Il est rapporté ici un système d’imagerie calcique chez Caenorhabditis elegans qui se comporte librement avec des vibrations bien contrôlées et non localisées. Ce système permet aux chercheurs d’évoquer des vibrations non localisées aux propriétés bien contrôlées à l’échelle nanométrique et de quantifier les courants de calcium lors des réponses de C. elegans aux vibrations.
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Article de méthode
Imagerie calcique dans Caenorhabditis elegans se comportant librement avec des vibrations bien contrôlées et non localisées
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Les forces mécaniques non localisées, telles que les vibrations et les ondes acoustiques, influencent une grande variété de processus biologiques, du développement à l’homéostasie. Les animaux font face à ces stimuli en modifiant leur comportement. Comprendre les mécanismes sous-jacents à une telle modification comportementale nécessite la quantification de l’activité neuronale pendant le comportement d’intérêt. Ici, nous rapportons une méthode d’imagerie calcique dans le comportement libre de Caenorhabditis elegans avec des vibrations non localisées de fréquence, de déplacement et de durée spécifiques. Cette méthode permet la production de vibrations bien contrôlées et non localisées à l’aide d’un transducteur acoustique et la quantification des réponses calciques évoquées à une résolution unicellulaire. Comme preuve de principe, la réponse calcique d’un seul interneurone, AVA, lors de la réponse d’échappement de C. elegans aux vibrations est démontrée. Ce système facilitera la compréhension des mécanismes neuronaux sous-jacents aux réponses comportementales aux stimuli mécaniques.
Introduction
Les animaux sont souvent exposés à des stimuli mécaniques non localisés tels que des vibrations ou des ondes acoustiques 1,2. Parce que ces stimuli influencent l’homéostasie, le développement et la reproduction, les animaux doivent modifier leurs comportements pour y faire face 3,4,5. Cependant, les circuits neuronaux et les mécanismes sous-jacents à une telle modification du comportement sont mal compris.
Le comportement mécanosensoriel chez le nématode, Caenorhabditis elegans, est un paradigme comportemental simple, dans lequel les vers changent généralement de comportement d’un mouvement vers l’avant à une réponse d’échappement vers l’arrière lorsqu’ils rencontrent une vibration non localisée6. Le circuit neuronal sous-jacent à ce comportement est composé principalement de cinq neurones sensoriels, de quatre paires d’interneurones et de plusieurs types de motoneurones 7,8. De plus, les vers s’habituent à de tels stimuli mécaniques après un entraînement espacé impliquant une stimulation répétée 9,10,11. Par conséquent, cette réponse comportementale simple constitue un système idéal pour étudier les mécanismes neuronaux sous-jacents à la fois au comportement évoqué par vibration non localisé et à la mémoire. Un protocole d’imagerie calcique chez les vers se comportant librement sous l’influence de vibrations non localisées est illustré. Comparé aux systèmes précédemment signalés, ce système est simple en ce sens qu’il ne nécessite pas de caméra supplémentaire pour le suivi; cependant, cela nous permet de modifier la fréquence, le déplacement et la durée des vibrations non localisées. Étant donné que l’activation des interneurones AVA induit la réponse d’échappement vers l’arrière, les vers co-exprimant GCaMP, un indicateur de calcium, et TagRFP, une protéine fluorescente insensible au calcium, sous le contrôle d’un promoteur spécifique à AVA ont été utilisés comme exemple (voir tableau des matériaux pour plus de détails). Le protocole démontre l’activation des neurones AVA lorsqu’un ver passe d’un mouvement vers l’avant vers l’arrière. Ce protocole facilite la compréhension du mécanisme du circuit neuronal sous-jacent au comportement mécanosensoriel.
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Protocole
1. Culture de vers jusqu’à l’imagerie calcique
- Quatre jours avant une expérience d’imagerie calcique, transférer deux vers ST12 adultes sur une nouvelle plaque de milieu de croissance des nématodes (NGM) (Table des matériaux) sur laquelle Escherichia coli OP50 est strié dans un motif carré (environ 4 mm x 4 mm) à l’aide d’un épandeur de cellules afin que le ver passe la plupart du temps dans la bactérie pendant l’imagerie calcique12.
- Incuber cette plaque NGM pendant 4 jours à 20 °C dans un incubateur (Table des matériaux).
2. Configuration matérielle
- Préparez un microscope équipé d’un dispositif piézoélectrique pour la stimulation13, d’un objectif 2x, d’une caméra sCMOS haute vitesse, d’une optique de fractionnement d’image, d’un étage motorisé x-y, d’une source de lumière LED pour l’excitation et d’un ordinateur (Figure 1). Les spécifications essentielles de la caméra sCMOS incluent 2560 x 2160 pixels actifs, une taille de 6,5 μm, avec une liaison de caméra à 10 robinets comme option d’interface. Les principales spécifications de l’étage motorisé X-Y comprennent une plage de course de 110 mm x 75 mm, une vitesse maximale de 250 mm/s, une accélérationde 2 000 mm/s 2 max et une répétabilité unidirectionnelle de 0,25 μm.
- Allumez l’ordinateur et le contrôleur de scène motorisé x-y.
- Allumez l’amplificateur et réglez le réglage du volume sur 10 et les réglages des basses et des aigus sur 8.
- Pour exciter GCaMP et TagRFP, allumez les lumières 488 nm et 560 nm de la source lumineuse LED. Réglez les jauges de 470 nm et 550 nm du module de commande dans la source lumineuse à 5% afin que l’intensité de la lumière LED soit adaptée à l’imagerie.
REMARQUE: À cette intensité LED, le photoblanchiment de la fluorescence GCaMP et TagRFP ne se produit pas pendant l’enregistrement.
3. Configuration du logiciel pour l’imagerie calcique
- Téléchargez et installez trois progiciels sous Windows : un logiciel de macro de souris, un logiciel de contrôle des propriétés de vibration, un logiciel d’exécution d’un logiciel de suivi et un logiciel d’analyse de données (Table des matériaux).
- Double-cliquez sur le fichier du logiciel de suivi.
- Appuyez sur le bouton Exécuter et attendez 5 minutes pour stabiliser le logiciel (Figure 2A).
- Fournissez les informations sur le temps d’exposition et le binning. Un temps d’exposition de 0,033 s avec un doublement de 2 x 2 garantit une acquisition d’image fluide (Figure 2B).
REMARQUE: Seule chaque10ème image acquise est affichée afin de réduire la charge de mémoire. - Fournissez les informations pour l’acquisition d’images (Figure 2C). Par exemple, lorsque 500 images sont enregistrées deux fois avec un intervalle de 10 s, entrez 1 000 dans la zone Total des images, 500 dans la zone Images et 10 dans la zone Intervalle(s).
- Activez le bouton Acquisition (Figure 2D).
- Divisez l’image de fluorescence à l’aide de l’optique de fractionnement d’image et les deux images (canal GCaMP, 500-525 nm (Figure 2E); Les canaux TagRFP, 584-676 nm (Figure 2F)) sont projetés sur deux moitiés de la caméra sCMOS. Calibrer les coordonnées des canaux GCaMP et TagRFP (Figure 2G). Enregistrez les paramètres du logiciel.
- Définissez le répertoire pour sortir le fichier de données (Figure 2H).
- Désactivez le bouton Acquisition (Figure 2D).
- Double-cliquez sur le logiciel du système de macro de la souris (Figure 3A) et définissez les propriétés de vibration (Figure 3B). Lisez le fichier Assay.txt avec le système de macros de la souris afin que le curseur de la souris soit contrôlé en fonction des coordonnées et de la planification dans ce fichier (Figure 3A). Réglez les coordonnées du curseur de la souris (carrés magenta de la figure 3A) et le temps d’attente jusqu’à la stimulation après le démarrage de l’enregistrement (magenta de la figure 3A). Définissez les valeurs de fréquence et d’amplitude dans le logiciel de contrôle des vibrations (Figure 3B).
4. Préparation des vers pour l’imagerie calcique
- Transférer un seul ver exprimant à la fois GCaMP et TagRFP de la plaque incubée vers une nouvelle plaque NGM fraîche sur laquelle E. coli OP50 a été strié.
- Fixez la plaque NGM au transducteur acoustique piézoélectrique à l’aide d’un ruban adhésif transparent (Figure 4). N’appuyez pas sur la plaque sur l’actionneur car cela modifie la fréquence des vibrations.
5. Imagerie calcique sous le contrôle de propriétés vibratoires spécifiques
- Activez le bouton Acquisition (Figure 2D).
- Trouvez le ver sous une lumière vive et une lumière d’excitation (488 nm et 560 nm).
- Définissez la valeur de zoom de la microscopie sur 2,5x. Le champ de vision est de 1,1 mm x 1,1 mm avec une résolution de 2,6 μm/pixel.
- Éteignez la lumière vive et allumez le bouton Homing (Figure 2I) pour suivre la tache fluorescente d’un ver. Ce bouton de repérage démarre le mouvement de l’étage X-Y pour maintenir la région d’intensité maximale du ver au milieu du champ de vision dans l’image TagRFP.
REMARQUE: En ce qui concerne le promoteur flp-18 , l’intensité fluorescente des neurones AVA est la plus forte et ceux des autres neurones sont faibles ou non détectés. Par conséquent, le système de faible grossissement n’est pas nécessaire pour le suivi et la scène se déplace tout au long de l’enregistrement. - Assurez-vous que les valeurs des barres d’intensité dans les figures 2E et 2F sont d’environ 1 000. Si ce n’est pas le cas, ajustez les jauges de 470 nm et 550 nm du module de commande dans la source lumineuse.
- Appuyez sur le bouton Exécuter du système de macros de la souris pour permettre le contrôle du curseur de la souris conformément à une planification décrite à la figure 3A. Cela commence à enregistrer à l’aide du logiciel de suivi et à stimuler par le logiciel de gène d’onde tout en suivant le ver.
- Vérifiez si le fichier BMP de sortie est correctement créé.
6. Analyse des données
- Créez un dossier sur le bureau et nommez-le CalciumImaging.
- Créez un dossier dans le dossier CalciumImaging et nommez-le CIResult, pour les fichiers de résultats de sortie.
- Double-cliquez sur le fichier DualViewImaging.nb écrit dans le logiciel d’analyse de données pour Windows.
- Insérez le chemin d’accès au fichier dans le dossier CIResult (par exemple, DirectoryName[/Users/Sugi0911/Desktop/CalciumImaging/CIResult/test.rtf]) (Figure 5).
- Insérez le chemin d’accès au dossier, y compris le fichier BMP (par exemple, SetDirectory[/Users/Sugi0911/Desktop/XXX/]) (Figure 5), dans lequel XXX indique le nom du dossier, y compris les fichiers BMP.
- Appuyez simultanément sur les touches Maj et Retour pour lancer une analyse automatique. Cette analyse utilise la valeur d’une région de champ de vision d’intensité maximale dans l’image TagRFP (voir la légende de la figure 6 pour une procédure de calcul détaillée dans le programme).
- Vérifiez si les fichiers de sortie suivants sont correctement créés dans le dossier CIResult.
XXX-GCaMP.tif (fichier image illustrant les traces d’intensités GCaMP pour toutes les images)
XXX-GCaMP.xls (fichier de feuille de calcul répertoriant les intensités GCaMP dans toutes les images)
XXX-TagRFP.tif (fichier image illustrant les traces d’intensités de TagRFP pour toutes les images)
XXX-TagRFP.xls (fichier de feuille de calcul répertoriant les intensités TagRFP dans toutes les images)
XXX-Ratio.tif (fichier image illustrant les traces de la valeur du ratio pour toutes les images)
XXX-Ratio.xls (fichier de feuille de calcul répertoriant la valeur du ratio dans toutes les images)
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Résultats
Ici, un ver exprimant à la fois GCaMP et TagRFP sous le contrôle du promoteur spécifique à l’interneurone AVA est utilisé comme exemple d’imagerie calcique chez C. elegans se comportant librement. Les données des canaux GCaMP et TagRFP ont été obtenues sous la forme d’une série d’images, dont certaines sont montrées à la figure 6 et sous forme de film (film supplémentaire 1). Le déplacement de la plaque de Petri induit par notre système de vibration non localisé (
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Discussion
Généralement, la quantification de l’activité neuronale nécessite l’introduction d’une sonde et/ou de contraintes sur les mouvements du corps animal. Cependant, pour les études du comportement mécanosensoriel, l’introduction invasive d’une sonde et les contentions elles-mêmes constituent des stimuli mécaniques. C. elegans fournit un système pour contourner ces problèmes, parce que ses caractéristiques sont transparentes et parce qu’il a un circuit neuronal simple et compact comprenant seulement 302 neurones. Com...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Nous remercions le Caenorhabditis Genetics Center d’avoir fourni les souches utilisées dans cette étude. Cette publication a été soutenue par JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (Grant no. JP18H02483), sur les domaines innovants du projet « Science of Soft Robot » (Grant no. JP18H05474), le PRIME de l’Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux (numéro de subvention 19gm6110022h001) et la fondation Shimadzu.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Data anaylsis software | |||
| DualViewImaging.nb | auteur | Pour l’analyse des données acquises | |
| Mathematica12 | Wolfram | Pour l’exécution du logiciel d’analyse de données DualViewImaging | |
| Escherichia coli et C. elegans souches | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Aliment pour C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
| lite-1(ce314) | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | Mutant insensible |
| la lumièrelite-1(ce314) souche exprimant NLS-GCaMP-NLS et TagRFP sous le contrôle du promoteur spécirique AVA | auteur | ST12 | lite-1(ce314) mutant portant les gènes exprimant NLS-GCaMP5G-NLS (NLS ; signal de localisation nucléaire) et TagRFP sous le contrôle du Promoteur flp-18 en tant que réseau extrachoromosomique |
| Vibromètre laser Doppler | |||
| Lase Vibrometer | Polytec Japan | IVS-500 | Pour quantifier ; la fréquence et le déplacement générés par le transducteur acoustique |
| Mouse macro systemAssay.txt | |||
| Auteur | Script pour le contrôle temporel et spécial du cursol de la souris dans Windows | ||
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Logiciel de téléchargement gratuit pour le contrôle du curseur de la souris basé sur un script |
| Nematode growth media plate | |||
| Agar purified, powder | Nakarai tesque | 01162-15 | For préparation des plaques NGM |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | Pour la préparation des plaques NGM |
| Chlorure de calcium | Wako | 036-00485 | Pour la préparation des plaques NGM |
| Cholestérol | Wako | 034-03002 | Pour la préparation des plaques NGM |
| di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | Pour la préparation des plaques NGM |
| Bouillon LB, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | Pour la culture de E. coli OP50 |
| Sulfate de magnésium anhydre | TGI | M1890 | Pour la préparation des plaques NGM |
| Dihydrogénophosphate de potassium | Nakarai | tesque 28720-65 | Pour la préparation des plaques NGM |
| Chlorure de sodium | Nakarai tesque | 31320-05 | Pour la préparation des plaques NGM |
| Boîtes de Pétri (60 mm) | Nunc | 150270 | Pour la préparation des plaques NGM |
| Dispositif de vibration non localisé | |||
| Amplificateur | LEPY | LP-A7USB | Pour la stimulation avec vibration contrôlable |
| Transducteur acoustique | MinebeaMitsumi | LVC25 | Pour la stimulation avec vibration contrôlable |
| WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Téléchargement gratuit d’un logiciel pour le contrôle des propriétés vibratoires |
| Imagerie calcique non invasive | |||
| 2 canaux servocontrôleur DC brushless 3 phases | Thorlabs | BBD202 | Contrôleur compatible pour MLS203-1 étages |
| 479/585 nm Filtre passe-bande bi-bande BrightLine | Semrock | FF01-479/585-25 | Pour l’acquisition d’images à deux canaux (GCaMP et TagRFP) |
| 505/606 nm Séparateur de faisceau dichroïque à épifluorescence standard à double bord | BrightLine Semrock | FF505/606-Di01-25x36 | Pour l’acquisition d’images à deux canaux (GCaMP et TagRFP) |
| 512/25 nm Filtre passe-bande monobande BrightLine | Semrock | FF01-512/25-25 | Pour l’acquisition d’images à deux canaux (GCaMP et TagRFP) |
| 630/92 nm BrightLine filtre passe-bande monobande | Semrock | FF01-630/92-25 | Pour l’acquisition d’images à deux canaux (GCaMP et TagRFP) |
| Ordinateur | Dell | Precision T7600 | Windows7 avec processeur Intel Xeon ES-2630 et 8 Go de RAM |
| Platine motorisée x-y haute vitesse | Thorlabs | MLS203-1 | Étape de balayage XY rapide |
| Optique de division d’image | Hamamatsu photonics | A12801-01 | Pour l’acquisition d’images à deux canaux (GCaMP et TagRFP) générées par W-VIEW GEMINI Optique de division d’image Source |
| lumineuse LED | CoolLED | pE-4000 | Pour générer une lumière d’excitation de 470 nm et 560 nm |
| Microscope Olympus | MVX10 | ||
| Caméra sCMOS | Andor | Zyla | |
| x 2 Objectif Olympus | MVPLAPO2XC | Distance de travail 20 mm et numérique ouverture 0,5 | |
| Plasmide | |||
| pKDK66 auteur du plasmide | pKDK66 | Marqueur de co-injection | |
| pTAK83 auteur du plasmide | pTAK83 | Plasmide pour l’expression de TagRFP sous le contrôle du promoteur flp-18 | |
| auteur | plasmide pTAK144 | Plasmide pour l’expression de NLS-GCaMP5G-NLS sous le contrôle de ; le flp-18 promoteur | |
| Logiciel de suivi | |||
| homingback.vi | auteur | Fichier SubVi pour le suivi d’un point fluorescent d’un ver par le contrôle par rétroaction d’une caméra sCMOS et d’une platine motorisée x-y | |
| LabVIEW | National instruments | Pour l’exécution du logiciel de suivi | |
| Zyla Control ver.2.6CI.vi | auteur | Pour le suivi d’un point fluorescent d’un ver grâce au contrôle par rétroaction d’une caméra sCMOS et d’une platine motorisée x-y |
Références
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Réimpressions et autorisations
