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Article de méthode

Isolement de tissus de haute pureté à partir de graines d’orge en développement

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DOI :

10.3791/61681

⸱

26 octobre 2020

 ,  , 
1Czech Acad Sci, Centre of the Region Haná for Biotechnological and Agricultural Research, Institute of Experimental Botany, 2The Polish Academy of Sciences, The Franciszek Górski Institute of Plant Physiology

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole d’isolement manuel de haute pureté et de contrôle de la qualité des tissus maternels de l’embryon, de l’endosperme et des graines pendant tout le développement des graines d’orge.

Résumé

Comprendre les mécanismes régulant le développement des graines de céréales est essentiel pour la sélection végétale et l’augmentation des rendements. Cependant, l’analyse des graines de céréales est difficile en raison de leur taille minuscule, du caractère liquide de certains tissus et des liaisons intertissulaires étroites. Ici, nous démontrons un protocole détaillé pour la dissection de l’embryon, de l’endosperme et des tissus maternels des graines aux stades précoces, intermédiaires et tardifs du développement des graines d’orge. Le protocole est basé sur une dissection tissulaire manuelle à l’aide d’outils à pointe fine et d’un microscope binoculaire, suivie d’un contrôle de pureté basé sur l’analyse de la ploïdie. Les tissus maternels et les embryons des graines sont diploïdes, tandis que l’albumen est du tissu triploïde. Cela permet de surveiller la pureté de l’échantillon à l’aide de la cytométrie en flux. Des mesures supplémentaires ont révélé la haute qualité de l’ARN isolé à partir de ces échantillons et leur aptitude à l’analyse à haute sensibilité. En conclusion, ce protocole décrit comment disséquer pratiquement les tissus purs des grains en développement d’orge cultivée et potentiellement aussi d’autres céréales.

Introduction

Les graines sont des structures complexes composées de plusieurs tissus d’origine maternelle et filiale1. Les grains de céréales représentent un type particulier de graines, la plus grande partie étant formée par l’endosperme, un tissu triploïde spécialisé qui protège et nourrit l’embryon. Les céréales fournissent environ 60 % des ressources alimentaires mondiales et constituent la production végétale la plus précieuse2. La connaissance des processus moléculaires contrôlant le développement des graines de céréales est importante en raison de leur importance économique et de leur rôle central dans la reproduction des plantes 1,3.

L’orge cultivée (Hordeum vulgare subsp. vulgare ; 2n = 2x = 14 ; 1C = 5,1 Gbp) est la quatrième culture céréalière la plus importante dans le monde. Il est utilisé pour l’alimentation animale, l’alimentation humaine et la biotechnologie4. En outre, il s’agit également d’une espèce modèle de culture céréalière classique en zone tempérée d’une importance croissante5. Les ressources génomiques de l’orge comprennent des cartes génétiques, des collections de cultivars, de variétés locales et de mutants, des assemblages et des annotations de génome de haute qualité ainsi que des données transcriptomiques des principaux stades de développement 5,6,7. De plus, les gènes de l’orge sont utilisés pour l’amélioration génétique d’autres céréales. La résistance aux stress abiotiques tels que la sécheresse et la salinité, à des agents pathogènes spécifiques et à une teneur élevée en composés bénéfiques (p. ex., β-glucane) font de l’orge une source précieuse de caractères pour la sélection du blé8.

Le développement des semences est initié par la fertilisation le jour de la pollinisation (DOP). La DOP est définie par l’évaluation de la morphologie du stigmate et des anthères selon l’échelle de Waddington (W10.0)9. Les épis contenant des fleurs non pollinisées étaient caractérisés par un stigmate compact (non ramifié) et des anthères vertes, tandis que les épis pollinisés contenaient des spiklets allongés, un stigmate allongé et largement ramifié, un ovule gonflé, des anthères ouvertes et du pollen libre. Les fleurs à DOP représentaient un phénotype intermédiaire. Les anthères avaient une couleur jaune, se perturbaient facilement puis libéraient du pollen. Le stigmate avait des branches sigmatiques du pistil largement répandues (Figure 1C).

Le développement des semences d’orge comprend trois stades qui se chevauchent partiellement 1,10. Le stade I (0 à 6 jours après la pollinisation ; DAP) est lancé par une double fécondation, caractérisée par la prolifération cellulaire et l’absence de synthèse de l’amidon ; l’étape II (7 – 20 DAP) comprend la différenciation et un grand gain de biomasse accompagnés de la production de molécules de stockage d’amidon et de protéines ; le stade III (après 21 DAP) correspond à la maturation des graines, à la réduction de poids par dessiccation et au début de la dormance. Alternativement, les phases sont appelées précoce, intermédiaire et tardive, respectivement11.

Le grain d’orge est recouvert de coques, qui se composent de la lemme, de la palea et des glumes12. Dans la plupart des génotypes d’orge, les coques enveloppent étroitement les graines sèches. La graine elle-même est formée par l’embryon, l’endosperme et les tissus maternels de la graine (Figure 1A). L’embryon diploïde provient de la fécondation de l’ovule par un noyau de spermatozoïde. Dans la graine complètement développée, l’embryon se compose de l’axe embryonnaire avec le coléorhiza entourant la radicule, le coléoptile entourant le méristème de la pousse et les feuilles primaires, et le scutellum (cotylédon)1,10,13,14. L’endosperme triploïde est le résultat de la fécondation de la cellule centrale diploïde par le deuxième noyau de spermatozoïde. La prolifération de l’endosperme commence avec le stade syncytial (cénocytes), où les noyaux en division sont poussés vers la périphérie par la vacuole centrale. À la fin de la phase syncytiale, les microtubules forment un réseau radial autour des noyaux et indiquent la formation de la paroi cellulaire anticlinale et le début de la cellularisation de l’endosperme. La différenciation de l’endosperme se produit en même temps que la cellularisation et aboutit à cinq tissus principaux : l’endosperme amylacé, les cellules de transfert, les couches d’aleurone et de sous-aleurone, et la région environnante de l’embryon. Les tissus maternels des graines sont une structure diploïde multicouche d’origine maternelle contenant un péricarpe et des téguments10,12. Les tissus maternels de la graine comprennent une projection nucellaire sur la face dorsale du grain qui a une fonction liée au transport et s’incruste dans l’endosperme aux stades ultérieurs du développement de la graine15.

figure-introduction-1
Figure 1 : Développement des graines d’orge. (A) Le dessin schématique du grain de céréales au plan sagittal avec indication des tissus maternels de la graine (SMT, vert), de l’endosperme (END, jaune), de l’embryon (EMB, orange) et des coques (H, gris). (B) Morphologie de l’épi d’orge près de l’anthèse. Barre d’échelle = 1 cm. (C) Morphologie du stigmate et des anthères aux stades avant, pendant et après la pollinisation. L’encart montre les détails du stigmate avec des grains de pollen (pointes de flèches). Barre d’échelle = 5 mm, barre d’encastrement = 200 μm. (D) Sections sagittales et transversales de 4, 8, 16 et 24 graines DAP. (NP, projection nucellaire) Barre d’échelle = 5 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les progrès récents de la génomique à haut débit fournissent les outils nécessaires à l’étude du développement des tissus individuels des graines. Cependant, le principal obstacle à cet objectif est la structure compacte et l’adhérence serrée des tissus de la graine1. Nous avons développé un protocole pour la dissection de haute pureté des tissus des graines, depuis le développement des graines d’orge, avec la possibilité d’une utilisation ultérieure pour des analyses très sensibles, telles que le séquençage de l’ARN. De plus, le protocole présenté peut être facilement adapté à d’autres céréales.

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Protocole

1. Cultiver des plantes

REMARQUE : Étant donné qu’un seul plant d’orge a généralement 5 à 6 talles et que seuls les 5 à 6 épillets du milieu de chaque épi doivent être utilisés pour la dissection, le rendement maximal par plante est de 72 graines pour les cultivars à deux rangs et de 216 graines pour les cultivars à six rangs.

  1. Pour faire germer les graines d’orge, préparez une boîte de Pétri rembourrée de trois couches de papier de soie en cellulose recouverte d’une couche de papier filtre. Hydratez-le avec de l’eau distillée, afin qu’il n’y ait pas d’excès d’eau, placez les graines à la surface et fermez la boîte de Pétri. Le papier filtrant évite de faire pousser les racines à travers le tissu cellulosique. Faites germer les graines pendant 3 jours à 25 °C dans l’obscurité.
    REMARQUE : Alternativement, faites germer les graines en les mettant directement dans un mélange de sol humide (voir étape 1.2).
  2. Transférez les graines germées avec une radicule visible et une pousse d’environ 5 cm dans des pots de tourbe de 5 cm x 5 cm avec un mélange de terre et de sable (3:1, v/v). Arrosez régulièrement. Après 10 jours, transférez les plantes dans des pots de 12 cm x 12 cm remplis du même mélange de terre.
  3. Cultivez les plantes dans une chambre climatique sous le régime contrôlé des jours longs (16 h jour 20 °C, 8 h nuit 16 °C ; intensité lumineuse 200 μmol m-2 s-1 ; humidité 60 %).
    REMARQUE : L’orge de printemps a besoin d’environ 8 à 10 semaines entre le semis et le début de l’anthèse, sans qu’il soit nécessaire de vernaliser. L’orge d’hiver a besoin de 7 à 8 semaines de vernalisation (conditions de jours courts, 8 h de jour 4 °C, 16 h de nuit 4 °C ; intensité lumineuse 200 μmol m-2 s-1 ; humidité 85 %) pour induire la floraison.

2. Détermination de la pollinisation

REMARQUE : Une détermination précise de la pollinisation est nécessaire pour une estimation correcte de la progression du développement. L’orge est une espèce autogame. Pour définir le jour de pollinisation (DOP), nous avons surveillé le jour de l’autopollinisation. Ce caractère est spécifique au cultivar, mais le fait de commencer à faire saillie des arêtes à partir de la gaine foliaire est un bon indicateur de l’approche de la DOP (figure 1B).

  1. Ouvrez la gaine foliaire qui recouvre l’épi. À l’aide d’une pince à épiler à pointe fine, vérifiez les anthères et l’ovaire à l’intérieur des épillets dans la partie centrale de l’épi. Les épillets avec des anthères jaunes et un stigmate « duveteux » pollinisent en quelques heures16 et sont considérés comme DOP (figure 1B).
  2. Coupez l’épi près de l’extrémité du dernier épillet, puis retirez la dernière feuille et la partie supérieure des arêtes. Ensuite, coupez le 1/3 supérieur des coques de chaque épillet. Cela assèche les anthères et conduit à leur ouverture et à leur libération de pollen plus synchronisées.
  3. Couvrez le pic avec un sac en cristal avec l’ID du pic, le numéro de la plante et la date de DOP définie. Cela empêche également la pollinisation croisée, qui peut compromettre des expériences spécifiques.
  4. Notez les informations à l’aide d’un éditeur tabulaire. Utilisez la formule suivante pour calculer le jour suivant la pollinisation (DAP) où l’isolement des tissus doit avoir lieu.
    xDAP = DOP + x
    x = DAP attendu
    REMARQUE : Les valeurs doivent être au format « Données ».
  5. Pour la dissection des tissus des graines, prélever les épis au DAP selon le calendrier tabulaire préparé.

3. Dissection des tissus de la graine

REMARQUE : Les étapes suivantes doivent être effectuées à l’aide d’un stéréomicroscope. Retirez les coques avant la dissection à l’aide d’une pince à épiler. A noter que les coques deviennent plus sèches et plus adhérentes à partir d’environ 16 DAP. Pour maintenir les conditions physiologiques et éviter le dessèchement des matières végétales lors de la dissection, humidifier les échantillons en les mettant dans une goutte de 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH = 7,4). Utilisez une nouvelle graine pour la dissection de chaque tissu afin d’éviter la dégradation de l’ADN, de l’ARN ou des protéines en raison du temps de collecte prolongé des échantillons. Pour l’isolement de l’ARN à partir de matériel disséqué, utilisez uniquement des matériaux et des produits chimiques sans RNase. Ne pas dépasser le temps total de dissection de 15 minutes pour un échantillon constitué généralement de tissus disséqués à partir de 5 à 10 graines afin de minimiser la dégradation de l’ARN.

  1. Retirez le reste des coques à l’aide d’une pince à épiler à pointe fine avant la dissection des tissus. L’hydratation avec 1× PBS pendant 1 minute aide à éliminer les résidus secs de l’épillet.
  2. Placez la graine pelée sur une boîte de Pétri avec une goutte de 1× PBS et disséquez les différentes parties à l’aide d’une pince à épiler à pointe fine, d’une aiguille fine et d’une pipette microcapillaire. Une stratégie légèrement différente est appliquée pour la dissection de tissus individuels : les tissus maternels de la graine (étape 3.3), l’embryon (étape 3.4) et l’endosperme (étape 3.5).
  3. Dissection des tissus maternels de la graine
    1. Dissection à partir de graines jusqu’à 8 DAP
      1. Placez une graine sur la face dorsale et coupez doucement la graine le long d’un axe longitudinal, et retirez les tissus maternels de la graine à l’exception de la dernière couche bordant l’endosperme de la partie apicale à la partie basale à l’aide d’une pince à épiler.
      2. Prélever les tissus maternels de 5 à 10 graines dans un tube de 1,5 mL avec 50 μL de PBS 1×, jeter le tampon à l’aide d’une pipette, rincer le tissu deux fois avec 100 μL de PBS, retirer l’excédent de tampon par pipetage et fermer le tube et congeler dans de l’azote liquide ou l’utiliser directement pour la mesure de la ploïdie par cytométrie en flux. La quantité de matériau est généralement suffisante pour une application en aval (par exemple, l’isolement d’ARN ou la mesure de la ploïdie par cytométrie en flux).
    2. Dissection à partir de graines après 8 DAP
      1. Placez une graine sur la face dorsale, coupez doucement au milieu de la face ventrale des tissus maternels de la graine et décollez progressivement le tissu autour de la graine entière, y compris la projection nucellaire. Pour chaque application en aval, prélever et laver le tissu de 5 à 10 graines, comme décrit à l’étape 3.3.1.
  4. Dissection de l’embryon
    1. Dissection à partir de graines à 8 DAP et moins
      1. Placez une graine sur la face dorsale et coupez le 1/3 basal de la graine. Divisez soigneusement la partie séparée en deux et libérez l’embryon. Pour chaque application en aval, prélever et laver les embryons de 10 à 20 graines, comme décrit au point 3.3.1.
    2. Dissection à partir de graines après 8 DAP
      1. Placez une graine sur la face dorsale et retirez les tissus maternels de la graine de la partie basale de la face ventrale. Perturbez doucement la fine couche d’endosperme autour du périmètre de l’embryon à l’aide d’une aiguille fine ou d’une pince à épiler fine et retirez l’embryon. Pour chaque application en aval, prélever et laver les embryons d’un maximum de 5 graines, comme décrit au point 3.3.1.
  5. Dissection de l’endosperme
    1. Dissection de l’endosperme syncytial à partir de 4 graines DAP.
      1. Placez une graine sur la face dorsale et retirez les tissus maternels de la graine, à l’exception de la dernière couche de cellules bordant l’endosperme. Percer doucement la couche au milieu de la face ventrale à l’aide d’une aiguille fine, et aspirer l’endosperme syncytial par capillarité à l’aide d’une pipette microcapillaire.
      2. Pour chaque application en aval, prélever des endospermes liquides de 10 à 15 graines dans un nouveau tube de 1,5 mL avec un tampon adapté à l’analyse en aval prévue (c’est-à-dire 1x PBS, tampon d’isolement de l’ARN, tampon de cytométrie en flux). Le volume de la mémoire tampon doit refléter le protocole pour l’application en aval prévue. Congeler dans de l’azote liquide.
    2. Dissection de l’endosperme cellullarisant de 5 à 8 graines DAP
      1. Placez une graine sur la face dorsale et retirez tous les tissus maternels et l’embryon de la graine. Pour chaque application en aval, prélever et laver l’endosperme de 10 à 15 graines dans un nouveau tube de 1,5 mL avec 1x PBS et congeler dans de l’azote liquide.
    3. Dissection de l’endosperme cellullarisé à partir d’une graine après 8 DAP
      1. Placez une graine sur la face dorsale, retirez tous les tissus maternels et l’embryon de la graine. Pour chaque application en aval, prélever et laver l’endosperme à partir d’une seule graine par tube, comme décrit à l’étape 3.3.1.
  6. Stockez les tubes avec un matériau isolé à – 80 °C jusqu’à utilisation.
    REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.

4. Contrôle de la pureté des tissus par cytométrie en flux

REMARQUE : La pureté de l’échantillon peut être vérifiée à l’aide de la cytométrie en flux avant l’isolement de l’ARN. Un étalonnage correct de l’instrument est essentiel pour l’analyse des échantillons biologiques. L’optique du cytomètre en flux/analyseur de ploïdie doit être ajustée à l’aide de billes d’étalonnage (microsphères de polystyrène colorées par fluorescence, très uniformes en ce qui concerne leur taille et leur intensité de fluorescence) jusqu’à ce que la netteté maximale soit maximale, atteignant généralement le coefficient de variation (CV) < 2 %. Les tissus des graines de céréales contiennent principalement des populations de noyaux G1, G2 et endoredupliqués ; Par conséquent, l’utilisation d’une échelle logarithmique est recommandée. Commencez avec un tissu foliaire qui contient principalement des noyaux G1 et sert de contrôle de la ploïdie basale.

  1. Utilisez des échantillons fraîchement préparés et conservés sur de la glace (voir l’étape 3.3.1) ou des tissus congelés comme décrit17.
    REMARQUE : Étant donné que l’ensemble de l’échantillon < 8 DAP est utilisé pour la cytométrie en flux, il ne s’agit que d’un contrôle indirect. Nous recommandons aux chercheurs d’effectuer plusieurs isolements et mesures jusqu’à ce qu’ils atteignent une proportion élevée d’échantillons purs (>90 %) avant de procéder à l’isolement de l’ARN avec < 8 échantillons DAP.
  2. Libérer les noyaux des échantillons d’embryons de 4 et 8 DAP (pour les autres échantillons, voir l’étape 4.4) en homogénéisant les tissus par 5 à 10 tours du pilon en plastique dans un tube de 1,5 mL contenant 300 μL de tampon Otto I (0,1 M d’acide citrique monohydraté, 0,5 % (v/v) Tween 20, filtré à travers un filtre de 0,22 μm)18.
  3. Filtrer la suspension brute à travers un treillis en nylon de 50 μm dans un tube d’analyse par cytométrie en flux et ajouter 600 μL de tampon Otto II (0,4 M Na2HPO4·12H2O) contenant 2 μg mL-1 DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole)18 pour colorer l’ADN.
  4. Placez tous les autres tissus (y compris 16 embryons DAP ou plus) sur une boîte de Pétri contenant 500 μL de tampon Otto I et homogénéisée en hachant avec une lame de rasoir. Filtrez la suspension comme à l’étape 4.3 et colorez-la avec 1 mL de tampon Otto II contenant du DAPI.
    REMARQUE : La manipulation avec une lame de rasoir tranchante à double tranchant nécessite une attention particulière. Pour réduire le risque de blessure, il existe des lames de rasoir à un seul tranchant ou des porte-lames spéciaux.
  5. Estimez la teneur en ADN nucléaire de l’échantillon à l’aide d’un cytomètre en flux. Au moins 2000 particules par échantillon sont nécessaires pour analyser la pureté de l’échantillon.

5. Isolement de l’ARN et mesure de la qualité

  1. Utilisez des tissus congelés pour prévenir la dégradation de l’ARN par les ribonucléases endogènes. À partir de graines, de tissus maternels et d’échantillons d’embryons, isolez l’ARN à l’aide de kits disponibles dans le commerce ou du réactif TRIzol19. En raison de la teneur élevée en amidon des tissus de l’endosperme, isoler l’ARN total de tous les échantillons à l’aide de protocoles commerciaux d’extraction de l’ARN sur colonne pour les tissus problématiques (p. ex., Spectrum Plant Total RNA Kit) avec un traitement DNase I sur colonne20.
  2. Mesurez la concentration et l’intégrité de l’ARN à l’aide d’un protocole dédié pour l’électrophorèse sur gel d’ARN ou du bioanalyseur Agilent 2100.
    REMARQUE : L’ARN total intact présente des bandes/pics clairs d’ARNr 18S et 25S d’une taille d’environ 1,9 et 3,7 kb respectivement. La bande ARNr 25S devrait être environ deux fois plus intense que la bande ARNr 18S.

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Résultats

Pour effectuer une analyse transcriptomique spécifique aux tissus du développement des graines d’orge, nous avons établi un protocole d’isolement tissulaire de haute pureté. Le protocole est basé sur la dissection manuelle de tissus maternels d’embryons, d’endospermes et de graines à partir de grains pelés (après enlèvement manuel de la coque) (figure 1A). Le protocole a été utilisé avec succès pour isoler les matériaux de plusieurs cultivars d’orge de printemps à deux et six rangs, et les é...

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Discussion

Ici, nous présentons un protocole qui permet l’isolement de haute pureté des tissus des graines d’orge. Bien qu’il ait été développé et testé pour l’orge, il peut être facilement adopté par d’autres membres de la tribu Triticeae tels que le blé, l’avoine, le seigle ou le triticale27. La première partie du protocole, axée sur la dissection des tissus de graines, ne nécessite aucun équipement non standard ou coûteux et devrait donc être accessible à de nomb...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions le Dr Jan Vrána et le Dr Mahmoud Said pour l’entretien des cytomètres en flux, Eva Jahnová pour la préparation des tampons, Marie Seifertová pour la liste des matériaux et Zdenka Bursová pour l’entretien des plantes. Ce travail a été soutenu principalement par la subvention 18-12197S de la Fondation tchèque pour la science. A.P. a également bénéficié de la bourse J. E. Purkyně de l’Académie tchèque des sciences et du projet FEDER « Les plantes comme outil de développement mondial durable » (n° 100). CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000827).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,22 um filtreMerckSLGSV255F
1,5 ml Eppendorf tubeSarstedt72.690.001
4',6-diamididno-2-phénylindoleInvitrogenD21490
50 um maille de nylonSilk a Progrersuhelon 120 T
Agilent 2100 BioanalyseurAgilentG2939BA
Bulb AssemblyDrummond Scientific Company1-000-9000
Perles d’étalonnageInvitrogenA16502
de soie en cellulose
Acide citrique monohydratéPenta13830-31000
Chambre climatiqueWeiss Gallenkamp
DNase ISigma AldrichDNASE70
Filter papierFagron
Pince à épiler à pointe fineOutils de science fine11254-20
Cytomètreen flux Sysmex-Partec
Tube de cytométrie en fluxSarstedt55.484
Congélateur
Sac
KClLachner30076-AP0
KH2PO4Litolab100109
Azote liquideLinde
Pipette microcapillaireFivephoton BiochemicalsMGM 1C-20-30
Minutien PinsFine Science Tools26002-20
Na2HPO4Lachema
Na2HPO4.12H2OLachner30061-AP0
NaClLachner30093-AP0
Pots de tourbeJiffy5x5 cm
Boîte de Pétri
Porte-épingleFine Science Tools26016-12
Pilon en plastiquep-LabA199001
Pots12x12 cm
Lame de rasoirGillette
RNAse zapInvitrogenAM9780
Ciseaux
Spectre de sol
Plante Kit d’ARN totalSigma AldrichSTRN50
StéréomicroscopeOlympus
P2287
TRIzol réactifInvitrogen15596026
ARN 6000 Pico KitAgilent5067-1513
Papier en cristal de sable Outils scientifiques fins 14060-11 Tween 20 Sigma Aldrich

Références

  1. Sreenivasulu, N., et al. Barley grain development: Toward an integrative view. International Review of Cell and Molecular Biology. 281, 49-89 (2010).
  2. FAO. Cereal supply and demand brief. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Available from: http://www.fao.org (2019).
  3. Baik, B. K., Ullrich, S. E. Barley for food: Characteristics, improvement, and renewed interest. Journal of Cereal Science. 48 (2), 233-242 (2008).
  4. Langridge, P. Economic and Academic Importance of Barley. The Barley Genome. Stein, N., Muehlbauer, G. J. , Springer. Cham. Switzerland, AG. 1-10 (2018).
  5. Mascher, M., et al. A chromosome conformation capture ordered sequence of the barley genome. Nature. 544 (7651), 427-433 (2017).
  6. Mascher, M. Pseudomolecules and annotation of the second version of the reference genome sequence assembly of barley cv. Morex V2. Morex. , Available from: https://edal.ipk-gatersleben.de (2019).
  7. Rapazote-Flores, P., et al. BaRTv1.0: An improved barley reference transcript dataset to determine accurate changes in the barley transcriptome using RNA-seq. BMC Genomics. 20 (1), 968(2019).
  8. Molnár-Láng, M., Linc, G., Szakács, É Wheat-barley hybridization: The last 40 years. Euphytica. 195 (3), 315-329 (2014).
  9. Waddington, S. R., Cartwright, P. M., Wall, P. C. A quantitative scale of spike initial and pistil development in barley and wheat. Annals of Botany. 51 (1), 119-130 (1983).
  10. Sabelli, P. A., Larkins, B. A. The development of endosperm in grasses. Plant Physiology. 149 (1), 14-26 (2009).
  11. Dante, R. A., Larkins, B. A., Sabelli, P. A. Cell cycle control and seed development. Frontiers in Plant Science. 5, 1-14 (2014).
  12. Rodríguez, M. V., Barrero, J. M., Corbineau, F., Gubler, F., Benech-Arnold, R. L. Dormancy in cereals (not too much, not so little): About the mechanisms behind this trait. Seed Science Research. 25 (2), 99-119 (2015).
  13. Sreenivasulu, N., et al. Gene expression patterns reveal tissue-specific signaling networks controlling programmed cell death and ABA-regulated maturation in developing barley seeds. Plant Journal. 47 (2), 310-327 (2006).
  14. Olsen, O. A. Nuclear endosperm development in cereals and Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 16, suppl_1 214-227 (2004).
  15. Thiel, J., et al. Different hormonal regulation of cellular differentiation and function in nucellar projection and endosperm transfer cells: A microdissection-based transcriptome study of young barley grains. Plant Physiology. 148 (3), 1436-1452 (2008).
  16. Weschke, W., et al. Sucrose transport into barley seeds: Molecular characterization of two transporters and implications for seed development and starch accumulation. Plant Journal. 21 (5), 455-467 (2000).
  17. Staszak, A. M., Rewers, M., Sliwinska, E., Klupczyńska, E. A., Pawłowski, T. A. DNA synthesis pattern, proteome, and ABA and GA signalling in developing seeds of Norway maple (Acer platanoides). Functional Plant Biology. 46 (2), 152-164 (2019).
  18. Otto, F. Chapter 11 DAPI staining of fixed cells for high-resolution flow cytometry of nuclear DNA. Methods in Cell Biology. 33, 105-110 (1990).
  19. Fisher Scientific. Procedural guidelines. , (2020).
  20. Spectrum TM. Plant Total RNA Kit. , (2020).
  21. Nowicka, A., et al. Dynamics of endoreduplication in developing barley seeds. Journal of Experimental Botany. , eraa453(2020).
  22. Chen, J., et al. Dynamic transcriptome landscape of maize embryo and endosperm development. Plant Physiology. 166 (1), 252-264 (2014).
  23. Zhang, S., Laurie, A. E., Ae, W., Meng, L., Lemaux, P. G. Similarity of expression patterns of knotted1 and ZmLEC1 during somatic and zygotic embryogenesis in maize (Zea mays L.). Springer. 215 (2), 191-194 (2002).
  24. Doll, N. M., et al. Transcriptomics at maize embryo/endosperm interfaces identifies a transcriptionally distinct endosperm subdomain adjacent to the embryo scutellum. Planta. 32 (4), 833-852 (2020).
  25. Yi, F., et al. High temporal-resolution transcriptome landscape of early maize seed development. Plant Cell. 31 (5), 974-992 (2019).
  26. Gómez, E., et al. The maize transcription factor myb-related protein-1 is a key regulator of the differentiation of transfer cells. Plant Cell. 21 (7), 2022-2035 (2009).
  27. Bewley, J. D., Black, M., Halmer, P. The encyclopaedia of seeds: Science, technology and uses. CABI. , Wallingford, UK. (2006).
  28. Liew, L. C., et al. Temporal tissue-specific regulation of transcriptomes during barley (Hordeum vulgare) seed germination. Plant Journal. 101 (3), 700-715 (2020).
  29. Pirrello, J., et al. Transcriptome profiling of sorted endoreduplicated nuclei from tomato fruits: how the global shift in expression ascribed to DNA ploidy influences RNA-Seq data normalization and interpretation. Plant Journal. 93 (2), 387-398 (2018).
  30. Sreenivasulu, N., et al. Transcript profiles and deduced changes of metabolic pathways in maternal and filial tissues of developing barley grains. Plant Journal. 37 (4), 539-553 (2004).
  31. Bian, J., et al. Transcriptional dynamics of grain development in barley (Hordeum vulgare L). International Journal of Molecular Sciences. 20 (4), 962(2019).

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