Article de méthode

Un essai in vitro d’imagerie à molécule unique pour l’analyse de la cinétique de traduction cap-dépendante

DOI :

10.3791/61648

⸱

15 septembre 2020

 ,  , 
1Molecular Biology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le suivi des événements de traduction individuels permet des études cinétiques à haute résolution des mécanismes de traduction dépendant du plafond. Ici nous démontrons un essai in vitro d’une seule molécule basé sur des interactions de formation image entre les anticorps fluorescents étiquetés et les peptides naissants épitope-marqués. Cette méthode permet la caractérisation à molécule unique de la cinétique d’initiation et d’élongation peptidique lors de la traduction active in vitro dépendante du capuchon.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La synthèse des protéines dépendantes du cap est la voie de traduction prédominante dans les cellules eucaryotes. Bien que diverses approches biochimiques et génétiques aient permis des études approfondies de la traduction dépendante du capuchon et de sa régulation, la caractérisation cinétique à haute résolution de cette voie de traduction fait encore défaut. Récemment, nous avons développé un test in vitro pour mesurer la cinétique de traduction dépendante du capuchon avec résolution d’une molécule unique. L’essai est basé sur la liaison fluorescente d’anticorps à polypeptide épitope-marqué. En imagerie de la liaison et de la dissociation des anticorps vers et depuis les complexes naissants de peptide-ribosome-ARNm, la progression de la traduction sur les ARNM individuels peut être suivie. Ici, nous présentons un protocole pour établir ce test, y compris l’ARNm et les préparations de diapositives pegylated, l’imagerie en temps réel de la traduction, et l’analyse des trajectoires d’une molécule unique. Cet essai permet le suivi des événements de traduction individuels dépendant du plafond et résout la cinétique de traduction clé, telles que les taux d’initiation et d’allongement. L’analyse peut être largement appliquée à des systèmes de traduction distincts et devrait largement bénéficier d’études in vitro de la cinétique de traduction dépendante du capuchon et des mécanismes de contrôle translationnel.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La traduction dans les systèmes eucaryotes se fait principalement par des voies dépendantes du capuchon 7-méthylguanosine (m7G)1. Des études indiquent que l’étape d’initiation de la traduction eucaryotique limite les taux et est une cible commune pourla réglementation 2,3,4. Les mécanismes de traduction dépendant du cap ont été largement étudiés à l’aided’approches génétiques 5,biochimiques6,7,8,structurelles 9etgénomiques 10 en vrac. Bien que ces méthodes aient identifié divers mécanismes qui régulent l’initiation dépendante du cap, leur résolution les limite à la moyenne des signaux provenant d’événements d’initiation hétérogènes et asynchrones. Plus récemment, des événements individuels de traduction in vivo ont été visualisés par des méthodes qui mesurent la liaison fluorescente d’anticorps aux épitopes sur les polypeptides naissants11,12,13,14. Cependant, ces nouvelles approches sont également limitées dans leur capacité à résoudre les événements d’initiation individuels parce que les anticorps fluorescents multiples doivent lier un peptide naissant pour permettre aux événements de traduction simples d’être résolus à partir d’un fond élevé de fluorescence intracellulaire. Dans de nombreuses interactions biologiques, les événements cinétiques individuels résolus ont fourni des aperçus critiques dans la compréhension de processus biologiques complexes en plusieurs étapes et répétitifs qui ne sont pas possibles de se synchroniser au niveau moléculaire. De nouvelles méthodes qui peuvent suivre la dynamique des événements de traduction individuels sont nécessaires pour mieux comprendre l’initiation et la réglementation dépendantes du plafond.

Nous avons récemment développé un test in vitro qui mesure la cinétique d’initiation dépendante du capuchon avec résolution à molécule unique15. Compte tenu du grand nombre de facteurs protéiques connus et inconnus impliqués dans cette voie d’initiation3,16, l’analyse d’une seule molécule a été développée pour être compatible avec les systèmes de traduction in vitro sans cellules pour bénéficier de leur préservation des facteurs cellulaires et de l’activité de traductionrobuste 17,18,19,20,21,22,23,24,25. En outre, l’utilisation de systèmes de traduction sans cellules permet des comparaisons plus compatibles entre les observations à molécule unique et les résultats en vrac antérieurs. Cette approche fournit une intégration simple de nouvelles idées cinétiques à molécule unique dans le cadre mécaniste existant de l’initiation dépendante du capuchon. Pour établir l’analyse à molécule unique, le système de traduction traditionnel sans cellules est modifié de trois façons : une séquence d’encodage d’épitope est insérée au début du cadre de lecture ouvert (ORF) d’un armature de reporter; l’extrémité 3′ de l’ARNm reporter est biotinylée pour faciliter l’attache de l’ARNm à la surface de détection d’une seule molécule; et les anticorps étiquetés fluorescents sont complétés à l’extrait de traduction. Ces modifications ne nécessitent que des techniques de biologie moléculaire de base et des reagents couramment disponibles. En outre, ces modifications et les conditions d’imagerie à molécule unique préservent la cinétique de traduction des réactions de traduction sans cellules envrac 15.

Dans cet essai (Figure 1), 5′-end plafonné et 3′end biotinylated reporter ARNm est immobilisé à une surface de détection enduite de streptavidine dans une chambre d’écoulement. La chambre d’écoulement est ensuite remplie d’un mélange de traduction sans cellules complété par des anticorps étiquetés fluorescents. Après la traduction de l’ARNm a eu lieu pour environ 30-40 codons en aval de la séquence épitopique26,27, l’épitope émerge du tunnel de sortie ribosome et devient accessible pour interagir avec des anticorps fluorescents étiquetés. Cette interaction est rapide et sa détection par des techniques d’imagerie par fluorescence à molécule unique permet le suivi de la cinétique de traduction avec résolution d’une molécule unique lors de la traduction active sans cellules. Cet essai devrait largement bénéficier d’études in vitro de la cinétique de traduction dépendante du capuchon et de sa régulation, en particulier pour les systèmes avec un essai in vitro en vrac de travail.

Une condition préalable à l’établissement de cet essai à molécule unique est un essai de traduction en vrac sans cellules, qui peut être réalisé à l’aide d’extrait de traduction qui est disponible sur le marché ou préparé selon les méthodes décritesprécédemment 28. Extrait de traduction eucaryotique peut être obtenu à partir de diverses cellules, y compris fongique, mammifère, et laplante 28. Pour l’imagerie, cet essai nécessite un microscope TIRF équipé de l’intensité laser tunable et l’angle d’incident, un stade d’échantillon motorisé, un système fluidique motorisé, et dispositif de contrôle de la température de l’échantillon. Ces exigences sont génériques pour les expériences modernes de TIRF à molécule unique in vitro et peuvent être réalisées différemment. L’expérience présentée ici utilise un système TIRF de type objectif composé de microscopes, de logiciels et d’accessoires disponibles dans le commerce, tous énumérés dans le Tableau des matériaux.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Génération de reporter mRNA

  1. Modifier un modèle de transcription de l’ADN qui code un arna reporter « non marqué » en vrac en insérant une séquence d’encodage d’étiquettes d’épitope N-terminus pour générer un modèle de transcription de l’ADN pour un arNm reporter « marqué »(figure 2A).
    REMARQUE : L’interaction 3xFLAG/anti-FLAG est recommandée pour cet essai en raison de sa sensibilité supérieure et de la courte longueur d’étiquette 3xFLAG. Cependant, l’analyse est compatible avec d’autres paires epitope/anticorps.
  2. Synthétiser les ARN non étiquetés et marqués à l’aide de modèles d’ADN linéarisés et d’une trousse de transcription in vitro (voir tableau des matériaux). En règle générale, 10-20 pmol d’ARN transcrit in vitro est suffisant pour le traitement ultérieur de l’ARN pour permettre une étude systématique d’une molécule unique.
  3. Cap l’ARN 5′ fin (Figure 2B) avec un m7G kit de plafonnement (voir tableau des matériaux) suivant la recommandation du fabricant.
  4. Biotinylate l’ARN 3′ fin (Figure 2B) à l’aide d’un kit de biotinylation (voir tableau des matériaux) selon le protocole fourni avec le kit. Purifier les ARN par extraction phénol-chloroforme suivie d’une purification avec une colonne de spin. ARN elute dans 10-20 μL d’eau sans RNase. Environ 40 à 50 % de l’ARN d’entrée non plafonné est récupéré.
  5. Évaluer l’intégrité et la concentration de l’ARN en dénaturant l’électrophoresis gel d’acrylamide et la coloration de l’ARN, tel quedécrit précédemment 29.
  6. Effectuez la traduction sans cellulesen vrac 30 avec l’ARNm reporter marqué 3′-end-biotinylated pour confirmer que l’ARNm modifié préserve les propriétés de traduction qui sont d’intérêt. À titre d’exemple, la traduction dépendante du plafonnement peut être confirmée en mesurant et en comparant les activités des journalistes dans les réactions de traduction sans cellules en vrac avec les ANR des journalistes non plafonnés et plafonnés (voir Résultats représentatifs).

2. Préparation de chambre de flux

  1. Sélectionnez une épaisseur de coverslip appropriée, tel que spécifié par la fiche technique objective du microscope. Sélectionnez une glissière en verre ou en quartz pour les systèmes d’imagerie de fluorescence de réflexion interne totale (TIRF) de type objectif ou prisme31,respectivement.
  2. Effectuez le nettoyage, la salinisation, la pegylation, et l’assemblage de chambre de coverslip et de glissière suivant le protocole décrit par Chandradoss et autres32 avec les modifications suivantes.
    1. Laver les glissières contenant des trous percés dans un détergent liquide alcalin à 10 % (v/v) pendant 20 min avec sonication. Combinez les glissières et les couvre-marches pour toutes les étapes de nettoyage restantes.
    2. Sautez l’étape de lavage de l’acétone. Prolonger le temps d’incubation de gravure piranha de 20 min à 1 h. Incuber la PEGylation du premier tour pendant 3 h. Incuber la PEGylation de deuxième tour avec MS (PEG)4 pour 3 h.

3. Préparation de l’équipement

  1. Au moins 3 h avant d’effectuer une expérience à molécule unique, allumez l’incubateur de microscope et réduisez le débit d’air à un faible taux pour éviter les perturbations acoustiques excessives des expériences. Réglez la température de l’incubateur à la température optimale pour le système de traduction sans cellules.
    REMARQUE : La traduction est extrêmement sensible à la température. La température de réaction optimale est spécifique pour chaque système d’extrait cellulaire. La caractérisation de la température de réaction est une étape essentielle dans le développement d’un système de traduction sans cellules en vrac. Cet essai à molécule unique doit être effectué sous la même température optimale que l’état de traduction en vrac correspondant.
  2. Au moins 1 h avant d’effectuer une expérience à molécule unique allumez le laser en appuyant sur le bouton d’alimentation laser derrière la boîte laser, tournez la clé de sécurité laser et appuyez sur le bouton de démarrage; allumez le microscope et appuyez sur le panneau de commande de l’écran tactile pour sélectionner le mode d’imagerie, l’objectif et l’ensemble de filtres.
  3. Allumez la caméra EMCCD, le contrôleur de scène prior et la pompe à seringues en appuyant sur leurs boutons d’alimentation. Allumez l’ordinateur et le logiciel ouvert Andor Solis (logiciel 1) pour contrôler la caméra EMCCD, TirfCtrl (logiciel 2) pour contrôler le laser, PriorTest (logiciel 3) pour contrôler l’étape motorisée, et Coolterm pour contrôler la pompe à seringues. Laissez la caméra refroidir et stabiliser à sa température de travail désignée avant le début de l’acquisition des données.
  4. Dans le logiciel 2, confirmez que les paramètres corrects sont définis pour la longueur d’onde laser, le type objectif et l’index réfractif du verre et de l’échantillon. Cliquez sur le bouton Connect. Pour définir l’intensité laser, cliquez sur le bouton Contrôle à côté de la longueur d’onde laser, puis dans la fenêtre de commande laser pop up, faites glisser la barre de diapositives d’intensité. Réglez le laser à l’angle désiré en faisant glisser la barre de glissière de position de fibre ou en entravant la profondeur de pénétration correspondante. Assurez-vous que la boîte d’obturateur est cochée pour maintenir le laser en mode Off lorsqu’il n’est pas imagerie.
    REMARQUE : Ouvrez et fermez l’obturateur laser en cochant la case Obturateur. Lors de l’établissement initialement de l’analyse, différentes intensités laser et angles d’incident devraient être testés pour la détection optimale d’une molécule unique. L’intensité optimale du laser équilibre la fluorescence brillante d’une molécule unique et le photobleaching rapide des fluorophores. L’angle de l’incident doit être augmenté au-delà de l’angle critique pour réduire le fond fluorescent élevé des anticorps étiquetés diffusant jusqu’à ce que les anticorps liés à l’ARNm soient clairement résolus. À titre de référence, un laser de 532 nm a été réglé à 10 μW à l’objectif avec l’angle d’incident laser fixé à 71,5° dans uneétude 15 utilisant l’anti-FLAG étiqueté Cy3 avec un rapport d’étiquetage de 2-7 dyes par anticorps.
  5. Dans le logiciel 1, choisissez Kinetic sous le mode Acquisition,entrez les paramètres pour le temps d’exposition, la longueur des séries cinétiques et la valeur de gain EM. Choisissez l’annuaire et attribuez des noms de fichiers pour enregistrer le fichier d’image de données.
  6. Réglez la pompe de seringue à un taux d’écoulement modeste à rapide pour l’étape suivante de lavage de tube.
    Pipette un aliquot de 70% d’éthanol dans un tube de microfuge, insérer l’extrémité de tube de pompe de seringue dans la solution d’éthanol, et employer Coolterm pour basculer la pompe de seringue entre retirer et distribuer des modes trois fois pour laver le tube. Répétez l’utilisation de l’eau sans RNase.
    REMARQUE : La longueur du tube doit être suffisamment longue pour permettre au mélange de traduction d’être distribué à l’étape 5 pour ne contacter que le tube, et non la seringue. Le volume de rinçage ici devrait être supérieur au volume du mélange de traduction distribué pour s’assurer que le mélange de traduction à l’étape 5 reste en contact avec le tube ase santé.
  7. Après la distribution du rinçage final à l’eau, retirez l’eau résiduelle de l’intérieur du tube en tamponnant l’extrémité du tube sur un lingette de tissu propre. Maintenir l’extrémité du tube à sec en la mettant dans un tube de microfuge propre.

4. Immobilisation de l’ARNm biotinylé 3′end

  1. Maintenir l’extrait cellulaire et le mélange de traduction congelés sur de la glace sèche jusqu’à ce qu’ils soient utilisés juste avant leur utilisation. Décongeler les derniers reagents congelés et les maintenir sur la glace.
  2. Placez la chambre d’écoulement dans le support de l’échantillon de microscope avec le côté coverslip face vers le bas et fixez-le en place avec du ruban adhésif. Utilisez du ruban adhésif pour couvrir les entrées et les sorties des canaux d’écoulement qui ne sont pas utilisés.
  3. Pipette un volume de 1,5 x (par rapport au volume du canal; s’applique également à d’autres étapes de l’étape 4 et de l’étape 5) de 0,2 mg/mL de streptavidine dans le canal d’écoulement et d’incubation pendant 10 min à température ambiante.
  4. Pour éliminer la streptavidine non léchée, lavez le chenal trois fois en pipetage dans un volume de 3 x de tampon de lavage T50 (20 mM Tris HCl, pH 7,0, 50 mM NaCl, 0,2 U/μL RNase inhibiteur réagent) par lavage.
    REMARQUE : Il est important d’empêcher les déchets liquides de revenir dans le chenal. Si la sortie du canal d’écoulement n’est pas reliée à un tube de collecte des déchets, placez un papier de soie plié près de la sortie pour absorber le liquide qui s’écoule du canal.
  5. Transférer l’extrait de traduction et mélanger de la glace sèche à la glace et leur permettre de décongeler.
  6. Mettez une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif. Placez le porte-échantillon au microscope avec la chambre d’écoulement au stade du microscope. Rapprochez l’objectif du coverslip jusqu’à ce que l’huile d’immersion sur l’objectif contacte le coverslip. Déplacez l’étape de l’échantillon de sorte que la position du canal d’écoulement soit directement au-dessus de la lentille objective.
  7. Dans le logiciel 2, ouvrez l’obturateur laser et ajustez le niveau d’intensité laser.
  8. Sur l’écran tactile de commande de microscope, sélectionnez l’onglet Focus et cliquez sur le bouton Focus Search and Start. Un bip est entendu lorsqu’un plan de mise au point est atteint avec succès.
  9. Image de la surface du canal de flux en mode Live dans le logiciel 1. Optimisez la mise au point pour une image plus nette en ajustant la position objective avec le contrôle de l’étape fine sur l’écran tactile.
  10. Dans le logiciel 3, déplacez la scène pour évaluer le niveau de fond de fluorescence à différentes zones de la surface de détection du canal d’écoulement. Si la fluorescence est faible, continuez l’expérience. Si le fond de fluorescence est excessivement élevé, envisagez de jeter le canal d’écoulement.
  11. Dans le logiciel 2, fermez l’obturateur laser.
  12. Pipette sur le tampon de lavage T50 du canal d’écoulement et immédiatement pipette dans un volume 2x de solution d’ARNm biotinylated au canal d’écoulement. Incuber pendant 15 min.
    REMARQUE : Pour chaque lot de préparation de l’ARNm, les concentrations d’ARNm et les temps d’incubation devraient être testés pour atteindre la densité de surface de l’ARNm nécessaire à la détection d’une seule molécule. La densité de surface appropriée de l’ARNm médie la liaison anticorps qui montre des taches fluorescentes ne se chevauchant pas plus de ~5 % (voir Résultats représentatifs). Comme point de départ, l’ARNm biotinylé à une concentration de 2-20 nM est recommandé.
  13. Lavez le canal trois fois en pipetting un volume 3x de tampon compatible de traduction par lavage.

5. Assemblage de mélange de traduction et livraison à un canal d’écoulement pour la détection d’une molécule unique

  1. Sur la glace, assembler 3x volumes du mélangede traduction 30 dans un tube de microcentrifugeuse suivant le protocole de traduction en vrac de l’étape 1.7, sauf omettre l’ARNm et compléter avec une concentration optimisée d’anticorps étiquetés fluorescents. Tournez brièvement le tube de microcentrifugeuse pour recueillir le mélange de traduction au fond du tube.
    REMARQUE : Lors de l’établissement de l’essai, différentes concentrations d’anticorps sont testées. La concentration optimale montre de faibles quantités d’anticorps non spécifiques se liant à la surface de détection et d’anticorps rapides se liant au peptide naissant (voir les étapes 7.1. et 7.2., respectivement, pour les détails d’étalonnage d’essai).
  2. Transférer le mélange de traduction à l’intérieur d’un bouchon de tube de microfuge de 0,7 mL. Réglez la pompe à seringues sur le mode retrait. Insérez l’extrémité du tube de pompe dans le mélange de traduction. Commencez le retrait de seringue pour recueillir le mélange de traduction dans le tube de pompe. Inverser le réglage de la pompe à seringues vers le mode de distribution et régler le débit à un rythme optimal pour la livraison du mélange de traduction.
    REMARQUE : Évitez de générer des bulles dans le mélange de traduction lorsque vous les transférez dans le tube de la pompe. Évitez de retirer le mélange de traduction trop profondément dans la partie du tube qui n’a pas été désinfectée et rincée à l’étape 3.6. Lors de l’établissement de l’analyse, différents taux de débit de livraison sont testés pour déterminer le taux optimal (voir l’étape 6.2. pour plus de détails sur l’étalonnage des analyses).
  3. S’il y a un écart entre l’extrémité du tube et le mélange de traduction, démarrez la pompe à seringues et laissez le mélange de traduction atteindre l’extrémité du tube, puis arrêtez la pompe à seringues.
  4. Insérez l’extrémité du tube de pompe dans l’entrée du canal d’écoulement. Évitez d’introduire des bulles d’air dans le mélange de traduction lors de l’exécution de la connexion. Stabilisez la connexion en vissant le support métallique sur mesure sur la plaque de support de l’échantillon de microscope. Évaluer la concentration au microscope et la fluorescence de la zone d’imagerie.
    REMARQUE : Le tube peut être serré à la chambre d’écoulement avec une partie personnalisée comme précédemment décrit33. D’autres types de systèmes fluidiques peuvent également être utilisés pour cet essai34. Le champ de vision doit apparaître similaire avant et après la connexion du tube. Si d’autres taches fluorescentes apparaissent après la connexion, le mélange de traduction fuit probablement du tube de livraison. Selon l’application, le canal avec le mélange de traduction fuite peut avoir besoin d’être jeté.
  5. Confirmez que les paramètres d’acquisition du film sont corrects et que le nom de fichier et l’annuaire appropriés ont été saisis pour enregistrer des fichiers.
  6. Déplacez la scène vers l’image d’une zone au centre de la surface de détection du canal d’écoulement. Sur l’écran tactile de contrôle du microscope, sélectionnez l’onglet AF continu et cliquez sur le bouton Focus Search and Start pour maintenir la position focale pendant l’expérience. Un bip est entendu lorsqu’un plan de mise au point est atteint avec succès.
  7. Dans le logiciel 2, ouvrez l’obturateur laser. Dans le logiciel 1, cliquez sur le bouton Take Signal pour commencer à enregistrer. Après environ 5 s d’enregistrement, entrez la commande Run dans Coolterm pour livrer le mix de traduction dans le canal d’écoulement. Enregistrez jusqu’à 2 h avec une résolution de temps de 0,5-2 s/frame.
    REMARQUE : La durée maximale de l’acquisition de données dépend de la vitesse à laquelle l’extrait de traduction perd de l’activité au fil du temps, ce qui peut être commodément caractérisé par l’exécution d’une traduction en vrac sans cellules avec l’ARNm du journaliste luciferase et la mesure de l’activité de luciferase dans les réactions de traduction à différents moments35.
  8. Lorsque l’acquisition de données est terminée, éteignez le laser, éteignez la AF continue sur l’écran tactile de contrôle du microscope et démontez le tube de la chambre d’écoulement.
  9. Pipette le mélange de traduction de l’entrée du canal d’écoulement, le transférer dans un tube de microfuge, et snap-gel de la solution en plaçant le tube dans de l’azote liquide. Magasinez plus tard à -80 °C.
  10. Lavez la pompe à seringues à trois reprises avec de l’eau sans RNase, puis trois fois avec 70 % d’éthanol. Retirer 70 % d’éthanol dans le tube de la pompe à seringues pour les entreposer.
  11. Éteignez le microscope et tous les accessoires. nettoyer.

6. Analyse des données

REMARQUE : L’analyse des données pour cet essai nécessite des méthodes courantes dans les études biophysiques à molécule unique. Toutes les étapes à forte intensité de calcul peuvent être réalisées à l’aide d’algorithmes et de logiciels existants (les références sont incluses ci-dessous à leurs étapes correspondantes).

  1. Facultatif : Le cas échéant, convertissez le fichier de série d’images acquis en un format compatible avec le logiciel de traitement d’image ou le langage de programmation choisi.
  2. Déterminez le point de départ de la réaction de traduction et le temps d’échange des reagents.
    REMARQUE : En raison de la diffusion d’anticorps fluorescents dans le mélange de traduction, l’intensité de fluorescence de fond d’une zone imageée augmentera au cours de l’échange de réacomptants dans le canal, du tampon compatible de traduction au mélange de traduction. Le point de départ de la réaction de traduction est défini comme le point de temps où l’échange de reagent est terminé. Ce point d’achèvement se trouve en mesurant l’intensité de fluorescence de fond pendant la livraison du mélange de traduction et en identifiant le moment où l’intensité croissante de fluorescence plafonne15, tel que décrit ci-dessous.
    1. Calculez le nombre total de fluorescence par image et tracez le profil de temps correspondant. Identifiez l’augmentation soudaine de la fluorescence totale dans la parcelle de profil de temps.
      REMARQUE : L’augmentation totale de la fluorescence est due à la concentration croissante d’anticorps étiquetés fluorescents pendant l’échange de reagent.
    2. Identifiez le point final de la phase totale d’augmentation de fluorescence et définissez ce point de temps comme point de départ (c.-à-d. heure 0) de la réaction de traduction. Identifiez les points de départ et d’extrémité de la phase totale d’augmentation de fluorescence et définissez le décalage horaire comme temps d’échange de reagent.
      REMARQUE : La durée totale de l’échange de reagent dépend des dimensions du canal d’écoulement et du débit sélectionné. Il est possible que certains facteurs de traduction puissent commencer à se lier à l’ARNm avant la fin de l’échange de reagent, ce qui pourrait réduire la résolution du temps d’initiation déterminé au premier tour. Il est donc recommandé de tester différents débits lors de la mise en place de l’analyse et de sélectionner les débits qui permettent l’achèvement de l’échange de reagent dans les 3-4 s pour les vitesses d’acquisition de données de 0,5-2 s/frame.
  3. Facultatif : Effectuez la correction de dérive de film.
    REMARQUE : Les positions des anticorps liés dans l’image des données peuvent changer avec le temps en raison de la dérive des pièces et accessoires du microscope. La dérive visuellement perceptible dans un film nécessite une correction avant d’aller plus loin dans l’analyse des données. Plusieurs algorithmes et scripts de correction de dérive spatiale sontdisponibles 36,37,38.
    1. Dans chaque image, trouvez les maxima locaux dans les nombres de pixels pour déterminer les positions des anticorps liés dans chaque image avec une précision de niveau pixel. Définissez un seuil pour le nombre de pixels de telle sorte que seules les taches qui sont clairement au-dessus du bruit de fond sont sélectionnées.
    2. Calculez les changements de positions individuelles des anticorps dans chaque direction entre deux images consécutives.
    3. Tracez l’histogramme des changements de position des anticorps entre deux cadres consécutifs et faites-le séparément pour chaque direction. Gaussian s’adapte à chaque histogramme et place la position centrale des pics comme dérive directionnelle entre deux cadres consécutifs.
    4. Pour contrer la dérive observée, déplacez chaque image dans la direction opposée par le montant calculé de la dérive.
  4. Construire des trajectoires à molécule unique.
    REMARQUE : Un logiciel de détection/suivi est disponible pour identifier les points lumineux et extraire leurs intensités de la séried’images de données 39,40.
    1. Identifier les positions des anticorps telles que décrites à l’étape 6.3.1.
      REMARQUE : Il est recommandé d’inspecter visuellement pour s’assurer que le seuil choisi ne donne pas lieu à une sur-cueillette excessive ou à une sous-cueillette des particules. L’inspection visuelle peut être réalisée en superposant les positions centroïdes identifiées sur chaque image et en évaluant visuellement leur accord (voir Résultats représentatifs).
    2. Combinez les particules choisies de tous les cadres et retirez les positions redondantes des particules.
    3. Inspectez visuellement les images des anticorps liés et sélectionnez une zone carrée enfermant les pixels avec des nombres qui sont clairement au-dessus de l’arrière-plan et représentatifs de l’anticorps lié individuellement.
      REMARQUE : La fonction de propagation des points (c.-à-d. la taille du carré pour une seule molécule) est déterminée par la configuration optique et la taille du pixel du détecteur.
    4. Pour chaque position de particule, construire une trajectoire d’une molécule unique en calculant l’intensité totale de tous les pixels dans la zone carrée autour de la position des particules. Les trajectoires sont construites pour chaque position, image par image, et pour l’ensemble du film de données.
  5. Facultatif : Appliquez un filtre avant-arrière non linéaire41 pour réduire le bruit de fond dans les trajectoires d’une molécule unique.
  6. Facultatif : Numériser les trajectoires avec les algorithmes de détectiond’étapes existants 42,43,44,45.
    REMARQUE : Le choix de l’algorithme de détection d’étapes dépend de la complexité de la dynamique d’une molécule unique. Pour le scénario le plus simple de la traduction ribosome isolée seulement (c.-à-d. aucune formation polysome) et d’un bon rapport signal/bruit, une application de seuil aux comptes de fluorescence est suffisante pour identifier le moment des événements de liaison et de dissociation d’anticorps dans les trajectoires d’une molécule unique. Il est recommandé d’inspecter visuellement au moins 100 trajectoires pour chaque condition afin de s’assurer que les étapes de trajectoire ont été choisies de façon appropriée par une stratégie de détection par étapes.
  7. Déterminer l’heure du premier événement de liaison anticorps pour chaque trajectoire (c.-à-d. le premier temps d’arrivée, t1),soit à l’aide de trajectoires numérisées, soit en appliquant un seuil aux trajectoires non numériques.
    REMARQUE : La valeur médiane de la première distribution du temps d’arrivée peut être comparée entre différentes conditions de traduction. Alternativement, la première distribution de temps d’arrivée peut être adaptée à une fonction log-normal décalée (3 paramètres) pour déterminer la valeur moyenne15 <t1>. Étant donné que la première distribution de l’heure d’arrivée est généralement faussée et a une longue queue, ne calculez pas la moyenne en faisant la moyenne directe par rapport aux heures de première arrivée observées.
  8. Facultatif : Analyse du temps de demeure et calcul du taux moyen de synthèse du peptide.
    1. Utilisez des trajectoires numérisées pour identifier les événements de traduction monosomes (ribosome unique) dans chaque trajectoire et calculer les temps de vie d’événement liant unique comme décalage horaire entre les événements correspondants de liaison et de dissociation des anticorps.
      REMARQUE : Les algorithmes de détection d’étapes pour la numérisation des trajectoires sont généralement moins fiables lorsque plusieurs événements moléculaires se chevauchent dans le temps. Il est donc recommandé d’exclure les événements polysome de l’analyse du temps de vie. Pour les systèmes de traduction hautement actifs qui sont enrichis d’événements polysomes et qui affichent rarement des événements monosomes, un mélange d’anticorps étiquetés et non étiquetés peut être utilisé pour augmenter les chances d’observer des événements de traduction isolés dans des trajectoires à molécule unique.
    2. Adaptez la distribution à une fonction log-normal et utilisez la fonction ajustée pour calculer le temps de vie moyen.
      REMARQUE : Il n’est pas recommandé de calculer la moyenne directement en faisant la moyenne des temps de vie observés parce que les distributions de temps de vie sont généralement biaisées avec de longues queues.
    3. Déterminer le nombre d’acides aminés qui sont traduits pendant le temps de liaison anticorps en soustrayant la somme de la longueur des acides aminés épitopiques et 35 (la longueur moyenne en acides aminés du peptide naissant dans le tunnel de sortie ribosome) du nombre total de codons ORF.
    4. Pour déterminer le taux moyen de synthèse du peptide, divisez le nombre d’acides aminés traduits par le temps de vie moyen.
  9. Facultatif : Calcul du temps moyen d’initiation au premier tour (<t1_I>).
    REMARQUE : Les conditions d’initiation et d’allongement, telles que le contexte de la séquence du site d’initiation et la séquence de codage, sont généralement préservées délibérément pour des études de cinétique initiatique. Par conséquent, le temps moyen de première arrivée <t1> de l’étape 6.7. peut être utilisé directement pour calculer le changement dans la cinétique d’initiation de premier tour entre les différentes conditions. La correction suivante n’est nécessaire que pour déterminer la valeur réelle du temps d’initiation de premier tour.
    1. Diviser la somme de la longueur de l’épitope et 35 (la longueur moyenne en acides aminés du peptide naissant dans le tunnel de sortie ribosome) par le taux moyen de synthèse peptidique (à partir de l’étape 6.8.4.) pour calculer le temps moyen d’allongement du peptide de cette région n-terminale (<t1_tag>).
    2. Comme le premier temps d’arrivée est la somme du temps d’initiation premier tour et t1_tag, soustrayez <t1_tag> de la moyenne du premier temps d’arrivée <t1> pour calculer le temps moyen d’initiation au premier tour <t1_I>: <t1_I> =< t1> - <t1_tag>

7. Étalonnage des analyses

REMARQUE : Effectuez les étapes d’étalonnage suivantes lors de l’établissement initiale de l’analyse.

  1. Pour examiner la spécificité de liaison des anticorps, effectuez les étapes du protocole dans les sections 4 et 5 séparément pour les ARNN non étiquetés et marqués (figure 2). Les niveaux de liaison des anticorps dans les canaux avec ces ARNN respectifs représentent l’étendue des anticorps non spécifiques se liant à la surface de détection et la liaison spécifique des anticorps au peptide naissant.
    REMARQUE : Le rapport de liaison spécifique à non spécifique est recommandé pour être >10 et peut être augmenté avec différentes stratégies de passivation de surface, concentration inférieure d’anticorps, ou densité de surface plus élevée d’ARNm.
  2. Pour mesurer le taux de liaison anticorps, effectuez le protocole avec une étape supplémentaire entre l’étape 4 et l’étape 5.
    1. Après l’étape 4, incuber le canal avec un mélange de traduction qui n’a pas d’anticorps pour prégénérer les complexes d’ARNm/ribosome/peptide.
    2. Passez ensuite à l’étape 5 et coulez le mélange de traduction complété par des anticorps dans le canal.
    3. Quantifier le taux moyen de liaison des anticorps au peptide naissant prégénérifié avec un ajustement exponentiel à l’histogramme de la première heure d’arrivée.
      REMARQUE : La liaison anticorps au peptide prégénérété doit être rapide, de l’ordre de secondes, et doit être plus rapide que la cinétique de traduction. Une concentration plus élevée d’anticorps peut être utilisée pour augmenter le taux de liaison anticorps.
  3. Photostability de l’anticorps fluorophore-étiqueté.
    1. Préparez une diapositive selon le protocole à l’étape 2, mais sautez l’étape PEGylation. Assembler la chambre d’écoulement après l’étape de salinisation. Le revêtement en silane permet une liaison efficace des anticorps non spécifiques à la surface de détection.
    2. Ajouter les anticorps étiquetés fluorescents dans le canal pour atteindre la densité d’une molécule d’anticorps non spécifiques se liant à la surface de détection. Commencez par ajouter des anticorps étiquetés fluorescents qui sont fortement dilués dans le tampon de lavage T50 et augmentez graduellement la concentration d’anticorps jusqu’à ce que la densité d’une molécule unique désirée soit atteinte.
    3. Image de la surface de détection jusqu’à ce que la majeure partie de la fluorescence des anticorps ne soit plus détectable.
    4. Tracez le nombre total d’anticorps visibles au fil du temps pour évaluer le taux de perte de fluorescence des anticorps due au photobleaching fluorophore.
      REMARQUE : L’étiquetage des anticorps donne généralement plusieurs fluorophores par anticorps. Les anticorps individuels restent détectables jusqu’à ce que tous les fluorophores conjugués photobleach.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Suivre le protocole décrit permet l’imagerie d’interactions individuelles d’anticorps avec des polypeptides naissants marqués n-terminal avec résolution d’une molécule lors de la traduction active sans cellules de l’ARNm reporter attaché à la fin de 3 ' (Figure 1). Une expérience de démonstration minimale est signalée avec l’utilisation de trois ARNM synthétiques : LUC (codage luciferase non étiqueté), LUCFLAG (codage 3xFLAG-marqué luciferase), et HP...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Par rapport aux expériences typiques de tirf mono-molécule in vitro, l’imagerie à molécule unique avec l’analyse décrite ici est en outre complexe en raison de l’utilisation de l’extrait cellulaire et d’une forte concentration d’anticorps fluorescents étiquetés. Par rapport à la pratique plus courante d’un tour de surface PEGylation, un deuxième tour de PEGylation (étape 2) réduit considérablement la liaison anticorps non spécifique à la surface de détection15. La forte concentration d’an...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ces travaux ont été soutenus par les National Institutes of Health [R01GM121847]; la subvention de soutien/subvention de base du Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) (P30 CA008748); et MSKCC Functional Genomics Initiative.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Objectif à huile 100X, N.A. 1.49OlympusUAPON 100XOTIRF
Acryamide/bis (40 %, 19:1)Bio-Rad161-0144
Détergent liquide alcalinDecon5332
Aminosilane (N-(2-Aminoéthyl)-3-Aminopropyltriméthoxysilane)UCT Specialties, LLCA0700
Andor ixon Ultra DU 897V EMCCDAndorDU-897U-CSO-#BV
Logiciel Andor SolisAndorPour le contrôle de l’Andor EMCCD
Filtre passe-bandeChroma532/640/25
Filtre passe-bandeChromaNF03-405/488/532/635E-25
Biotin-PEG-SVALaysan Bio IncBiotin-PEG-SVA
Coenzyme A acide libreProlume309-250
LogicielPour contrôler la pompe à seringue
Ordinateur de bureauDellPour contrôler le microscope, la caméra, la platine et la pompe.
Miroir dichroïqueSemrockR405/488/532/635
Direct-zol RNA microprep 50RNXFisher ScientificNC1139450
Dual-Luciferase Reporter Assay SystemPromegaE1910
EpoxyDevcon14250
Luciférine Firefly Acide libre D-LuciferinProlume306-250
Acide acétique glacialFisher ScientificBP1185500
Perioxyde d’hydrogèneSigma-Aldrich216763-500ML
Huile d’immersionOlympusZ-81226Ade la luciférase à faible auto-fluorescence
PromegaE1500
MEGASCRIPT T7 Kit de transcriptionThermo fisherAM1334
MéthanolFisher MMX04751
OlympusIX83
Lame de microscopeThermo Scientific3048
Anti-FLAG monoclonal M2-Cy3Sigma-AldrichA9594
mPEG-SVALaysan Bio IncmPEG-SVA-5000
MS(PEG)4Thermo Scientific22341
NaCl (5M)Thermo ScientificAM9760G
No 1.5 Microscope Verre de couvertureFisherband12-544-C
Olympus Laser, 532nm 100mMOlympus numérique Système laserCMR-LAS 532nm 100mW
Logiciel Olympus TirfCtrlOlympusPour le contrôle de l’intensité laser et de l’angle d’incidence
Table optiqueTMC contrôle des vibrations63-563Avec isolation des vibrations
Mélange d’alcool isoamylique phénol chloroformeSigma-Aldrich77617-100ml
Pierce RNA 3' End Biotinylation KitThermo Scientific20160
Granulés d’hydroxyde de potassiumSigma-AldrichP1767-500G
Étage de traduction XY motorisé PriorPS3J100
Logiciel PriorTestPriorPour contrôler l’étage motorisé Prior
Recombinant RNasin RNase InhibiteurPromegaN2515
IncubateurIn vivo scientific (world precision Instruments)98710-1Avec une cage en acrylique sur mesure
Bocal de colorationFisher Scientific08-817
StreptavidinThermo Scientific43-4301
Acide sulfuriqueFisher ScientificA300212
SYBR green IIFisher ScientificS7564
SeringueHamilton1725RN
Pompe à seringueAppareil Harvard55-3333
Tris (1M), pH = 7,0Thermo ScientificAM9850G
Bain à ultrasonsBranson
UreaSigma-AldrichU5378-500G
Système de capsulage de la vaccineNew England BiolabsM2080S
Zymo-Spin ICColonnes Zymo ResearchC1004
Coolterm Système de dosage Microscope scientifiqueCPX1800H

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

Liaison d anticorps fluorescentssuivi de polypeptides naissantsimagerie en temps r eltrajectoires de mol cules uniquessyst me de traduction acellulaireimmobilisation de l ARNmpr paration de canaux microfluidiques

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