Préparation des cellules progénitrices adipeuses à partir de tissus adipeux épididymaux de souris

Résumé

Nous présentons une méthode simple pour isoler les cellules progénitrices adipeuses hautement viables des tampons graisseux épididymaux de souris utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence.

Résumé

L’obésité et les désordres métaboliques tels que le diabète, la maladie cardiaque, et le cancer, sont tous associés au remodelage adipeux dramatique de tissu. Les cellules progénitrices adipeuses résidentes des tissus jouent un rôle clé dans l’homéostasie des tissus adipeux et peuvent contribuer à la pathologie tissulaire. L’utilisation croissante de technologies d’analyse à cellules individuelles – y compris le séquençage de l’ARN unicell cellules et la protéomique à cellules individuelles – transforme le champ des cellules souches/progénitrices en permettant une résolution sans précédent des changements d’expression cellulaire individuelle dans le contexte des changements à l’échelle de la population ou des tissus. Dans cet article, nous fournissons des protocoles détaillés pour disséquer le tissu adipeux épididymal de souris, isoler les cellules dérivées de tissus adipeux simples, et effectuer le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour enrichir pour viable Sca1⁺/CD31^-/CD45^-/Ter119^- APC. Ces protocoles permettront aux chercheurs de préparer des APC de haute qualité adaptés aux analyses en aval, comme le séquençage de l’ARN à cellule unique.

Introduction

Le tissu adipeux joue un rôle clé dans le métabolisme énergétique. L’excès d’énergie est stocké sous forme de lipides, et le tissu adipeux est capable d’expansion ou de rétractation significative en fonction de l’état nutritionnel et de la demande énergétique. L’expansion du tissu adipeux peut résulter d’une augmentation de la taille des adipocytes (hypertrophie) et/ou d’une augmentation du nombre d’adipocytes (hyperplasie); ce dernier processus étroitement régulé par la prolifération et la différenciation des cellules progénitrices adipeuses^1,2. Pendant l’obésité, le tissu adipeux se dilate excessivement, et le dysfonctionnement de tissu - y compris l’hypoxie, l’inflammation, et la résistance à l’insuline -^{développe souvent 3,4.} Ces complications sont des facteurs de risque de nombreuses maladies chroniques, y compris l’hypertension, le diabète, les maladies cardiovasculaires, les accidents vasculaires cérébraux et le cancer⁵. Par conséquent, la limitation de l’expansion incontrôlée des tissus adipeux et l’atténuation des pathologies tissulaires adipeux sont les principales priorités de recherche biomédicale. Au cours de l’expansion des tissus adipeux, les cellules souches adipeuses résidentes dérivées des tissus prolifèrent et se différencient séquentiellement en préadipocytes (cellules progénitrices engagées) puis en adipocytes matures⁶. Des études récentes sur le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) montrent que ces populations de cellules progénitrices adipeux (APC) (ASC et préadipocytes) présentent une hétérogénéité moléculaire et fonctionnelle^{substantielle 7,8,9,10,11,12}. Par exemple, les ASC affichent une capacité de différenciation adpogénique réduite, tout en présentant des capacités de prolifération et d’expansion plus élevées, par rapport aux préadipocytes⁷. D’autres différences moléculaires sont rapportées au sein des populations de NC et de préadipocytes, bien que la pertinence fonctionnelle de ces différences reste^{peu claire 7}. Ensemble, ces données mettent en évidence la complexité du pool de cellules progénitrices adipeux et soulignent la nécessité de mettre au point et de normaliser des outils pour mieux comprendre et manipuler ces populations cellulaires critiques.

Ce protocole détaille l’isolement des populations de cellules progénitrices épididymales à haute viabilité Sca1⁺ adipose provenant de tampons graisseux épididymaux de souris qui conviennent aux analyses sensibles en aval, y compris les études à cellules simples (scRNA-séquençage) et la culture cellulaire. L’isolement et la dissociation des garnitures épididymales de graisse ont été exécutés^{comme précédemment décrit 7,13} avec de légères modifications qui améliorent la viabilité des APC isolés. En bref, les cellules dissociées des adipeuses épididymales sont tachées d’anticorps contre Sca1, un marqueur pour les ASC et les préadipocytes^6,7, et d’autres marqueurs de lignée (Lin) : Ter119 (cellules érythroïdes), CD31 (cellules endothéliales) et CD45 (leucocytes). Viable Sca1⁺/Ter119^-/CD31^-/CD45^-/DAPI^{- les} cellules sont ensuite triées par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Fait important, ce protocole a été validé par l’isolement et l’analyse réussis des cellules progénitrices viables de Sca1⁺+/Lin^- adipeuses rapportées dans une étude récente de séquençage d’ARN unicellulaire qui a identifié des sous-populations fonctionnellement hétérogènes dans les ASCs et les préadipocytes^7.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales pour animaux ont été effectuées sous approbation par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de la Clinique Mayo.

1. Préparation de la solution

1. Préparer la solution collagène 2% (w/v) en dissolvant la collagène II 2 g dans la solution de sel équilibrée (HBSS) de Hanks de 100 mL. Aliquot 200 μL chacun pour chaque utilisation.
2. Préparer le milieu de neutralisation en mélangeant 84 mL de sérum de cheval F-12, 15 mL de sérum de cheval et 1 mL de pénicilline/streptomycine.
3. Préparez le tampon de cytométrie d’écoulement en dissolvant 500 mg d’albumine bovine de sérum (BSA) et 400 μL de 0,5 M EDTA dans 100 mL de saline phosphate-tamponnée de Dulbecco (DPBS).

2. Dissection de la garniture épididymale de graisse et de la dissociation de tissu

1. Euthanasier humainement (isoflurane/dislocation cervicale) une souris mâle. Dans ce protocole, une souris FVB de quatre mois a été utilisée.
2. Appliquer/pulvériser 70% d’éthanol sur l’abdomen et exposer la cavité abdominale inférieure à l’aide de ciseaux et de forceps propres.
3. Localiser la garniture épididymale de graisse (proximale/attachée aux testicules). Maintenez la jonction entre les testicules et la garniture épididymale de graisse avec des forceps émoussés et tirez doucement pour libérer le tampon épididymal de graisse.
4. Retirer les testicules en coupant à l’aide de ciseaux et incuber la garniture épididymale de graisse dans 5 mL de HBSS complété avec 3% de BSA dans un tube conique de 50 mL à température ambiante pendant 15 min.
5. Centrifugeuse à 150 x g pendant 7 min à 4 °C.
6. Prenez la garniture épididymale flottante de graisse du tube conique de 50 mL et hachez finement le tissu utilisant les ciseaux propres.
7. Ajouter 200 μL de collagène 2% solution dans 3,8 mL de HBSS dans un tube de culture de 13 mL. Ajouter le tissu haché et incuber dans un incubateur rotatif à 5 rpm pendant 1 h à 37 °C. Au lieu d’un incubateur rotatif, incubateur de culture cellulaire à 37 °C peut être alternativement utilisé avec des agitations occasionnelles.
8. Transférer le contenu entier dans un tube conique de 50 mL et ajouter 10 mL de milieu de neutralisation. Mélanger délicatement en inversant le tube 2-3 fois.
9. Préparer un autre tube conique de 50 mL équipé d’une passoire cellulaire de 70 μm. Filtrer le tissu digéré dans le nouveau tube à l’aide de la passoire cellulaire.
10. Transférer le débit dans un tube conique de 15 mL et une centrifugeuse à 350 x g pendant 10 min à 4 °C.
11. Retirez soigneusement les granulés de cellules supernatants et résuspendants avec 5 mL de DPBS. Centrifugeuse à 350 x g pendant 10 min à 4 °C.
12. Retirez soigneusement le supernatant et ajoutez 50 μL de tampon de cytométrie d’écoulement. Bien mélanger en pipetting doucement et garder les cellules sur la glace. En raison du volume des granulés cellulaires et de la petite quantité de supernatant résiduel, le volume total des cellules dans le tampon de cytométrie de flux sera supérieur à 50 μL (environ 100 μL).

3. Étiquetage des anticorps et tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)

1. Après avoir bien mélangé les cellules avec un tuyautage doux, transférer 54 μL de la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugeuse de 1,7 mL. Ajouter 6 μL de réhésif de blocage FcR et bien mélanger en pipetting doucement. Incuber à 4 °C pendant 10 min. Enregistrez les cellules qui restent après avoir pris 54 μL et gardez-les dans la glace pour les utiliser comme un contrôle non taché à l’étape 3.5 et à l’étape 3.6.
2. Pendant l’incubation à l’étape 3.1, préparer un cocktail d’anticorps en combinant 11 μL chacun d’anticorps anti-Sca1-APC, anti-Ter119-FITC, anti-CD31-FITC et anticorps anti-CD45-FITC dans un tube de microcentrifugeuse. Bien mélanger par pipetting doux et garder sur la glace à l’abri de la lumière.
3. Après incubation avec le reagent de blocage FcR pendant 10 min, ajouter 40 μL du cocktail d’anticorps et bien mélanger par pipetting doux. Incuber à 4 °C pendant 10 min.
4. Ajouter 500 μL de tampon de cytométrie d’écoulement complété par 1 μg/mL de DAPI dans les cellules tachées. Bien mélanger en utilisant un tube à essai de 5 mL avec un bouchon de pression de passoire cellulaire. Gardez les cellules sur la glace.
5. Ajouter 500 μL de tampon de cytométrie d’écoulement aux cellules restantes à l’étape 3.1 et bien mélanger par pipetting doux. Filtrer les cellules à l’aide d’un tube à essai de 5 mL avec bouchon de pression de passoire cellulaire. Gardez ces cellules sur la glace et utilisez-les comme un contrôle non taché dans l’étape suivante.
6. Prenez les cellules tachées et le contrôle non taché à l’instrument d’analyse ou de tri facs.
   1. Identifier et isoler l’APC⁺/FITC^-/DAPI^- population avec des stratégies de gating indiquées dans la figure 1. Ces cellules représentent viables Sca1⁺/Ter119^-/CD31^-/CD45^- cellules. Les débris et les agrégats cellulaires sont épuisés à l’aide de parcelles avant (FSC) et latérales de dispersion (SSC). Ensuite, DAPI^- la population est fermée, suivie d’un gating d’APC⁺/FITC^- population. Les commandes non tachées doivent être utilisées pour aider à définir les paramètres de gating.
   2. Recueillir les cellules dans 500 μL de tampon de cytométrie d’écoulement dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. À l’avenir, toutes les procédures devraient être effectuées dans des conditions stériles afin de minimiser une contamination. Environ 50 000 à 100 000 cellules sont collectées à partir d’une souris.
7. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre pour évaluer la viabilité des cellules. Étant donné que les agrégats cellulaires peuvent interférer avec d’autres analyses en aval, la présence d’agrégats cellulaires est également évaluée afin d’assurer une présence minimale (et non 5 % du nombre de cellules viables) de ces agrégats.

Résultats

Des souris FVB mâles de quatre mois ont été employées dans cette expérience. Après l’exclusion des débris et des doublets à l’aide de parcelles FSC/SSC, des cellules viables (DAPI^- population) ont été fermées, suivies de la sélection d’APC⁺/FITC^- population (figure 1). Les portes DAPI, APC et FITC ont été dessinées en fonction du contrôle non taché. Les stratégies de gating sont indiquées dans la figure 1.

Discussion

Le séquençage à ARN à cellules simples (scRNA-seq) gagne rapidement du terrain en tant qu’outil puissant pour étudier simultanément diverses populations cellulaires au niveau d’une seule cellule. En raison des coûts élevés associés à la préparation de l’échantillon et au séquençage à haut débit, il est impératif d’optimiser les intrants cellulaires (grande viabilité et pureté) afin d’augmenter les chances de succès expérimental. Certains protocoles de préparation cellulaire reposent sur l’enlèvement des cellules mortes e...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube de microcentrifugation de 1,7 mL	VWR	87003-294
Tube de culture de 13 mL Thermo	Fisher Scientific	50-809-216
Tube conique de 15 mL	Greiner Bio-one	188 271
Tube à essai de 5 mL avec filtre à cellules	Thermo Fisher Scientific	08-771-23
Tube conique de 50 mL	Greiner Bio-one	227 261
70 et micro ; Filtre à cellules m	Thermo Fisher Scientific	22-363-548
Anticorps anti-CD31-FITC	Miltenyi Biotec	130-102-519
Anticorps anti-CD45-FITC	Miltenyi Biotec	130-102-491
Anticorps anti-Sca1-APC	Miltenyi Biotec	130-102-833
Anticorps anti-Ter119-FITC	Miltenyi Biotec	130-112-908
BSA	Gold Biotechnology	A-420-500
Collagénase type II	Thermo Fisher Scientific	17101-015
DAPI	Thermo Fisher	D1306
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS)	Thermo Fisher Scientific	14190-144
F-12 medium	Thermo Fisher Scientific	11765-054
Réactif bloquant FcR	Miltenyi Biotec	130-092-575
Solution saline équilibrée de Hanks (HBSS)	Thermo Fisher Scientific	14025-092
Sérum de cheval	Thermo Fisher Scientific	16050-122
Pénicilline-streptomycine	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Solution d’iodure de propidium	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-093-233