Article de méthode

Une stratégie en deux étapes qui combine la modification épigénétique et les indices biomécaniques pour générer des cellules pluripotentes de mammifères

DOI :

10.3791/61655

⸱

29 août 2020

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biomedical Embryology, Department of Health, Animal Science and Food Safety and Center for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano, 2Department of Veterinary Medicine, University of Sassari, 3Department of Agricultural and Environmental Sciences - Production, Landscape, Agroenergy and Center for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons ici une méthode qui combine l’utilisation de l’effacement épigénétique chimique avec des indices liés à la mécanosension pour générer efficacement des cellules pluripotentes de mammifères, sans avoir besoin de transfection de gènes ou de vecteurs rétroviraux. Cette stratégie est donc prometteuse pour la médecine translationnelle et représente une avancée notable dans la technologie des organoïdes de cellules souches.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le phénotype cellulaire peut être inversé ou modifié avec différentes méthodes, avec des avantages et des limites spécifiques à chaque technique. Nous décrivons ici une nouvelle stratégie qui combine l’utilisation de l’effacement épigénétique chimique avec des indices liés à la mécanosension, pour générer des cellules pluripotentes de mammifères. Deux étapes principales sont nécessaires. Dans un premier temps, les cellules matures adultes (différenciées en phase terminale) sont exposées à la gomme épigénétique 5-aza-cytidine pour les conduire dans un état pluripotent. Cette partie du protocole a été développée, basée sur la compréhension croissante des mécanismes épigénétiques contrôlant le devenir et la différenciation cellulaires, et implique l’utilisation du modificateur épigénétique pour effacer l’état différencié cellulaire, puis conduire dans une fenêtre transitoire de haute plasticité.

Dans la deuxième étape, les cellules effacées sont encapsulées dans des micro-bioréacteurs en polytétrafluoroéthylène (PTFE), également connus sous le nom de marbres liquides, pour favoriser le réarrangement cellulaire 3D afin d’étendre et de maintenir de manière stable la haute plasticité acquise. Le PTFE est un composé synthétique hydrophobe non réactif et son utilisation permet la création d’un microenvironnement cellulaire, ce qui ne peut être réalisé dans les systèmes de culture 2D traditionnels. Ce système encourage et stimule le maintien de la pluripotence grâce à des indices liés à la biomécanosension.

Les procédures techniques décrites ici sont des stratégies simples pour permettre l’induction et le maintien d’un état de plasticité élevé dans les cellules somatiques adultes. Le protocole a permis la dérivation de cellules à haute plasticité chez toutes les espèces de mammifères testées. Comme il n’implique pas l’utilisation de la transfection de gènes et qu’il est exempt de vecteurs viraux, il peut représenter une avancée technologique notable pour les applications de médecine translationnelle. En outre, le système de micro-bioréacteur fournit une avancée notable dans la technologie organoïde des cellules souches en recréant in vitro un micro-environnement spécifique qui permet la culture à long terme de cellules à haute plasticité, à savoir en tant que CSE, csi, cellules épigénétiquement effacées et CSM.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Au cours des dernières décennies, le concept largement accepté de progression unidirectionnelle vers l’engagement et la différenciation cellulaires a été complètement révisé. Il a été démontré que la spécification cellulaire peut être inversée et qu’une cellule différenciée en phase terminale peut être poussée vers un état permissif moins engagé et plus élevé, en utilisant différentes méthodes.

Parmi les nombreuses méthodes proposées, l’une des plus prometteuses consiste à utiliser des composés chimiques pour induire les cellules dans une pluripotence dite induite chimiquement. Les petites molécules utilisées dans cette approche sont capables d’interagir et de modifier la signature épigénétique d’une cellule mature adulte, évitant ainsi le besoin de tout vecteur transgénique et/ou viral 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . De nombreuses études ont récemment montré qu’il est possible de passer de cellules d’un phénotype à un autre en fournissant des stimuli biochimiques et biologiques spécifiques qui induisent la réactivation des gènes hyperméthylés 11,12,13,14,15. Ces événements de déméthylation permettent la conversion de cellules différenciées en phase terminale en un progéniteur primitif, une cellule multipotente ou une cellule à haute plasticité/pluripotente 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.

Parallèlement, de nombreuses études se sont récemment concentrées sur la compréhension des indices liés à la mécanosension et, plus spécifiquement, sur la possibilité d’utiliser des forces mécaniques pour influencer directement la plasticité cellulaire et/ou la différenciation 16,17,18,19. En effet, il a été clairement démontré que la matrice extracellulaire (ECM) joue un rôle clé dans le contrôle du devenir cellulaire. En particulier, les signaux biomécaniques et biophysiques produits par l’ECM régulent directement les mécanismes moléculaires et les voies de signalisation, influençant le comportement et les fonctions cellulaires20,21. Ces données récentes ont ouvert la voie au développement de nouveaux systèmes de culture 3D qui imitent plus étroitement le microenvironnement cellulaire in vivo, reproduisant des stimuli mécaniques et physiques qui déterminent le comportement cellulaire.

Nous décrivons ici un protocole en deux étapes qui combine l’utilisation de l’effacement épigénétique chimique avec des indices liés à la mécanosension, pour générer des cellules pluripotentes de mammifères. Dans la première étape, les cellules sont incubées avec la molécule déméthylante 5-aza-cytidine (5-aza-CR). Cet agent est capable d’induire une déméthylation globale significative de l’ADN grâce à un effet combiné de l’action 8,10 médiée par la translocation directedix-onze (TET2) et de l’inhibition indirecte des ADN méthyltransférases (DNMT)22,23. Cette étape induit l’élimination des blocs épigénétiques avec une réactivation ultérieure de l’expression génique liée à la pluripotence et, par conséquent, la génération de cellules à haute plasticité 1,2,3,8,10, ci-après dénommées « cellules épigénétiquement effacées ». Dans la deuxième étape, les cellules sont encapsulées dans un système de culture 3D. À cette fin, le composé synthétique hydrophobe non réactif polytétrafluoroéthylène (PTFE; avec une taille de particule de 1 μm) est utilisé comme micro-bioréacteur, ce qui permet la création d’un microenvironnement cellulaire irréalisable grâce à l’utilisation de systèmes de culture 2D traditionnels10. Les particules de poudre de PTFE adhèrent à la surface de la goutte de liquide dans laquelle les cellules sont remises en suspension et isolent le noyau liquide de la surface de support, tout en permettant l’échange de gaz entre le liquide intérieur et l’environnement environnant24. Le « micro-bioréacteur PTFE » ainsi obtenu, également connu sous le nom de « marbre liquide », encourage les cellules à interagir librement les unes avec les autres, favorisant le réarrangement cellulaire 3D 25,26,27, et étend et maintient de manière stable l’état de plasticité élevé acquis grâce à des indices liés à la biomécanosension10.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les études ont été examinées et approuvées par le Comité d’éthique de l’Université de Milan. Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, publié par les National Institutes of Health (NIH) des États-Unis. L’isolement des cellules humaines d’individus adultes en bonne santé a été approuvé par le Comité d’éthique de l’Ospedale Maggiore Policlinico, Milano. Toutes les méthodes de notre étude ont été réalisées conformément aux directives approuvées.

1. Isolement des fibroblastes cutanés

REMARQUE: Toutes les procédures décrites ci-dessous peuvent être appliquées à des fibroblastes isolés de différentes espèces de mammifères, y compris la souris, le porc et l’homme. Des cellules murines ont été isolées sur des souris mâles âgées de 7 semaines et des tissus cutanés porcins ont été prélevés à l’abattoir local. Des cellules humaines ont été isolées de patients adultes, après consentement éclairé écrit.

  1. Préparer une solution de gélatine porcine à 0,1%.
    1. Peser 0,1 g de gélatine porcine et la dissoudre dans 100 mL d’eau. Stériliser la solution de gélatine par autoclavage avant utilisation.
    2. Enduire la boîte de Petri de 35 mm de gélatine porcine à 0,1% en ajoutant 1,5 mL de la solution préparée. Incuber pendant 2 h à température ambiante.
  2. Coupez des biopsies cutanées de mammifères (souris, porcins et humains) d’environ 2 à 5 cm de long et placez-les dans la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de Dulbecco contenant 2% de solution antibiotique antimycotique. Conserver à + 4 °C jusqu’à utilisation.
    NOTE: Les prélèvements de biopsie doivent être effectués en accord et après approbation du comité d’éthique, conformément aux lignes directrices établies.
  3. Lavez abondamment les biopsies prélevées trois fois dans du PBS stérile frais contenant 2% de solution antibiotique antimycotique.
  4. Prélever les biopsies du dernier lavage et les placer dans une boîte de Petri stérile de 100 mm. Utilisez un scalpel stérile pour les couper en morceaux d’environ 2 mm3 .
  5. À la fin de 2 h d’incubation, retirer l’excès de solution de gélatine de la boîte de Petri de 35 mm (décrite à l’étape 1.1.2) et, à l’aide d’une pince chirurgicale stérile, placer immédiatement 5 à 6 fragments de peau dans chaque boîte de culture pré-enduite.
  6. Mouiller les fragments en ajoutant 100 μL de gouttelettes de milieu isolant de fibroblastes (tableau 1) sur chacun d’eux. Culture à 37 °C dans un incubateur àCO 2 à 5 %.
    REMARQUE: Pour empêcher l’évaporation du milieu, placez la boîte de Petri de 35 mm dans une boîte de Petri de 100 mm ou plus contenant de l’eau stérile. Assurez-vous de boucher les deux boîtes de Pétri.
  7. Après 24 h de culture, vérifiez la quantité du milieu dans la boîte de Petri de culture de 35 mm. Si nécessaire, ajoutez 500 μL de milieu d’isolement des fibroblastes pour garder les fragments humides.
  8. Retirez soigneusement le milieu et rafraîchissez-le au moins tous les 2 jours de culture à l’aide d’une pipette.
  9. Lorsque les fibroblastes commencent à se développer à partir des fragments de peau placés dans la boîte de Petri de 35 mm (décrite à l’étape 1.5.) et commencent à former une monocouche cellulaire (généralement 6 jours). Enlever les morceaux de peau à l’aide d’une pince chirurgicale stérile et les cultiver dans 2 mL de milieu isolant fibroblastique.
  10. Continuer à cultiver la monocouche cellulaire à 37 °C dans un incubateur à 5 % deCO2 jusqu’à 80 % de confluence et rafraîchir le milieu tous les deux jours.

2. Culture de lignées cellulaires primaires de fibroblastes

  1. Lorsque les fibroblastes atteignent 80% de confluence, retirez soigneusement le milieu d’isolement des fibroblastes et lavez les cellules trois fois avec 3 mL de PBS contenant 1% de solution antibiotique antimycotique.
  2. Pour le détachement cellulaire, ajouter 600 μL de solution de trypsine-EDTA à 0,25 % dans la boîte de culture et incuber à 37 °C pendant 3 à 5 min.
  3. Ajouter 5,4 mL de milieu de culture de fibroblastes pour neutraliser la trypsine lorsque les cellules commencent à se détacher de la boîte de culture (tableau 1).
  4. Déloger les cellules par pipetage répété et doux. Cellules de plaque dans de nouveaux plats de culture (sans gélatine), en maintenant le rapport de passage entre 1:2 et 1:4 (selon le taux de croissance).
    REMARQUE: La centrifugation n’est pas nécessaire.
  5. Maintenir les cellules en culture et changer de milieu tous les 2 jours, jusqu’à ce qu’elles aient atteint 80% de confluence et les passent.
    REMARQUE: Propager les fibroblastes deux fois par semaine pour maintenir une croissance vigoureuse.

3. Exposition aux fibroblastes au 5-aza-CR

  1. Préparer une solution mère fraîche de 1 mM 5-aza-CR.
    1. Peser 2,44 mg de 5-aza-CR et le dissoudre dans 10 mL de glucose élevé DMEM. Resuspendez la poudre par vortex. Stériliser la solution avec un filtre de 0,22 μm.
      REMARQUE: La solution mère de 5-aza-CR doit être préparée immédiatement avant utilisation.
    2. Préparer la solution de travail 5-aza-CR en diluant 1 μL de solution mère 5-aza-CR (3.1.1.) dans 1 mL de milieu de culture de fibroblastes.
      REMARQUE: La concentration de la solution de travail 5-aza-CR est de 1 μM 1,2,3,8,9.
  2. Trypsiniser les cellules comme décrit précédemment (2.1.-2.3.) et déloger les cellules en les piquant de manière répétée et douce.
  3. Recueillir la suspension cellulaire et la transférer dans un tube conique.
  4. Compter les cellules à l’aide d’une chambre de comptage sous un microscope optique à température ambiante. Calculer le volume de milieu nécessaire pour remettre en suspension les cellules afin d’obtenir 4 x 104 cellules dans 30 μL de milieu de culture de fibroblastes complété par 1 μM de 5-aza-CR (voir étape 3.1.2.).
    REMARQUE: La formule à utiliser dépend du type spécifique de chambre.
    figure-protocol-1
  5. Centrifuger la suspension de la cellule à 150 x g pendant 5 min à température ambiante. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille avec le milieu de culture de fibroblastes complété par 1 μM de 5-aza-CR (voir étape 3.1.2.). Pour le volume du milieu de culture de fibroblastes à utiliser, voir l’étape 3.4.
    REMARQUE: Comme témoin négatif, remettre en suspension les cellules à la même concentration dans un milieu de culture de fibroblastes sans 5-aza-CR et procéder à l’encapsulation cellulaire dans de la poudre de PTFE (étape 4.1.-4.13.).

4. Encapsulation des fibroblastes dans des micro-bioréacteurs en PTFE

  1. Remplir une boîte de Petri de 35 mm avec de la poudre de polytétrafluoroéthylène (PTFE) pour produire un lit (Figure 1A).
    REMARQUE: Utilisez des boîtes de Petri bactériologiques de 35 mm pour éviter l’adhérence du marbre liquide. Afin d’obtenir une fine coquille hydrophobe et poreuse, utilisez une poudre de PTFE d’une taille moyenne de particules de 1 μm et produite avec un broyage maximal de 2,0 NPIRI. Cela permet la création de billes liquides perméables au gaz. En outre, le revêtement translucide facilite l’observation des processus d’agrégation cellulaire en temps réel Une plus grande taille des particules conduit à une polydispersité élevée qui peut provoquer une évaporation élevée, une déformation et une perte de la forme sphérique, ainsi que la dissolution prématurée des micro-bioréacteurs.
  2. Distribuer 30 μL de gouttelette simple contenant 4 x 104 cellules (voir étapes 3.4.- 3.5.) sur le lit de poudre (Figure 1B).
  3. Faites pivoter doucement la boîte de Petri de 35 mm dans un mouvement circulaire pour vous assurer que la poudre PFTE recouvre entièrement la surface de la goutte liquide pour former un micro-bioréacteur en marbre liquide (Figure 1C).
  4. Récupérez le micro-bioréacteur en marbre liquide à l’aide d’une pointe de pipette de 1 000 μL, coupée sur le bord, pour s’adapter au diamètre du marbre (Figure 1D,E). Plaquer le micro-bioréacteur en marbre liquide sur une boîte de Petri bactériologique propre pour le stabiliser (Figure 1F).
    REMARQUE: Pour créer un frottement pour saisir le marbre à l’intérieur de la pointe, coupez les embouts de la pipette d’un diamètre environ légèrement inférieur au diamètre du marbre liquide.
  5. Transférer le micro-bioréacteur en marbre liquide de la boîte de Petri dans une plaque de 96 puits (une bille/puits) (Figure 1G).
  6. Ajouter lentement 100 μL de milieu à partir de la marge du puits. Le micro-bioréacteur commence à flotter sur le support (Figure 1H).
    REMARQUE: Le micro-bioréacteur se brise en contact direct avec le liquide, en raison de la perturbation de l’hydrophobicité du PTFE. Comme approche alternative, les micro-bioréacteurs en marbre liquide peuvent être placés individuellement dans une boîte de culture bactériologique de 35 mm. Dans ce cas, afin d’éviter l’évaporation du marbre liquide, la boîte de Petri de 35 mm contenant le micro-bioréacteur doit être insérée dans une boîte de Petri de 100 mm, préalablement alicitée avec de l’eau stérile
  7. Incuber un micro-bioréacteur en marbre liquide pendant 18 h à 37 °C dans un incubateurà CO 2 à 5 % 1,2,3,8,9.
    REMARQUE: La taille des particules de PTFE de 1 μm peut assurer un échange gazeux optimal entre le liquide intérieur et l’environnement environnant.
  8. Après une incubation de 5-aza-CR pendant 18 h, prélever le micro-bioréacteur en marbre liquide à l’aide d’une pointe de pipette de 1 000 μL coupée sur le bord (voir étape 4.5).
  9. Placez le micro-bioréacteur dans une nouvelle boîte de Petri bactériologique de 35 mm (Figure 1D-F).
  10. Utilisez une aiguille pour percer le marbre liquide et le casser.
  11. Récupérer les sphéroïdes formés à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL, coupés au bord, sous un stéréomicroscope (Figure 1I,J).
    REMARQUE: Les cellules épigénétiquement effacées encapsulées dans du PTFE forment une structure sphérique 3D (un agrégat dans chaque marbre liquide).
  12. Pour évaluer l’acquisition de l’état pluripotent en réponse au 5-aza-CR, vérifiez l’apparition de l’expression génique liée à la pluripotence, OCT4, NANOG, REX1 et SOX2, par PCR qualitative (tableau 2).
  13. Passez à la deuxième étape du protocole comme décrit ci-dessous.

5. Culture dans des micro-bioréacteurs en PTFE de cellules épigénétiquement effacées

  1. Préparer un milieu de culture ESC frais (tableau 1).
  2. Transférer des organoïdes dans une boîte de Petri contenant un milieu ESC pour le lavage des résidus de 5-aza-CR (voir étapes 5.1.-5.2.).
  3. Préparez une nouvelle boîte de Petri bactériologique de 35 mm contenant du lit de poudre de PTFE (voir aussi l’étape 4.1.).
  4. Distribuer un seul organoïde dans une gouttelette de milieu de culture ESC de 30 μL sur le lit de poudre à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL, coupée au bord (voir étapes 4.9.; 5.3.).
  5. Faites pivoter doucement la boîte de Petri de 35 mm dans un mouvement circulaire pour former un nouveau micro-bioréacteur en marbre liquide, ramassez-la à l’aide d’une pointe de pipette de 1 000 μL, coupez-la sur le bord et placez le micro-bioréacteur nouvellement formé dans un puits de plaque de 96 puits (un marbre / puits) (voir les étapes 4.3.-4.6.).
  6. Pour faire flotter les micro-bioréacteurs, ajouter 100 μL de milieu à partir de la marge du puits pour baigner lentement le marbre (voir note 4.7.).
  7. Cultivez des micro-bioréacteurs en marbre liquide à 37 °C dans un incubateur àCO 2 à 5 % aussi longtemps que nécessaire. Changez de support tous les deux jours, en suivant la procédure décrite aux points 5.3.-5.7.
    NOTE: Dans le présent manuscrit, les résultats obtenus avec la culture d’organoïdes pendant 28 jours sont fournis. Cependant, si nécessaire, une période de culture plus longue peut être effectuée.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le présent protocole décrit toutes les étapes à effectuer pour générer et maintenir de manière stable les cellules pluripotentes de mammifères à partir de cellules somatiques adultes. Cette méthode a été couronnée de succès avec des fibroblastes isolés de différentes espèces de mammifères, à savoir la souris, le porc et l’homme. Les résultats représentatifs rapportés ici sont obtenus à partir de toutes les lignées cellulaires, indépendamment de l’espèce d’origine.

Les analyses morphologiques m...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Au cours des dernières décennies, plusieurs études se sont concentrées sur le développement de stratégies pour ramener une cellule différenciée en phase terminale vers un état permissif moins engagé et plus élevé. Le protocole décrit ici permet la génération et le maintien à long terme de cellules pluripotentes à partir de cellules matures matures différenciées en phase terminale. La méthode combine deux étapes indépendantes qui impliquent l’induction d’un état permissif élevé qui est obtenu par effacement épigénétique c...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été financé par la Fondation Carraresi et MiND FoodS Hub ID: 1176436. Tous les auteurs sont membres de l’action COST CA16119 In vitro 3-D total cell guidance and fitness (CellFit).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2-MercaptoéthanolSigma-AldrichM7522Composant du milieu ESC
5-AzacytidineSigma-AldrichA23855-aza-CR, pour l’effacement épigénétique des fibroblastes
AdénosineSigma-AldrichA4036Composant du mélange de nucléosides pour milieu ESC
Solution antimycosique antibiotique (100× ;)Sigma-AldrichA5955Composant du milieu fibroblastique et ESC
CFX96 PCR en temps réelBio-Rad LaboratoriesNAThermocycleur pour PCR quantitative
CytidineSigma-AldrichC4654Composant du mélange de nucléosides pour milieu
ESC DMEM, haute teneur en glucose, pyruvateThermo Fisher Scientific41966052Pour l’isolement des fibroblastes et le milieu
de cultureDMEM, faible teneur en glucose, pyruvateThermo Fisher Scientific31885023pour ESC moyen
Dulbecco' s Phosphate salin tamponnéSigma-AldrichD5652PBS ; pour la biopsie et le lavage cellulaire et pour la préparation de solutions
Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification KitThermo Fisher Scientific61021Estraction de l’ARNm
ESGRO Souris recombinante LIF ProtéineSigma-AldrichESG1106Composant du milieu ESC
Sérum de veau fœtal, qualifié, inactivé thermiquementThermo Fisher Scientific10500064Composant du milieu fibroblastique et ESC
FGF-Basic (AA10-155) Protéine humaine recombinanteThermo Fisher ScientificPHG0024Composant du milieu ESC
Gélatine de peau porcineSigma-AldrichG1890Pour l’enrobage de la parabole
GeneAmp PCR System 2700Applied BiosystemsNAThermocycleur pour PCR
qualitative Méthylation globale de l’ADN ELISA KitCELL BIOLABSSTA-380Etude de méthylation
GoTaq G2 Flexi DNA PolymérasePromegaM7801PCR qualitative
GuanosineSigma-AldrichG6264Composant du mélange de nucléosides pour milieu ESC
Mélange de nutriments Ham’s F-10Thermo FisherScientific 31550031Pour milieu ESC
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher Scientific 10828028Composant du support ESC
KOVA glasstic slide 10 avec grillesHycor Biomedical87144Pour le comptage cellulaire
Leica MZ APO Stereo MicroscopeLeicaNAPour l’observation des organoïdes
L-GlutamineSigma-AldrichG7513Composant des fibroblastes et des milieux ESC
Solution d’acides aminés non essentiels MEM (100X)Thermo Fisher Scientific11140035Composant de l’ESC
medium Millex-GS 0.22 µ ; m filtres à poresMilliporeSLGS033SBPour la stérilisation en solution
M-MLV Transcriptase inverse, RNase H Minus, Point MutantPromegaM3681Transcription inverse de l’ARNm
Multiskan FC Photomètre sur microplaqueThermo Fisher Scientific51119000Pour la lecture de plaque ELISA
Nikon Eclipse TE300 Microscope à contraste de phase inverséNikonNA observation
Perkin Elmer Thermal Cycler 480Perkin ElmerNAThermocycleur pour la transcription inverse
Poly(tétrafluoroéthylène) 1 &mu ; m taille des particulesSigma-Aldrich430935Pour la génération d’un micro-bioréacteur
Mini kit d’ADN génomiquePureLink Thermo Fisher ScientificK182001Extraction de l’ADN génomique
TaqMan Gene Expression Cells-to-CTKit Thermo Fisher ScientificAM1728PCR quantitative
ThymidineSigma-AldrichT1895Composant d’un mélange de nucléosides pour milieu ESC
Boîte de culture tissulaire 100X20 mm,Sarstedt833902Pour l’isolement des fibroblastes
Boîte de culture tissulaire 35X10 mm, StandardSarstedt833900Pour l’isolement des fibroblastes
Boîte de culture tissulaire 35X10 mm, SuspensionSarstedt833900500Boîte de Pétri de bactériologie pour la culture de marbre liquide
Plaque de culture tissulaire 96 Puits, Standard, FSarstedt833924005Pour la culture de marbre liquide
Solution trypsine-EDTASigma-AldrichT3924Pour dissociation des fibroblastes
Tube 15ml, 120x17mm, PSSarstedt62553041Pour la centrifugation en suspension cellulaire
UridineSigma-AldrichU3003Composant du mélange de nucléosides pour milieu ESC
Solution de Pour cellule standard

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).
  2. Pennarossa, G., et al. Reprogramming of pig dermal fibroblast into insulin secreting cells by a brief exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (1), 31-43 (2014).
  3. Brevini, T. A. L., et al. Morphological and molecular changes of human granulosa cells exposed to 5-azacytidine and addressed toward muscular differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (5), 633-642 (2014).
  4. Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell Journal. 17 (1), 153-158 (2015).
  5. Tan, S. J., et al. Muscle tissue engineering and regeneration through epigenetic reprogramming and scaffold manipulation. Scientific Reports. 5, 16333(2015).
  6. Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).
  7. Chandrakanthan, V., et al. PDGF-AB and 5-Azacytidine induce conversion of somatic cells into tissue-regenerative multipotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 2306-2315 (2016).
  8. Manzoni, E. F. M., et al. 5-azacytidine affects TET2 and histone transcription and reshapes morphology of human skin fibroblasts. Scientific Reports. 6, 37017(2016).
  9. Pennarossa, G., et al. Epigenetic erasing and pancreatic differentiation of dermal fibroblasts into insulin-producing cells are boosted by the use of low-stiffness substrate. Stem Cell reviews and reports. 14 (3), 398-411 (2018).
  10. Pennarossa, G., et al. Use of a PTFE micro-bioreactor to promote 3D cell rearrangement and maintain high plasticity in epigenetically erased fibroblasts. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (1), 82-92 (2019).
  11. Constantinides, P. G., Jones, P. A., Gevers, W. Functional striated muscle cells from non-myoblast precursors following 5-azacytidine treatment. Nature. 267 (5609), 364-366 (1977).
  12. Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
  13. Taylor, S. M., Constantinides, P. A., Jones, P. A. 5-Azacytidine, DNA methylation, and differentiation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 108, 115-127 (1984).
  14. Jones, P. A. Effects of 5-azacytidine and its 2'-deoxyderivative on cell differentiation and DNA methylation. Pharmacology & Therapeutics. 28 (1), 17-27 (1985).
  15. Palii, S. S., Van Emburgh, B. O., Sankpal, U. T., Brown, K. D., Robertson, K. D. DNA methylation inhibitor 5-Aza-2'-deoxycytidine induces reversible genome-wide DNA damage that is distinctly influenced by DNA methyltransferases 1 and 3B. Molecular and Cellular Biology. 28 (2), 752-771 (2008).
  16. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728(2017).
  17. Matamoro-Vidal, A., Levayer, R. Multiple influences of mechanical forces on cell competition. Current Biology. 29 (15), 762-774 (2019).
  18. Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Research & Therapy. 3 (5), 41(2012).
  19. Kumar, A., Placone, J. K., Engler, A. J. Understanding the extracellular forces that determine cell fate and maintenance. Development. 144 (23), Cambridge, England. 4261-4270 (2017).
  20. Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Current Opinion in Cell Biology. 15 (6), 753-762 (2003).
  21. Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. The Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
  22. Christman, J. K. 5-Azacytidine and 5-aza-2[prime]-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy. Oncogene. 21, 5483-5495 (2002).
  23. Stresemann, C., Lyko, F. Modes of action of the DNA methyltransferase inhibitors azacytidine and decitabine. International Journal of Cancer. 123 (1), 8-13 (2008).
  24. Ledda, S., Idda, A., Kelly, J., Ariu, F., Bogliolo, L., Bebbere, D. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
  25. Vadivelu, R. K., et al. Generation of three-dimensional multiple spheroid model of olfactory ensheathing cells using floating liquid marbles. Scientific Reports. 5, 15083(2015).
  26. Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marble as bioreactor for engineering three-dimensional toroid tissues. Scientific Reports. 7 (1), 12388(2017).
  27. Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marbles as bioreactors for the study of three-dimensional cell interactions. Biomedical Microdevices. 19 (2), 31(2017).
  28. Varelas, X., et al. TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal. Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).
  29. Panciera, T., et al. Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ. Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).
  30. Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Epigenetic ModificationBiomechanical CuesPluripotent Cells5 Aza CytidinePTFE Micro BioreactorsLiquid MarblesCell RearrangementPluripotency MaintenanceDNA Methylation AnalysisMorphological Analysis

Articles connexes