⁶ cellules.

3. Tri cellulaire pour isoler les cellules LSK pour la transduction

1. Remettre en suspension les cellules comptées à l’étape 2.7 dans un tampon de tri cellulaire magnétique (DPBS, 2 mM d’acide éthylènediamine tétraacétique, 0,5 % d’albumine sérique bovine, 10 μg/mL de pénicilline-streptomycine) dans le volume souhaité (90 μL par 10^{à 7} cellules).
2. Ajouter 10 μL de billes CD117+ par 10⁷ cellules. Bien mélanger, à l’abri de la lumière et incuber à 4 °C pendant 15 min.
3. Préparez la colonne MACS LS en plaçant la colonne dans le champ magnétique et en la rinçant avec un tampon MACS.
4. Lavez les cellules de l’étape 3.2 avec un volume approprié de tampon MACS (au moins le double de votre volume) et centrifugez-les à 300 × g pendant 10 min.
5. Aspirez complètement le surnageant. Remettre la pastille en suspension de manière à ce que la concentration finale soit de 10^{à 8} cellules dans 500 μL de tampon MACS.
6. Appliquez la suspension cellulaire sur la colonne LS. Laver 3 fois avec 3 ml de tampon MACS.
   REMARQUE : Une colonne LS peut prendre jusqu’à 10⁸ cellules étiquetées et 2 × 10⁹ cellules au total.
7. Retirez la colonne du séparateur magnétique et placez-la dans un tube de collecte approprié. Ajoutez 5 ml de tampon MACS et rincez immédiatement les cellules marquées magnétiquement en poussant fermement le piston dans la colonne.
8. Granulez les cellules à 300 × g pendant 10 min. Aspirez complètement le surnageant.
9. Remettre les cellules en suspension dans 100 μL de tampon MACS par 10^{à 7} cellules, et ajouter les anticorps colorants pour la lignée (CD3, B220, Ter119, Gr-1, CD11b) et Sca-1.
   REMARQUE : L’utilisation de 30 souris donneuses (âgées de 12 semaines) donnera en moyenne 100 à 180 × 10⁶ cellules.
10. Bien mélanger, à l’abri de la lumière et incuber à 4 °C pendant 20 min.
11. Laver les cellules en ajoutant 5 à 10 ml de tampon MACS et centrifuger à 300 × g pendant 10 min. Aspirez complètement le surnageant.
12. Ré-suspendrejusqu’à 10⁸ cellules dans 500 μL de tampon MACS
13. Filtrez les cellules à l’aide d’une crépine de 70 μm et effectuez un FACS pour la population de lignée Sca1+.
    REMARQUE : Environ 1,8 à 2,6 % de la population devrait être de lignée Sca1+.
14. Prélever les cellules dans un milieu de culture LSK (100 μL par 10 000 cellules) : milieu d’expansion sans sérum, 100 ng/mL de thrombopoïétine, facteur de cellules souches de souris, ligand tyrosine kinase 3 lié à Fms et IL-7 avec 100 μg/mL de pénicilline-streptomycine.
15. Cellules à granulés à 300 × g pendant 10 min. Aspirez complètement le surnageant.

4. Transduction et culture de LSK pour générer des cellules de contrôle et d’inactivation

1. Remettre les cellules en suspension dans le milieu de culture LSK.
2. Ensemencez 10 000 cellules par puits dans des plaques de culture tissulaire à fond plat (TC) à 96 puits dans un milieu de culture LSK.
3. Incuber toute la nuit à 37 °C avec 5 % de CO₂ et 95 % d’humidité dans des conditions aseptiques.
4. Préparez une solution de rétronectine de 50 μg/mL dans du DPBS et ajoutez 300 μL dans chaque puits d’une plaque de polystyrène à 24 puits non traitée par TC. Incuber toute la nuit à 4 °C.
5. Le lendemain, jetez la solution de rétronectine, rincez la plaque revêtue avec 300 μL de DPBS et répétez.
6. Transférez 50 000 cellules LSK dans 500 μL de milieu (5 puits de la plaque à 96 puits à l’étape 4.2) vers chaque puits recouvert de rétronectine de la plaque de polystyrène à 24 puits à l’étape 4.4.Utilisez 100 μL supplémentaires de milieu LSK par 5 puits pour rincer et recueillir les cellules supplémentaires restantes dans la plaque à 96 puits. Assurez-vous que 600 μL est le volume par puits dans la plaque de 24 puits après cette étape (5 puits × 100 μL de la plaque de 96 puits + 100 μL utilisés pour laver ces 5 puits).
   REMARQUE : Après le transfert, regardez au microscope la plaque de 24 puits maintenant vide pour confirmer que toutes les cellules ont été collectées. Utilisez le milieu LSK pour collecter les cellules qui n’ont pas été transférées afin de minimiser la perte de cellules de cette petite population.
7. Ajouter 300 μL de surnageant viral dans chaque puits et agiter la plaque à une valeur de réglage de 500 pendant 5 min. Faites tourner la plaque à 600 × g et 37 °C pendant 20 min. Utilisez au moins 5 × 10^{à 6} particules virales par ml.
   REMARQUE : Dans cette étude, un vecteur modifié de pLentiPuro a été utilisé, dans lequel l’élément de résistance à la puromycine a été remplacé par VexGFP. Le virus a été ajouté à une multiplicité d’infection de 50 à 100.
8. Incuber pendant 1 h. Ajouter 500 μL de milieu LSK préchauffé.
9. Incuber pendant 2 jours à 37 °C avec 5 % de CO₂ et 95 % d’humidité dans des conditions aseptiques.

5. Irradiation animale pour préparer la greffe de cellules souches d’un donneur

1. Après 2 jours d’incubation, irradiez les animaux récepteurs avec 475 cGy deux fois à 4 h d’intervalle. Après la deuxième série d’irradiations, placez les animaux dans des cages autoclavées et traitez-les comme des animaux immunodéficients pendant 12 semaines. Les souris ont reçu un enrichissement, un hydrogel et une surveillance du côté de la cage pour fournir des soins de soutien et une intervention au besoin. Les souris peuvent recevoir de la nourriture ou de l’eau antibiotiques en plus des soins de soutien et des méthodes d’intervention.
   NOTE. Les dosages d’irradiation peuvent différer selon les irradiateurs. Effectuez un titrage de dose de l’irradiateur pour identifier le meilleur dosage. Des doses comprises entre 700 et 1300 cGy pour les souris C57Bl/6 se sont avérées efficaces dans divers exemples de la littérature¹⁷. Sélectionnez 3 à 4 doses dans cette plage et évaluez la survie et la greffe de 5 souris par dose. Si la greffe échoue ou si la dose de rayonnement est trop élevée, les souris ne vivront pas plus de 3 semaines après la greffe. À 4 semaines après la greffe, saignez les souris survivantes pour évaluer la greffe par FACS. Nous effectuons des prélèvements sanguins rétro-orbitaires (OI) de ~50-100 μL par souris pour évaluer la greffe. Les souris ont été anesthésiques (2 à 3 % d’isoflurane) pendant le prélèvement et ont reçu un lubrifiant pour les yeux et 1,0 mL de solution saline sous-cutanée comme soins de soutien après les prélèvements sanguins par osmose inverse.

6. Préparation cellulaire et injection chez des animaux récepteurs irradiés

1. Extrayez les cellules de chaque puits à partir de l’étape 4.9, en gardant les groupes séparés maintenant que les cellules ont été transduites avec différents ARNg, et granulez-les à 300 × g pendant 10 min.
2. Suspendez à nouveau les cellules dans la mémoire tampon MACS, filtrez-les à l’aide d’une crépine de 70 μm et triez la population VexGFP+.
   REMARQUE : Environ 10 à 15 % des cellules doivent être VexGFP+.
3. Granulez les cellules à 300 × g pendant 10 min. Remettez-les en suspension dans la solution saline équilibrée de Hank : 5 000 cellules ou plus par souris dans 200 μL.
   REMARQUE : HBSS est de qualité non pharmaceutique. Vous pouvez également envisager d’utiliser une solution saline stérile de qualité pharmaceutique pour injection.
4. Injecter les cellules par voie intraveineuse 3 h après la dernière dose d’irradiation.
   REMARQUE : Douze semaines plus tard, les souris auront un système immunitaire entièrement greffé et pourront être inscrites dans des modèles in vivo.

7. Modèle de colite induite par un anticorps agoniste CD40 chez des souris de type sauvage

REMARQUE : Pesez et évaluez les animaux tous les jours. Fournir des soins de soutien au besoin : 1,0 mL de solution sous-cutanée de chlorure de sodium à 10 % de perte de poids ou s’ils sont déshydratés. Le témoin positif de ce modèle est l’anti-p40 administré par voie intrapéritonéale à raison de 25 mg/kg deux fois par semaine à partir du jour -1.

REMARQUE : Dans cette étude, les groupes expérimentaux comprenaient des groupes témoins naïfs, témoins véhicules (négatifs) et témoins anti-p40 (positifs). Ensemble, ces groupes contrôlent le comportement normal du modèle de colite induite par l’anticorps agoniste CD40. Groupes de vecteurs, de SgNone et d’ARNsg : Le vecteur contrôle le vecteur lentiviral commun, le SgNone est un témoin guide brouillé non ciblé, et les groupes d’ARNsg sont les groupes de « traitement » portant une expression réduite de l’ARNg cible.

1. Jour 0 : Injecter l’anticorps agoniste CD40 à raison de 10 mg/kg par voie intrapéritonéale dans le DPBS chez tous les animaux, à l’exception des témoins naïfs.
2. Jours 3 et 6 : Réalisation d’une vidéo-endoscopie pour évaluer la progression de la maladie comme décrit précédemment¹⁶.
   1. Anesthésier les souris avec 2-3 % d’isoflurane. Fournir un soutien thermique via le mécanisme interne de l’appareil d’anesthésie et/ou un coussin chauffant externe pendant la récupération.
   2. Une fois que les souris sont sous anesthésie, administrez un lavement DPBS (sans calcium ni magnésium) pour préparer le côlon à l’endoscopie.
      REMARQUE : Environ 1 à 2 ml sont nécessaires pour effectuer un lavement.
   3. Après un lavement et sous anesthésie, déplacez la souris vers le cône nasal de l’appareil d’anesthésie.
   4. Insérez doucement l’endoscope dans le côlon, avancez lentement vers le côlon proximal tout en gardant la caméra centrée et le côlon gonflé d’air (à l’aide de la pompe à air incluse ou fixez un tube/seringue pour gonfler manuellement), puis retirez lentement l’endoscope et collectez une vidéo et des images à 3 cm, 2 cm et 1 cm de l’anus.
      REMARQUE : Pour minimiser l’irritation du côlon, un lubrifiant stérile peut être ajouté à l’extrémité de l’endoscope.
   5. Notez chaque image individuellement en fonction du motif vasculaire et de l’épaississement de la muqueuse, comme décrit dans le tableau 1. Combinez les scores des 3 images par souris pour attribuer un score total à chaque animal.
3. Jour 7 : Euthanasier toutes les souris par surdosage d’isoflurane ou chambre de CO₂ , et prélever autant de sang que possible par ponction cardiaque pour le sérum. Peser la rate pour mesurer la splénomégalie et prélever pour la cytométrie en flux, et prélever le côlon pour l’histopathologie.
   REMARQUE : Des coupes de tissu fixé au formol et inclus dans de la paraffine du côlon de souris ont été préparées et utilisées pour l’immunohistochimie (IHC) comme décrit précédemment par Wang et al¹⁹.

Résultats

Suite à la procédure décrite ci-dessus, des souris exprimant de l’ARNg ciblant CD40 ont été générées. À la semaine 2, des cellules B, des macrophages CD11b+ et des cellules dendritiques (DC) CD11c+ ont été greffés (Figure 2). Cependant, comme prévu sur la base de la littérature précédente¹⁸, les cellules T ont mis plus de temps à se greffer complètement et ont nécessité 12 semaines après la greffe pour atteindre ~90 % (

Discussion

Les résultats présentés ici introduisent une nouvelle plateforme d’édition du génome basée sur CRISPR/Cas9 capable d’étudier la fonction des gènes dans ce modèle de colite induite par des anticorps agonistiques CD40. Le tri cellulaire a enrichi le pool de cellules LSK génétiquement modifiées, entraînant une réduction de plus de 90 % de l’expression de CD40 chez les animaux reconstitués, en seulement 4 mois. De plus, l’expression réduite de CD40 dans le système immunitaire a eu un effet p...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaques de culture tissulaire à 6 puits	Corning/Costar	#3506
TransIT-LT1	Mirus Bio	MIR 2300/5/6
Tampon MACS (autoMACS Running Buffer)	Miltenyi Biotec	130-091-221
0.45 µ ; Unité de filtration m	Millipore	#SLHV013SL
0,6 mL microcentrifugeuse	Tube Axygen	MCT-060-C-S
1,5 mL Tube Eppendorf	Axygen	MCT-150-C-S
15mL Conique	VWR	21008-918
23 G Aiguille	VWR	#305145
24 Puits Non-TC Plaques	Falcon	#351147
Plaques TC 24 puits	Falcon	#353047
50 mL Tube conique	VWR	21008-951
Seringue 5 mL	BD Biosciences	#309647
70 µ ; m Filtre	Miltenyi	#130-098-462
Plaques à fond plat à 96 puits	Corning	#3599
Plaques à fond en U à 96 puits	Corning/Costar	#3365
Machine d’anesthésie	VetEquip - COMPAC5	#901812
Anticorps monoclonal agoniste anti-CD40	BioXcell	BE-0016
Anticorps monoclonal anti-p40	BioXcell	BE-0051
B220 PE Anticorps	BioLegend	#103208
Albumine sérique bovine	Sigma Aldrich	A7906-100G
Cas9 Knock-in Mice	Jackson Labs	#026179	C57Bl/6 fond
CD117+ Perles	Miltenyi	#130-091-224
CD11b PE Anticorps	BioLegend	#101208
CD3 PE Anticorps	BD Biosciences	#553240
Centrifugeuse	Beckman Coulter	Allegra 6KR Centrifugeuse
comptoir	Eppendorf	Centrifuge 5424
DPBS	ThermoFisher	#14190136
Dulbecco' s Modified Eagle Medium	Mediatech	#10-013-CV
Acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA)	Invitrogen	AM9260G
Endoscope	Karl Storz	N/A	Custom Coloview Tower
Flow cytometer	BD Biosciences FACS	Aria II
Fms-related tyrosine kinase 3 ligand (Flt-L)	PeproTech	#250-31L
Anticorps Gr-1 PE	BD Biosciences	#553128
Solution saline équilibrée de Hank (HBSS)	ThermoFisher	#14170120
Sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur	HyClone	#SH30071.03
IL-7	PeproTech	#217-17
Liant d’incubateur		#9040-0116
Isoflurane	HenrySchein	#6679401710
LS Column	Miltenyi	#130-042-041
Ly5.1 Pepboy	Mice Jackson Labs	#002014	C57Bl/6 facteur de cellules
souches de souris de fond (mSCF)	PeproTech	#250-03
Chlorure de sodium (NaCl)	Hospira	#00409488850
OPTI-MEM média sans sérum	Invitrogen	#31985-070
Pénicilline-streptomycine (PenStrep)	ThermoFisher	#15140-122
Agitateur à plaques	ThermoFisher	#88880023
pLentiPuro	Addgene	#52963
Polybrène (10 µ ; g/µ ; L)	Sigma Aldrich	#TR-1003-G
Tampon de lyse des globules rouges	eBioscience	#00-4333
Rétronectine	Takarbio	#T100B
Sca-1 APC Anticorps	BioLegend	#108112
StemSpan	StemCell Technologies	#09600
Ter119 PE	Anticorps eBioscience	#12-5921
Thrombopoïétine (TPO)	PeproTech	#315-14
Irradiateur à rayons X	de précision X-Rad	320