Article de méthode

Détermination de la taille et analyse phénotypique des vésicules extracellulaires urinaires par cytométrie en flux

DOI :

10.3791/61695

23 avril 2021

Dans cet article

Résumé

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Ce protocole décrit une méthode d’isolement des vésicules extracellulaires urinaires, les uEVs, à partir de donneurs humains sains et leur caractérisation phénotypique par l’expression de la taille et du marqueur de surface à l’aide de la cytométrie en flux.

Résumé

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Les vésicules extracellulaires sont un complexe hétérogène de membranes lipidiques, sécrétées par tout type de cellule, dans n’importe quel liquide tel que l’urine. Les VE peuvent être de différentes tailles, allant de 40 à 100 nm de diamètre, comme dans les exosomes, à 100-1000 nm dans les microvésicules. Ils peuvent également contenir différentes molécules qui peuvent être utilisées comme biomarqueurs pour le pronostic et le diagnostic de nombreuses maladies. De nombreuses techniques ont été développées pour caractériser ces vésicules. L’une d’entre elles est la cytométrie en flux. Cependant, il n’existe aucun rapport montrant comment quantifier la concentration des VE et les différencier en fonction de leur taille, ainsi que de la détection de biomarqueurs. Ce travail vise à décrire une procédure d’isolement, de quantification et de phénotypification des vésicules extracellulaires urinaires, les uEVs, à l’aide d’un cytomètre conventionnel pour l’analyse sans aucune modification de sa configuration. Les limites de la méthode comprennent la coloration d’un maximum de quatre biomarqueurs différents par échantillon. La méthode est également limitée par la quantité de VE disponibles dans l’échantillon. Malgré ces limites, avec ce protocole et son analyse ultérieure, nous pouvons obtenir plus d’informations sur l’enrichissement des marqueurs EVs et l’abondance de ces vésicules présentes dans les échantillons d’urine, dans les maladies impliquant des lésions rénales et cérébrales.

Introduction

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Chez les mammifères, le sang est filtré en passant par les reins 250 à 300 fois ; Pendant ce temps, de l’urine se forme. La production de ce biofluide est le résultat d’une série de processus, notamment la filtration glomérulaire, la réabsorption tubulaire et la sécrétion. Les déchets métaboliques et les électrolytes sont les principaux composants de l’urine. De plus, d’autres sous-produits tels que les peptides, les protéines fonctionnelles et les vésicules extracellulaires (VE) sont excrétés 1,2,3,4,5,6.<....

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Protocole

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Les échantillons d’urine humaine ont été prélevés sur des volontaires en bonne santé qui avaient signé le consentement éclairé du donneur. Ces procédures ont également été approuvées par le Comité d’éthique de la recherche de l’Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán.

1. Isolement des vésicules extracellulaires urinaires

REMARQUE : Le protocole d’isolement des uEV est modifié à partir de la réf.19. La figure 1 illustre la représentation du protocole d’isolement des uEV.

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Résultats

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Il y a plusieurs points de contrôle à travers le protocole, et avant la coloration des uEV. Par conséquent, il est essentiel de vérifier d’abord la quantité de protéines présentes dans l’extrait d’uEVs. Tous les groupes de recherche qui travaillent avec des vésicules extracellulaires quantifient la protéine, comme indiqué à l’étape 2.1. La figure supplémentaire 2 montre une plaque représentative de 96 puits contenant la fraction d’uEV dans les puits 4E, 5E et 6E. Les puits 1A, 2A et 3A sont constitués de.......

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Discussion

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De nos jours, l’utilisation de vésicules extracellulaires comme biomarqueurs pour plusieurs maladies a augmenté, en particulier pour celles qui peuvent être isolées à partir de sources non invasives telles que l’urine 5,21,22,23,24. Il a été prouvé que l’isolement des uEVs est une ressource vitale pour connaître l’état d’un i.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation financière ou commerciale qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par des subventions de la CONACyT (A3-S-36875) et du programme UNAM-DGAPA-PAPIIT (IN213020 et IA202318). NH-I a été soutenu par la bourse 587790 de CONACyT.

Les auteurs tiennent à remercier Leopoldo Flores-Romo†, Vianney Ortiz-Navarrete, Antony Boucard Jr et Diana Gómez-Martin pour leurs précieux conseils pour la réalisation de ce protocole, et à tous les individus en bonne santé pour leurs échantillons d’urine.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Anticorps anti CD156c humain (ADAM10)BioLegend352706Ajouter 5 µ ; L au 20 & micro ; L de uEVs dans l’anticorps
anti-TSPAN33 humain (BAAM)APC BioLegend395406Add 5 µ ; L au 20 & micro ; L d’uEVs dans la centrifugeuse PBS
Avanti avec rotor à angle fixe JA-25.5OBeckamn CoulterJ-26S XPI
BD Accuri C6 Cytomètreen flux BD Biosciences
&beta ;-mercaptoethanolSIGMA-AldrichM3148
Centrifugeuse de paillasse avec rotor A-4-44Eppendorf5804
BLUEstain 2 échelle protéiqueGOLDBIOP008
CD9 (C-4) anticorps monoclonal de sourisSanta Cruz Biotechnologysc-13118
CD63 (MX-49.129.5) anticorps monoclonal de sourisSanta Cruz Biotechnologysc-5275
Cell Trace CFSE kit de prolifération cellulaire pour cytométrie en fluxThermo ScientificC34554
Système Chemidoc XRS+BIORAD5837
FITC anti anticorps CD9 humainBioLegend312104Ajouter 5 & micro ; L au 20 & micro ; L de uEVs dans l’anticorps
anti-CD37 humainPBS FITC BioLegend356304Add 5 µ ; L au 20 & micro ; L d’uEVs dans PBS
Particules jaunes fluorescentesSpherotechFP-0252-2
Particules jaunes fluorescentesSpherotechFP-0552-2
Particules jaunes fluorescentesSpherotechFP-1552-2
FlowJo SoftwareBecton, Dickinson and Company
Immunoglobulines anti-souris chèvres/HRPDakoP0447
Halt cocktail inhibiteur de protéaseThermo Scientific78429
Immun-Blot membrane PVDF 0.22µ ; mBIORAD1620177
Perles SF MEGAMIX-PlusCOSMO BIO CO. LTD7802
Tampon d’échantillon NuPAGE LDS 4XThermo ScientificNP0007
Ultracentrifugeuse Optima avec rotor 90Ti à angle fixe 355530Beckamn CoulterXPN100
Page Solution de coloration des protéines bleuesThermo Scientific24620
PE anticorps CD53 humainBioLegend325406Ajouter 5 µ ; L au 20 & micro ; L d’uEVs dans PBS
Pierce BCA Kit de dosage des protéinesThermo Scientific23227
Tampon Pierce RIPAThermo Scientific89900
Tubes à centrifuger en polycarbonate à paroi épaisseBeckamn Coulter355630
Perles de validation Spherotech 8-Peak (FL1-FL3)BD Accuri653144
Perles de validation Spherotech 6-Peak (FL4)BD Accuri653145
SaccharoseSIGMA-Aldrich59378
TriéthanolamineSIGMA-Aldrich90279
PBS

Références

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  1. Decramer, S., et al. Urine in clinical proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 7 (10), 1850-1862 (2008).
  2. Nawaz, M., et al. The emerging role of extracellular vesicles as biomarkers for urogenital cancers. Nature Reviews Urology. 11

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Mots-clés

Urinary Extracellular VesiclesFlow CytometryEV Size DeterminationPhenotypic AnalysisEV IsolationBiomarker DetectionEV QuantificationConventional CytometerKidney DiseaseBrain Damage
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