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Article de méthode

Isolement et identification commensaux conjonctivaux chez la souris

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DOI :

10.3791/61672

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1 mai 2021

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1Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Massachusetts Host-Microbiome Center, Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 3Clinical Microbiology Laboratory, Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

Dans cet article

Résumé

Présenté ici est un protocole pour l’isolement et l’amplification des bactéries commensales conjonctivales anaérobies aérobies et facultatives de souris utilisant un écouvillon unique d’oeil et une étape basée sur culture d’enrichissement avec l’identification suivante par des méthodes basées microbiologiques et la spectrométrie de masse MALDI-TOF.

Résumé

La surface oculaire a été une fois considérée privilégiée et abiotique immunisée, mais récemment il s’affiche qu’il y ait une petite, mais persistante présence commensale. L’identification et la surveillance des espèces bactériennes au niveau de la muqueuse oculaire ont été difficiles en raison de leur faible abondance et de la disponibilité limitée de la méthodologie appropriée pour la croissance et l’identification commensales. Il existe deux approches standard : les méthodes de séquençage de l’ADN basées sur la culture ou les méthodes de séquençage de l’ADN. La première méthode est problématique en raison des bactéries récupérables limitées et la seconde approche identifie les bactéries vivantes et mortes conduisant à une représentation aberrante de l’espace oculaire. Nous avons développé une méthode robuste et sensible pour l’isolement bactérien en nous appuyant sur des techniques de culture microbiologique standard. Il s’agit d’une technique basée sur un écouvillon, utilisant un écouvillon mince « en laboratoire » qui cible la conjonctive inférieure, suivi d’une étape d’amplification pour les genres aérobies et anaérobies facultatifs. Ce protocole nous a permis d’isoler et d’identifier des espèces conjonctivales telles que Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp.,etc. L’approche convient pour définir la diversité commensale chez les souris dans différentes conditions de maladie.

Introduction

Le but de ce protocole est d’améliorer l’isolement spécifique des microbes aérobies et anaérobies facultatifs viables et rares de la conjonctive oculaire pour caractériser le microbiome oculaire. Des études approfondies ont profilé les communautés muqueuses commensales sur la peau, l’intestin, les voies respiratoires et génitales et montrent que ces communautés influencent le développement du système immunitaire et la réponse1,2,3. Il a été démontré que les communautés commensales oculaires changent au cours de certaines pathologies, telles que la sécheresse oculaire4,le syndrome de Sjögren5 et le diabète6. Pourtant, la capacité de définir une communauté commensale de surface oculaire typique est entravée par leur abondance relativement faible par rapport aux autres sites muqueux6,7,8. Cela suscite une controverse sur l’existence d’un microbiome oculaire résident et, s’il existe, s’il diffère du microbiome cutané et, par conséquent, de son effet local sur le développement et la réponse du système immunitaire inné. Ce protocole peut aider à résoudre cette question.

Généralement, les approches pour définir la niche commensale oculaire sont basées sur des techniques de séquençage et de culture4,7,9. Le séquençage de l’ADNr 16 S et l’analyse BRISK7 montrent une plus grande diversité que les techniques basées sur la culture, mais sont incapables de faire la différence entre les microbes vivants et morts. Étant donné que la surface oculaire est hostile à de nombreux microbes en raison des propriétés antimicrobiennes du film lacryptique4 générant un large éventail de fragments d’ADN, les approches basées sur l’ADN détecteront ces artefacts qui peuvent biaiser les données vers l’identification des bactéries mortes en tant que commensaux résidents plutôt que contaminants. Il en résulte une identification et une caractérisation commensales aberrantes de l’espace oculaire comme étant plus élevées en abondance et en diversité microbles10. Il est donc difficile de définir le microbiome oculaire résident par des méthodes basées sur l’ADN. Considérant que les techniques standard basées sur la culture sont incapables de détecter les commensaux parce que la charge est trop faible11. Notre méthode améliore les pratiques standard en utilisant un écouvillon mince qui peut cibler la conjonctive, évitant ainsi la contamination de la peau voisine, ainsi que le concept selon lequel les organismes viables peuvent être enrichis par une brève culture dans des milieux denses en nutriments dans le but de ressusciter viable mais non cultivable, ainsi que d’enrichir pour les microbes viables rares.

Les résultats, l’abondance relative des commensaux oculaires par écouvillonnage oculaire, caractérisent le microbiome résident de la conjonctive et sont importants à des fins de comparaison. Nos données montrent qu’il y a une différence entre la peau et le microbiote conjonctival, ainsi qu’une plus grande diversité avec l’âge et une différence d’abondance spécifique au sexe. De plus, cette approche a permis de trouver de manière reproductible des différences commensales chez les souris knock-out12. Ce protocole peut être appliqué pour décrire le microbiome oculaire qui peut varier en raison des pratiques de mise en cage, de la géographie ou de l’état pathologique, ainsi que des effets locaux des métabolites et des produits commensaux sur le développement et la réponse du système immunitaire.

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Protocole

Toutes les procédures impliquant des souris suivent les lignes directrices du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux. Suivez les directives de sécurité du laboratoire (selon les directives de votre service d’intégrité et de sécurité environnementales en établissement) lorsque vous travaillez avec des micro-organismes et des matières potentiellement contaminées. Utiliser des récipients à déchets et des procédures de décontamination appropriés avant d’éliminer les matières potentiellement contaminées par des biorisques.

1. Préparation de l’écouvillonnage oculaire, mise en place du terrain de travail, écouvillonnage de l’œil de souris et enrichissement de l’échantillon

  1. Préparer des écouvillons oculaires stériles
    REMARQUE: Les écouvillons stériles sont des cure-dents en bois finement enduits avec une fine couche de fibres de coton et fabriqués à l’interne.
    1. Autoclave quantité appropriée de lamation de coton et de cure-dents pour le nombre de souris à écouvillons.
    2. Pincez un morceau de coton d’un demi-centimètre de long avec le pouce et l’index. Taquinez la batte en tirant sur les bords avec les pouces et les index pour former une seule couche poreuse plate, en s’arrêtant juste avant que la batte ne s’effondre (de petits morceaux de coton dispersés dans la batte étirée sont acceptables).
    3. Faites pivoter la batte autour de l’une des extrémités pointues du cure-dent en maintenant légèrement la pièce étirée sur la pointe du cure-dent pendant qu’elle est tordue , voir la figure 1. L’écouvillonnage oculaire « terminé » aura une très fine couche de coton tendue sur la pointe, s’étendant sur environ un demi-centimètre à un centimètre de la pointe.
    4. Insérer les écouvillons « terminés » dans le petit bécher, l’écouvillon côté vers le bas et le couvercle. autoclave.
  2. Configurer l’espace de travail
    1. Préparer une anesthésie contenant 2 mL de kétamine (100 mg/mL), 400 μL de xylazine (100 mg/ml) et 27,6 mL de solution saline stérile (NaCl à 0,9 % dans dH2O) dans un tube de centrifugation stérile de 50 mL. Stériliser le filtre et aliquoter l’anesthésie pour une utilisation immédiate (peut être conservé à 4 °C pendant 1 mois; toujours laisser s’équilibrer à la température ambiante avant l’utilisation).
    2. Nettoyez et nettoyez l’aire de travail avec du désinfectant pour minimiser la contamination.
    3. Aliquote 0,5 mL de milieu stérile d’infusion de cœur de cerveau (BHI) dans des tubes de microcentrifugation stériles étiquetés de 1,5 mL (1 tube par souris et témoin); disposer en rack microcentrifuge. Placez le rack sur la glace.
    4. Configurez le flux de travail comme suit (de gauche à droite) : station d’anesthésie de souris (cage contenant des souris expérimentales, cage stérile vide, anesthésie à température ambiante, aiguille de 25 G et seringue de 1 ml), station d’écouvillonnage des yeux (BHI aliquoted sur glace, écouvillons stériles, serviettes en papier propre, pulvérisation d’isopropanol à 70 %) et station de placage (plaques de gélose au sang à température ambiante, pipette de 10 μL , 10 μL de décharges stériles jetables, contenant de déchets à biorisque).
  3. Écouvillonnage
    1. Administrer 10 μL d’anesthésie par 1 g de dose de kétamine et de xylazine respectivement par voie intrapéritonéale à chaque souris adulte et placer dans une cage autoclavée. Tester l’anesthésie en serrant le coussinet du pied arrière; aucun mouvement n’indique une anesthésie appropriée.
    2. Assignez une main pour ne manipuler que les souris anesthésiées et l’autre main pour ne manipuler que l’écouvillon oculaire et la culture. Pour l’écouvillonnage, retirez la souris entièrement anesthésiée de la cage; placer sur le dessus de la surface de travail propre positionnée sur son côté avec l’œil gauche exposé. Vaporisez les mains gantées avec de l’isopropanol, sec avec une serviette en papier propre.
    3. Uncap spécifiquement étiqueté tube micro-centrifugeuse BHI avec main de manipulation de support dédiée. Replacez le tube dans le rack de micro-centrifugeuse sur de la glace.  Trempez la pointe enduite de coton de l’écouvillon dans BHI, retirez l’écouvillon oculaire du tube en faisant tourbillonner la pointe 2 fois contre la chambre à air pour éliminer l’excès de liquide.
    4. Avec la main de manipulation de la souris, tenez doucement la souris par la peau du cou. D’autre part, placez le bout de l’écouvillon contre la région conjonctivale médiale de l’œil gauche, voir la figure 2A. Relâchez légèrement le globe oculaire et déplacez l’écouvillon dans un mouvement de lavage de fenêtre(figure 2B)d’avant en arrière, entre la paupière inférieure et l’œil, 10 fois. Maintenez une pression constante.
    5. Sans toucher la fourrure, retirez délicatement la pointe de l’écouvillon, perpendiculairement à l’endroit où elle a été insérée, et placez le côté coton-tige de l’écouvillon directement dans un tube à micro-centrifugeuse étiqueté contenant un milieu BHI. Appliquez une goutte oculaire lubrifiante sur l’œil écouvillonné.
    6. Retournez la souris dans la cage.
    7. Laissez reposer l’écouvillon pendant 10 à 15 min sur de la glace et retirez l’écouvillonnage avec la main gantée stérilisée en mélangeant la pointe dans le support pendant 10 rotations. Retirer l’écouvillon en faisant tourbillonner la pointe contre la paroi interne du tube de micro-centrifugeuse pendant 5 rotations. Jetez l’écouvillon dans un contenant de biorisque.
    8. Répéter les étapes 1.3.2 à 1.3.7 pour chaque souris et pour les échantillons témoins (écouvillonnage de peau ou de fourrure). Stérilisez les gants de manière appropriée entre chaque écouvillon.
  4. enrichissement
    1. Enrichir l’échantillon en incubant le tube statiquement pendant 1 h à 37 °C
    2. Pendant l’incubation, étiquetez une trypticase à température ambiante Soja avec 5% de plaque de gélose sanguine de mouton (plaque TSA) par souris et divisez-la en deux.
    3. Après l’incubation de la culture par écouvillonnage oculaire, retirer les échantillons enrichis de l’incubateur et les placer sur de la glace.
    4. Brièvement des échantillons de vortex à mélanger et à plaquer selon le schéma de la figure 3A. Aliquote 10 μL de l’échantillon sur la plaque TSA et incliner la plaque pour former une bande, répéter 2 fois.
    5. De l’autre côté de la ligne de séparation de la plaque, point 10 μL d’échantillon sur gélose, répéter 9 fois.
    6. Incuber les plaques à 37 °C pendant 18 h, 2 jours et 4 jours (dans une chambre propre qui empêche les plaques de gélose de sécher). Comptez les colonies en bandes, notez la morphologie et calculez les unités formant colonies (UFC) par écouvillon pour les isolats morphologiquement similaires. Regardez les points pour les organismes uniques qui ne sont pas capturés dans des bandes.

2. Plaque maîtresse, caractérisation et identification des microbes oculaires

  1. Plaque maîtresse
    1. Dessinez des grilles à l’arrière d’une plaque TSA (Figure 3B). Choisissez une colonie avec un cure-dent stérile dans chaque plaque d’écouvillonnage des yeux de souris et stries le carré de la plaque maîtresse (grilles), étiquetez la grille avec le numéro de colonie et les informations sur la souris. Choisissez et plaquez trois colonies différentes pour chaque colonie morphologiquement distincte.
    2. Incuber la plaque pendant une nuit à 37 °C. Poursuivre l’incubation pendant 96 heures, en vérifiant quotidiennement l’apparition de nouveaux isolats.
      REMARQUE: La population commensale variera en fonction de l’âge de la souris, de la nutrition, de l’état de la maladie et des pratiques de mise en cage. La caractérisation des isolats est basée sur les bactéries anaérobies aérobies et facultatives prédominantes trouvées dans notre laboratoire.
  2. caractérisation
    1. Dupliquer13 microbes sur les plaques de gélose au sel de mannitol (MSA) et de MacConkey (MAC), incuber pendant la nuit à 37 °C. Notez la croissance pour chaque isolat et la présence de colonies cireuses ou de colonies jaunes avec halo sur MSA.
    2. Pour les cocci Gram positif, test avec le test de catalase13,14. Placez une goutte de peroxyde d’hydrogène à 3% sur une lame de verre propre. À l’aide d’un cure-dent stérile, choisissez le microbe correspondant dans la plaque d’écouvillonnage oculaire. Aucune formation de bulles n’indique Streptococcus spp.,une légère formation de bulles indique Corynebacterium spp. et peut-être Aerococcus spp. et la formation rapide de bulles indique Staphylococcus spp.
  3. Identification : Analyse maldi-tof ms
    REMARQUE: Les identifications bactériennes sont effectuées à l’aide du MALDI-TOF et de la base de données logicielle. Ce système utilise la spectrométrie de masse à ionisation par désorption laser assistée par matrice (MALDI-TOF MS) pour développer des profils de spectres qui sont comparés aux spectres bactériens connus pour l’identification. E.coli, ATCC 8739, est utilisé pour l’étalonnage du système.
    1. Plaquer les isolats bactériens sur les plaques de TSA contenant 5% de sang de mouton et incuber pendant la nuit avec 5% de dioxyde de carbone à 37 °C.
    2. À l’aide d’une boucle de 1 μL, appliquez une fine couche de bactéries pures sur la lame cible MALDI-TOF; 1 μL de solution matricielle MALDI-TOF MS CHCA (acide alpha-cyano-4-hydroxycinnamique) est superposée et laissée sécher complètement à l’air avant de charger la lame dans l’instrument MALDI-TOF.
    3. Chaque isolat est repéré en double.
    4. Les rapports contenant des scores de probabilité supérieurs à 80%, qui indiquent une valeur de discrimination élevée, sont acceptés comme des résultats fiables et l’identification bactérienne acceptée.

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Résultats

Des résultats représentatifs pour une plaque d’écouvillonnage montrant différentes méthodes de placage sont illustrés à la figure 3A montrant des isolats morphologiquement divers de souris C57BL/6. Pour chaque isolat distinct, les colonies ont été comptées dans la bande et l’abondance relative, unités formant colonies (UFC) uniques par écouvillonnage oculaire, a été calculée et tracée à des fins de comparaison. Pour la caractérisation microbiologique, les bactéries ont été prélevées à partir...

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Discussion

En raison de l’état paucibactérien de la surface oculaire, de nombreux laboratoires ont eu du mal à isoler les commensaux oculaires7,20,ce qui a entraîné un faible nombre d’échantillons avec croissance, une faible abondance et une faible diversité8. Ce procédé améliore significativement les pratiques de culture standard4,21 par l’ajout d’une étape d’enrichissement, ainsi que d’un é...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Le financement de P30 DK034854 a soutenu VY, LB et des études dans le Massachusetts Host-Microbiome Center et le financement de NIH / NEI R01 EY022054 a soutenu MG.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,1 à 10 & micro ; l pointe de pipetteUSA Scientific1110-300autoclave avant utilisation
0,5 à 10 & micro ; l Pipette EppendorfFisher Scientific13-690-026
Seringue de 1 mlFisher ScientificBD3096231 seringue pour chaque groupe d’écouvillon oculaire
1,5 ml Tubes EppendorfUSA Scientific1615-5500autoclave avant utilisation
1000 & micro ; ml pointe de pipetteUSA Scientific1111-2021autoclave avant utilisation
200 à 1000µ ; l Pipeteur Gilson (P1000)Fisher ScientificF123602G
Aiguille 25 GFisher Scientific14-826AA1 aiguille par écouvillon oculaire groupe
3 % Peroxyde d’hydrogèneFisher ScientificS25359
37 ° ; C Incubateur Équipementde laboratoire
70 % IsopropanolFisher ScientificPX1840-4
Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml)Santa Cruz Animal HealthSC-362949Rx
BD BBL Gram Stain kitFisher ScientificB12539
Bunsen Burner Équipementde laboratoire
propreLaboratoire équipement
Ouate de coton/Coton roulé stérileCVS
Jetable 1 ml PipetsFisher Scientific13-711-9AMpour les tests de coloration de Gram et de catalase
E.coliATTCATCC 8739
Lames de verreFisher Scientific12-550-A3pour les tests de coloration de Gram et de catalase
Kétamine ( 100mg/ml)Henry Schein9950001
Mac Conkey Agar PlatesFisher Scientific4321270se conservent à 4 ° ; C jusqu’au moment de l’utilisation
Mannitol Salt AgarCarolina Biological Supply784641Préparez les plaques selon les instructions du fabricant, conservez à 4 ° ; C pour 1 semaine
SourisJackson LabsC57/BL6J
Boîtes de PétriFisher Scientific08-757-12pour Mannitol Plaques de gélose au sel
RPI Cerveau Cœur Milieu de perfusionFisher Scientific50-488525préparer selon les instructions et autoclave
SteriFlip (0.22 µ ; sulfone en polyester de taille de pores)EMD/Millipore, Fisher ScientifcSCGP00525pour stériliser l’anesthésie
Tube à centrifuger stérile Corning Préparationde l’anesthésieFisher Scientific
Cage de souris stérileÉquipement
Cure-dents (rond en bambou)Autoclave avant utilisation et préparation
Trypticase Gélose de soja II avec 5 % de sang de mouton PlaquesScientific4321261magasin à 4 ° ; C jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi
Lame cible VitekBioMérieux Inc. Durham, Caroline du Nord
Vitek-MSBioMérieux Inc. Durham, Caroline du Nord
matricielle Vitek-MS CHCABioMérieux Inc. Durham, Caroline du Nord411071
Gouttes oculaires à usage uniqueCVS PharmacyBausch and Lomb Soothe Gouttes oculaires lubrifiantes, 28 flacons, 0,02 oz liq.
Essuie-tout 430829de laboratoire de l’écouvillon Fisher Solution chacun

Références

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