Détection de variantes génétiques dans le gène CALR à l’aide d’une analyse de fusion à haute résolution

Résumé

L’analyse de fusion à haute résolution (HRM) est une solution sensible et rapide pour la détection de variantes génétiques. Cela dépend des différences de séquence qui entraînent des hétéroduplexes modifiant la forme de la courbe de fusion. En peignant la GRH et l’électrophorèse sur gel d’agarose, différents types de variantes génétiques telles que les indels peuvent être identifiés.

Résumé

L’analyse de fusion à haute résolution (HRM) est une méthode puissante pour le génotypage et le balayage de variation génétique. La plupart des applications hrm dépendent de colorants ADN saturés qui détectent les différences de séquence et d’hétéroduplexes qui modifient la forme de la courbe de fusion. Une excellente résolution d’instrument et un logiciel spécial d’analyse des données sont nécessaires pour identifier les petites différences de courbe de fusion qui identifient une variante ou un génotype. Différents types de variantes génétiques avec des fréquences diverses peuvent être observés dans le gène spécifique pour les patients atteints d’une maladie spécifique, en particulier le cancer et dans le gène CALR chez les patients atteints de néoplasmes myéloprolifératifs négatifs du chromosome Philadelphie. Des changements, des insertions et/ou des délétions (indels) d’un seul nucléotide dans le gène d’intérêt peuvent être détectés par l’analyse HRM. L’identification des différents types de variantes génétiques est principalement basée sur les contrôles utilisés dans le test qPCR HRM. Cependant, à mesure que la longueur du produit augmente, la différence entre les courbes de type sauvage et les courbes hétérozygotes devient plus petite et le type de variante génétique est plus difficile à déterminer. Par conséquent, lorsque les indels sont la variante génétique prévalente attendue dans le gène d’intérêt, une méthode supplémentaire telle que l’électrophorèse sur gel d’agarose peut être utilisée pour clarifier le résultat de la GRH. Dans certains cas, un résultat non concluant doit être revérifié/rediagnostiqué par séquençage de Sanger standard. Dans cette étude rétrospective, nous avons appliqué la méthode à des patients JAK2 V617F négatifs atteints de NPP.

Introduction

Des variantes génétiques somatiques du gène de la calréticuline(CALR)ont été reconnues en 2013 chez des patients atteints de néoplasmes myéloprolifératifs (NPP) tels que la thrombocytémie essentielle et la myélofibrose primaire^1,2. Depuis lors, plus de 50 variantes génétiques du gène CALR ont été découvertes, induisant un décalage de trame +1 (−1+2)^3. Les deux variantes génétiques CALR les plus fréquentes sont une délétion de 52 pb (NM_004343,3 (CALR):c.1099_1150del52,p. (Leu367Thrfs*46)), également appelée mutation de type 1, et une insertion de 5 pb....

Protocole

L’étude a été approuvée par le Comité d’éthique médicale de la République de Slovénie. Toutes les procédures étaient conformes à la déclaration d’Helsinki.

1. PCR quantitative en temps réel (qPCR) basée sur la fluorescence et analyse post-qPCR par HRM

1. Remettre en suspension les apprêts énumérés dans le tableau des matériaux à 100 μM avec H_2Ostérile, sans RNase et sans DNase (voir tableau des matériaux). Préparez un apprêt de concentration de travail de 10 μM. Les amorces utilisées dans le protocole ont été publiées avant^{le 2}.
2. Quantifier l’ADN des granul....

Résultats

La région d’intérêt de l’ADN amplifié avec une augmentation exponentielle de la fluorescence qui dépasse le seuil entre les cycles 15 et 35 et des valeurs très étroites du cycle de quantification (Cq) dans tous les échantillons et témoins répliqués(Figure 2)est une condition préalable à l’identification fiable des variantes génétiques par analyse HRM. Ceci est réalisé en utilisant une détermination précise de l’ADN avec coloration par fluorescence et une quantité égale d’ADN dans l’expérienc.......

Discussion

La fusion à haute résolution de l’ADN est une solution simple pour le génotypage et le balayage des variantes^{génétiques 14}. Cela dépend des différences de séquence qui entraînent des hétéroduplexes qui modifient la forme de la courbe de fusion. Différents types de variantes génétiques avec des fréquences diverses peuvent être observés dans le gène spécifique pour un certain groupe de patients atteints de cancer^1,2,

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
E-Gel EX 4 % Agarose	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	G401004
Fuorometer 3.0 QUBIT	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q33216
Invitrogen E-Gel iBase et E-Gel Safe Imager Combo	Kit Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	G6465EU
MeltDoctor HRM MasterMix 2X	Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific	4415440	Composants : ADN polymérase AmpliTaqGold 360, colorant HRM MeltDoctor trade, mélange dNTP comprenant du dUTP, sels de magnésium et autres composants tampons, formulés avec précision pour obtenir des résultats optimaux de HRM
Plaque de réaction MicroAmp Fast 96 puits (0,1 mL)	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4346907
Film adhésif optique MicroAmp Applied	Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4311971
NuGenius	Syngene	NG-1045	Systèmes de documentation sur gel
Amorce CALRex9 Séquence génomique		Eurofins	5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (Haute pureté, sans sel)
Amorce CALRex9 Séquence	génomique		5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (Haute pureté, sans sel)
Mini Kit ADN QIAamp QIAGEN		51306	Kit d’isolement de l’ADN avec le tampon pour la dilution de l’ADN.
Tubes de dosage	Qubit Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q32856
QUBIT dsDNA HS	asynchrone Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q32854
Trackit 100bp DNA Ladder	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	10488058	Ladder se compose de 13 fragments individuels avec les bandes de référence à 2000, 1500 et 600 pb.
Système de PCR en temps réel ViiA7	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4453534
Eau sans nucléase	VWR, Life Science	436912C	Eau sans RNase, DNase et Protéase

directe : Eurofins inverse :