Détermination de la taille et analyse phénotypique des vésicules extracellulaires urinaires par cytométrie en flux

Résumé

Ce protocole décrit une méthode d’isolement des vésicules extracellulaires urinaires, les uEVs, à partir de donneurs humains sains et leur caractérisation phénotypique par l’expression de la taille et du marqueur de surface à l’aide de la cytométrie en flux.

Résumé

Les vésicules extracellulaires sont un complexe hétérogène de membranes lipidiques, sécrétées par tout type de cellule, dans n’importe quel liquide tel que l’urine. Les VE peuvent être de différentes tailles, allant de 40 à 100 nm de diamètre, comme dans les exosomes, à 100-1000 nm dans les microvésicules. Ils peuvent également contenir différentes molécules qui peuvent être utilisées comme biomarqueurs pour le pronostic et le diagnostic de nombreuses maladies. De nombreuses techniques ont été développées pour caractériser ces vésicules. L’une d’entre elles est la cytométrie en flux. Cependant, il n’existe aucun rapport montrant comment quantifier la concentration des VE et les différencier en fonction de leur taille, ainsi que de la détection de biomarqueurs. Ce travail vise à décrire une procédure d’isolement, de quantification et de phénotypification des vésicules extracellulaires urinaires, les uEVs, à l’aide d’un cytomètre conventionnel pour l’analyse sans aucune modification de sa configuration. Les limites de la méthode comprennent la coloration d’un maximum de quatre biomarqueurs différents par échantillon. La méthode est également limitée par la quantité de VE disponibles dans l’échantillon. Malgré ces limites, avec ce protocole et son analyse ultérieure, nous pouvons obtenir plus d’informations sur l’enrichissement des marqueurs EVs et l’abondance de ces vésicules présentes dans les échantillons d’urine, dans les maladies impliquant des lésions rénales et cérébrales.

Introduction

Chez les mammifères, le sang est filtré en passant par les reins 250 à 300 fois ; Pendant ce temps, de l’urine se forme. La production de ce biofluide est le résultat d’une série de processus, notamment la filtration glomérulaire, la réabsorption tubulaire et la sécrétion. Les déchets métaboliques et les électrolytes sont les principaux composants de l’urine. De plus, d’autres sous-produits tels que les peptides, les protéines fonctionnelles et les vésicules extracellulaires (VE) sont excrétés 1,2,3,4,5,6.<....

Protocole

Les échantillons d’urine humaine ont été prélevés sur des volontaires en bonne santé qui avaient signé le consentement éclairé du donneur. Ces procédures ont également été approuvées par le Comité d’éthique de la recherche de l’Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán.

1. Isolement des vésicules extracellulaires urinaires

REMARQUE : Le protocole d’isolement des uEV est modifié à partir de la ^réf.19. La figure 1 illustre la représentation du protocole d’isolement des uEV.

Résultats

Il y a plusieurs points de contrôle à travers le protocole, et avant la coloration des uEV. Par conséquent, il est essentiel de vérifier d’abord la quantité de protéines présentes dans l’extrait d’uEVs. Tous les groupes de recherche qui travaillent avec des vésicules extracellulaires quantifient la protéine, comme indiqué à l’étape 2.1. La figure supplémentaire 2 montre une plaque représentative de 96 puits contenant la fraction d’uEV dans les puits 4E, 5E et 6E. Les puits 1A, 2A et 3A sont constitués de.......

Discussion

De nos jours, l’utilisation de vésicules extracellulaires comme biomarqueurs pour plusieurs maladies a augmenté, en particulier pour celles qui peuvent être isolées à partir de sources non invasives telles que l’urine 5,21,22,23,24. Il a été prouvé que l’isolement des uEVs est une ressource vitale pour connaître l’état d’un i.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anticorps anti CD156c humain (ADAM10)	BioLegend	352706	Ajouter 5 µ ; L au 20 & micro ; L de uEVs dans l’anticorps
anti-TSPAN33 humain (BAAM)	APC BioLegend	395406	Add 5 µ ; L au 20 & micro ; L d’uEVs dans la centrifugeuse PBS
Avanti avec rotor à angle fixe JA-25.5O	Beckamn Coulter	J-26S XPI
BD Accuri C6 Cytomètre	en flux BD Biosciences
&beta ;-mercaptoethanol	SIGMA-Aldrich	M3148
Centrifugeuse de paillasse avec rotor A-4-44	Eppendorf	5804
BLUEstain 2 échelle protéique	GOLDBIO	P008
CD9 (C-4) anticorps monoclonal de souris	Santa Cruz Biotechnology	sc-13118
CD63 (MX-49.129.5) anticorps monoclonal de souris	Santa Cruz Biotechnology	sc-5275
Cell Trace CFSE kit de prolifération cellulaire pour cytométrie en flux	Thermo Scientific	C34554
Système Chemidoc XRS+	BIORAD	5837
FITC anti anticorps CD9 humain	BioLegend	312104	Ajouter 5 & micro ; L au 20 & micro ; L de uEVs dans l’anticorps
anti-CD37 humain	PBS FITC BioLegend	356304	Add 5 µ ; L au 20 & micro ; L d’uEVs dans PBS
Particules jaunes fluorescentes	Spherotech	FP-0252-2
Particules jaunes fluorescentes	Spherotech	FP-0552-2
Particules jaunes fluorescentes	Spherotech	FP-1552-2
FlowJo Software	Becton, Dickinson and Company
Immunoglobulines anti-souris chèvres/HRP	Dako	P0447
Halt cocktail inhibiteur de protéase	Thermo Scientific	78429
Immun-Blot membrane PVDF 0.22µ ; m	BIORAD	1620177
Perles SF MEGAMIX-Plus	COSMO BIO CO. LTD	7802
Tampon d’échantillon NuPAGE LDS 4X	Thermo Scientific	NP0007
Ultracentrifugeuse Optima avec rotor 90Ti à angle fixe 355530	Beckamn Coulter	XPN100
Page Solution de coloration des protéines bleues	Thermo Scientific	24620
PE anticorps CD53 humain	BioLegend	325406	Ajouter 5 µ ; L au 20 & micro ; L d’uEVs dans PBS
Pierce BCA Kit de dosage des protéines	Thermo Scientific	23227
Tampon Pierce RIPA	Thermo Scientific	89900
Tubes à centrifuger en polycarbonate à paroi épaisse	Beckamn Coulter	355630
Perles de validation Spherotech 8-Peak (FL1-FL3)	BD Accuri	653144
Perles de validation Spherotech 6-Peak (FL4)	BD Accuri	653145
Saccharose	SIGMA-Aldrich	59378
Triéthanolamine	SIGMA-Aldrich	90279