Préparation des cellules progénitrices adipeuses à partir de tissus adipeux épididymaux de souris

Résumé

Nous présentons une méthode simple pour isoler les cellules progénitrices adipeuses hautement viables des tampons graisseux épididymaux de souris utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence.

Résumé

L’obésité et les désordres métaboliques tels que le diabète, la maladie cardiaque, et le cancer, sont tous associés au remodelage adipeux dramatique de tissu. Les cellules progénitrices adipeuses résidentes des tissus jouent un rôle clé dans l’homéostasie des tissus adipeux et peuvent contribuer à la pathologie tissulaire. L’utilisation croissante de technologies d’analyse à cellules individuelles – y compris le séquençage de l’ARN unicell cellules et la protéomique à cellules individuelles – transforme le champ des cellules souches/progénitrices en permettant une résolution sans précédent des changements d’expression cellulaire individuelle dans le contexte des changements à l’échelle de la population ou des tissus. Dans cet article, nous fournissons des protocoles détaillés pour disséquer le tissu adipeux épididymal de souris, isoler les cellules dérivées de tissus adipeux simples, et effectuer le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour enrichir pour viable Sca1⁺/CD31^-/CD45^-/Ter119^- APC. Ces protocoles permettront aux chercheurs de préparer des APC de haute qualité adaptés aux analyses en aval, comme le séquençage de l’ARN à cellule unique.

Introduction

Le tissu adipeux joue un rôle clé dans le métabolisme énergétique. L’excès d’énergie est stocké sous forme de lipides, et le tissu adipeux est capable d’expansion ou de rétractation significative en fonction de l’état nutritionnel et de la demande énergétique. L’expansion du tissu adipeux peut résulter d’une augmentation de la taille des adipocytes (hypertrophie) et/ou d’une augmentation du nombre d’adipocytes (hyperplasie); ce dernier processus étroitement régulé par la prolifération et la différenciation des cellules progénitrices adipeuses^1,2. Pendant l’obésité, le tissu adipeux se dilate excessivement, et ....

Protocole

Toutes les procédures expérimentales pour animaux ont été effectuées sous approbation par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de la Clinique Mayo.

1. Préparation de la solution

1. Préparer la solution collagène 2% (w/v) en dissolvant la collagène II 2 g dans la solution de sel équilibrée (HBSS) de Hanks de 100 mL. Aliquot 200 μL chacun pour chaque utilisation.
2. Préparer le milieu de neutralisation en mélangeant 84 mL de sérum de cheval F-12, 15 mL de sérum de cheval et 1 mL de pénicilline/streptomycine.
3. Préparez le tampon de cytométrie d’écoulement en dissolvant 500 mg d....

Résultats

Des souris FVB mâles de quatre mois ont été employées dans cette expérience. Après l’exclusion des débris et des doublets à l’aide de parcelles FSC/SSC, des cellules viables (DAPI^- population) ont été fermées, suivies de la sélection d’APC⁺/FITC^- population (figure 1). Les portes DAPI, APC et FITC ont été dessinées en fonction du contrôle non taché. Les stratégies de gating sont indiquées dans la figure 1.

Discussion

Le séquençage à ARN à cellules simples (scRNA-seq) gagne rapidement du terrain en tant qu’outil puissant pour étudier simultanément diverses populations cellulaires au niveau d’une seule cellule. En raison des coûts élevés associés à la préparation de l’échantillon et au séquençage à haut débit, il est impératif d’optimiser les intrants cellulaires (grande viabilité et pureté) afin d’augmenter les chances de succès expérimental. Certains protocoles de préparation cellulaire reposent sur l’enlèvement des cellules mortes e.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube de microcentrifugation de 1,7 mL	VWR	87003-294
Tube de culture de 13 mL Thermo	Fisher Scientific	50-809-216
Tube conique de 15 mL	Greiner Bio-one	188 271
Tube à essai de 5 mL avec filtre à cellules	Thermo Fisher Scientific	08-771-23
Tube conique de 50 mL	Greiner Bio-one	227 261
70 et micro ; Filtre à cellules m	Thermo Fisher Scientific	22-363-548
Anticorps anti-CD31-FITC	Miltenyi Biotec	130-102-519
Anticorps anti-CD45-FITC	Miltenyi Biotec	130-102-491
Anticorps anti-Sca1-APC	Miltenyi Biotec	130-102-833
Anticorps anti-Ter119-FITC	Miltenyi Biotec	130-112-908
BSA	Gold Biotechnology	A-420-500
Collagénase type II	Thermo Fisher Scientific	17101-015
DAPI	Thermo Fisher	D1306
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS)	Thermo Fisher Scientific	14190-144
F-12 medium	Thermo Fisher Scientific	11765-054
Réactif bloquant FcR	Miltenyi Biotec	130-092-575
Solution saline équilibrée de Hanks (HBSS)	Thermo Fisher Scientific	14025-092
Sérum de cheval	Thermo Fisher Scientific	16050-122
Pénicilline-streptomycine	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Solution d’iodure de propidium	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-093-233