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Article de méthode

Préparation de coupes cérébrales aiguës du pôle dorsal de l’hippocampe chez des rongeurs adultes

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DOI :

10.3791/61699

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10 septembre 2020

1Simons Initiative for the Developing Brain, Centre for Discovery Brain Sciences, The University of Edinburgh

Dans cet article

Résumé

Le but de ce protocole est de décrire une méthode permettant de produire des tranches de l’hippocampe dorsal pour un examen électrophysiologique. Cette procédure utilise la perfusion avec de l’ACSF réfrigéré avant la préparation de la tranche avec un angle de tranchage proche de la coronale qui permet de préserver les neurones principaux sains.

Résumé

Les enregistrements de cellules entières à partir de tranches de cerveau de rongeurs aigus sont un pilier de la recherche neurophysiologique moderne, permettant une mesure précise des propriétés cellulaires et synaptiques. Néanmoins, il est de plus en plus nécessaire d’effectuer des analyses corrélées entre différents modes expérimentaux en plus de l’électrophysiologie en tranches, par exemple : immunohistochimie, biologie moléculaire, imagerie in vivo ou enregistrement électrophysiologique ; pour répondre à des questions de plus en plus complexes sur le fonctionnement du cerveau. Cependant, il n’est pas simple de tirer des conclusions significatives de ces diverses approches expérimentales, car même au sein de structures cérébrales relativement bien décrites, il existe un degré élevé de variation sous-régionale de la fonction cellulaire. Cela n’est nulle part mieux illustré que dans le CA1 de l’hippocampe, qui a des propriétés dorso-ventrales bien définies, basées sur des propriétés cellulaires et moléculaires. Néanmoins, de nombreuses études publiées examinent les modèles d’expression des protéines ou l’activité in vivo corrélée au comportement dans l’étendue dorsale de l’hippocampe ; et expliquer les résultats de manière mécanique avec l’électrophysiologie cellulaire de la région ventro-médiale. Ceci est encore plus compliqué par le fait que de nombreuses expériences électrophysiologiques en tranches aiguës sont effectuées sur des animaux juvéniles, alors que d’autres modes expérimentaux sont réalisés sur des animaux plus matures. Pour résoudre ces problèmes, cette méthode intègre la perfusion transcardique de rongeurs matures (rongeurs matures âgés de >60 jours) avec du liquide céphalo-rachidien artificiel, suivie de la préparation de coupes coronales modifiées, y compris le pôle septal de l’hippocampe dorsal pour enregistrer à partir de cellules pyramidales CA1. Ce processus conduit à la génération de tranches aiguës saines de l’hippocampe dorsal, permettant une interrogation électrophysiologique cellulaire basée sur des tranches et associée à d’autres mesures.

Introduction

L’hippocampe est sans doute la structure la mieux étudiée du cerveau des mammifères, en raison de sa taille relativement grande et de sa structure laminaire proéminente. L’hippocampe a été impliqué dans un certain nombre de processus comportementaux : navigation spatiale, mémoire contextuelle et formation d’épisodes. Cela est dû en partie à la facilité relative d’accès aux parties dorsales de l’hippocampe chez les rongeurs pour l’analyse in vivo . En effet, les principales cellules de sortie sont généralement à moins de 2 mm de la surface piale.

Chez les rongeurs, l’hippocampe est une structure relativement grande, formée d’une invagination du télencéphale s’étendant de la cloison dorsale au néocortex ventral. Il est composé de 2 grandes régions : le gyrus denté et le cornu ammonis (CA) ; ce dernier est divisé en 3 sous-régions bien décrites (CA1-3) qui s’étendent dans le gyrus hilus denté (anciennement connu sous le nom de CA4), sur la base de la connectivité, de l’anatomie cellulaire et des propriétés génétiques1. Cette structure est maintenue le long de l’étendue dorso-ventrale de l’hippocampe, bien qu’avec des variations majeures dans les propriétés synaptiques 2,3,4, l’anatomie5, la diversité génétique 6,7,8 et la fonction comportementale 9,10. Parmi les régions CA, le sous-domaine CA1 est composé en grande partie de cellules pyramidales glutamatergiques CA1 (PC CA1), pour lesquelles 3 sous-types ont été définis11, et d’interneurones inhibiteurs qui représentent ~10 % des neurones, mais sont très diversifiés avec plus de 30 sous-types définis 12,13,14. En plus des différences spécifiques régionales, il a été démontré que le vieillissement normal a des effets spectaculaires sur la transmission synaptique 15,16,17, l’anatomie18 et le profil génétique19. La méthode de référence actuelle pour évaluer les subtilités des propriétés cellulaires et synaptiques de manière contrôlée consiste à utiliser des enregistrements patch-clamp de cellules entières à partir de tranches cérébrales aiguës20.

La compréhension de la fonction hippocampique repose en grande partie sur la manipulation dorsale en raison de la facilité avec laquelle elle est accessible chirurgicalement ou anatomiquement pour des tâches comportementales, l’implantation d’électrodes ou de fenêtres d’imagerie, ou l’expression de plasmides viraux. De plus, dans de nombreuses études, ces procédures sont effectuées avec des rongeurs juvéniles ou adultes tardifs pour prévenir la variabilité de la structure du cerveau au cours du développement. Malgré cela, de nombreuses approches pour examiner l’électrophysiologie cellulaire et subcellulaire sont effectuées chez les rongeurs juvéniles précoces à moyens, principalement à partir de la partie ventro-médiale de l’hippocampe dans son plan transversal 21,22,23,24,25. Lorsque toute l’étendue dorso-ventrale a été évaluée, un hachoir à tissus est utilisé pour maintenir l’étendue transversale 4,26, ou l’expérience a été réalisée chez de jeunes rats27 ou souris28. De plus, le refroidissement des tissus avant la dissection du cerveau est connu pour préserver la structure de l’hippocampe chez le rat29 et les neurones néocorticaux chez la souris30,31. Néanmoins, il y a peu de détails concernant la production de coupes de cerveau à partir de l’axe transversal dorsal de l’hippocampe, telles que générées par des tranches coronales modifiées, chez les rats matures.

Ce protocole décrit une approche par laquelle des enregistrements de cellules entières peuvent être obtenus à partir d’un seul ou de paires de neurones dans des tranches coronales modifiées de l’hippocampe dorsal de rats âgés, suivis d’une identification morphologique post-hoc. Des coupes de cerveau sain sont obtenues après perfusion transcardique de liquide céphalo-rachidien artificiel réfrigéré (ACSF), facilitant la mesure des propriétés électrophysiologiques à partir de PC CA1 et d’interneurones locaux.

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Protocole

Tous les animaux ont été générés et entretenus conformément aux directives du Home Office and Institutional (HO# P135148E). Tous les rats ont été maintenus sur un cycle lumière/obscurité de 12 heures et ont eu un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau.

1. Perfusion transcardique d’ACSF réfrigéré

  1. Avant toutes les expériences, placer ~200 mL de saccharose-ACSF (tableau 1) dans le congélateur à -20 °C (jusqu’à ce qu’il soit semi-congelé, pour le tranchage) et ~100-200 mL supplémentaires de saccharose-ACSF filtré sur de la glace (pour la perfusion), en bouillonnant avec du carbogène (95 % O2/5 % CO2).
  2. Prélevez un rat adulte de sa cage d’origine et placez-le pendant ~30 minutes dans une cage de détention dans la salle d’intervention pour l’acclimater aux niveaux de bruit et de lumière.
  3. Préparez les outils de dissection (figure 1A), la zone de perfusion et l’anesthésique injectable (environ 1 mL de pentobarbital sodique à 200 mg/mL pour une concentration finale de 100 mg/kg).
  4. Préparez une chambre d’anesthésie appropriée en plaçant à l’intérieur un petit coton-tige de papier de soie ou de coton. Introduire 1 à 2 mL d’anesthésique isoflurane volatil dans le matériau absorbant de la chambre.
  5. Placez le rat dans une chambre d’anesthésie pour le mettre sous sédatif. Surveillez la respiration jusqu’à ce que la fréquence respiratoire tombe à ~1 respiration superficielle par seconde.
  6. À ce stade, commencez à faire bouillonner du saccharose-ACSF semi-congelé avec du carbogène sur de la glace pour l’utiliser lors du tranchage.
  7. Pesez le rat et notez son poids.
  8. Anesthésier le rat en phase terminale en injectant le pentobarbital sodique préparé dans la cavité intrapéritonéale. La dose de pentobarbital sodique doit être de 100 mg/kg, calculée à partir du poids précédemment pris et de la concentration d’origine du médicament. Placez le rat dans une chambre de rétention et attendez 0,5 à 5 minutes pour le début de l’anesthésie terminale.
  9. Confirmez l’arrêt des réflexes : testez à la fois le clignement cornéen (toucher la pupille) et le pincement de la patte arrière (lever la patte et pincer la patte arrière) à l’aide d’une sonde émoussée (c’est-à-dire une pince arrondie). Une fois que les réflexes ont cessé, épinglez le rat à la planche chirurgicale en polystyrène ou en liège à l’aide d’aiguilles hypodermiques.
  10. Ouvrez la cavité thoracique et placez la canule à la base du ventricule gauche du cœur. Percer l’oreillette droite et commencer immédiatement la perfusion avec le saccharose-ACSF glacé (0-1 °C) (à l’aide d’une pompe péristaltique à 50 mL/minute).
  11. Une fois que l’échange complet de fluides et le refroidissement du corps ont eu lieu (<5 minutes), retirez la canule et les épingles, puis décapitez à l’aide d’une guillotine.
  12. Retirez soigneusement et rapidement le crâne à l’aide de ciseaux à os et d’outils en os Rongeur (Figure 1A, 1B).
    1. Commencez par faire 2 incisions bilatérales à travers le foramen magnum à l’aide des ciseaux à os et retirez le crâne jusqu’à la suture lambda avec les Rongeurs. Coupez soigneusement le long de la suture médiane avec les ciseaux à os jusqu’à juste derrière les yeux.
    2. Faites 2 coupes bilatérales à travers le crâne, perpendiculairement à la ligne médiane. À l’aide des Rongeurs, ouvrez le crâne le long de la ligne médiane. Prenez des précautions supplémentaires pour enlever la pie-mère à l’aide de ciseaux fins ou d’une aiguille crochue.
  13. Retirez le cerveau du crâne à l’aide d’une spatule émoussée, en sectionnant les nerfs crânien et optique avec une compression latérale à côté. Placez le cerveau dans du saccharose-ACSF carbogéné, semi-congelé (0 à 1 °C) pendant 1 à 2 minutes avant de le trancher.

2. Préparation de tranches de cerveau de l’hippocampe dorsal

  1. Retirez le cerveau perfusé du saccharose-ACSF semi-congelé (0-1 °C) et placez-le dans une boîte de Pétri en verre recouverte de papier filtre. Placez le cerveau sur sa surface ventrale.
  2. À l’aide d’un scalpel (lame n° 22), retirez la partie postérieure du cerveau à ~10° de la verticale pour créer une surface plane pour coller le cerveau à la scène (Figure 1C).
  3. Appliquez une petite quantité de colle cyanoacrylate sur l’étage du vibratome. Étalez la colle pour former une fine pellicule d’environ 50 % plus grande que la section transversale de la surface coupée du cerveau.
  4. Soulevez le cerveau hors du plat en verre sur une spatule, côté coupé vers le bas, à l’aide d’un pinceau pour guider le tissu. Épongez le cerveau avec un morceau de tissu pour enlever l’excès d’ACSF et faites glisser le cerveau, surface coupée vers le bas, au centre de la colle. À l’aide d’une pipette Pasteur, ajoutez 1 à 2 ml de saccharose-ACSF glacé sur le cerveau pour enlever la colle loin du bloc cérébral.
  5. Placez le cerveau dans la chambre de tranchage et inondez-le de saccharose semi-congelé ACSF. À l’aide d’une cuillère ou d’une spatule, éloignez l’excès de glace du bloc cérébral, puis du carbogénate (figure 1D).
  6. Déplacez la lame du vibratome en position : ~1 mm de la surface dorsale du cerveau et verticalement ~1 mm en avant du bregma. Assurez-vous que la lame est complètement immergée et éliminez les bulles à l’aide d’un pinceau.
  7. Commencez à trancher le cerveau. Pour réduire jusqu’à l’hippocampe dorsal, utilisez une vitesse de 0,1 à 0,2 mm/s, avec un mouvement horizontal de la lame de 1 à 1,5 mm et une fréquence d’oscillation réciproque de ~90 Hz. Lorsque vous coupez l’hippocampe dorsal, réduisez la vitesse à 0,05-0,1 mm/s.
  8. Prélever des tranches d’hippocampe dorsal (nominalement 3-4 tranches complètes ou 6-8 tranches hémiquées) par cerveau. Si des tranches longitudinales de l’hippocampe ventro-médial sont nécessaires, continuez le tranchage. Une fois que l’hippocampe dorsal a été tranché, il n’est pas nécessaire de couper du tissu supplémentaire au-delà de la position approximative du 3e ventricule. Arrêtez le vibratome, séparez la tranche à l’aide d’une aiguille hypodermique pliée et recueillez-la à la base de la chambre de tranchage.
    REMARQUE : Les tranches peuvent avoir une épaisseur de 250 à 500 μm, selon les exigences expérimentales. Pour les enregistrements de l’hippocampe dorsal, utilisez généralement des coupes de 400 μm d’épaisseur pour préserver autant que possible le réseau local, tout en permettant les conditions de microscopie appropriées.
  9. Coupez les tranches pour qu’elles ne contiennent que l’hippocampe et le cortex sus-jacent à l’aide d’un microscope à dissection. Transférez les tranches dans la chambre préchauffée à 35 °C, la surface antérieure vers le haut.
  10. Déterminez la chambre de stockage en fonction de l’expérience à réaliser. Pour obtenir des enregistrements de terrain extracellulaires ou par patch-clamp de cellules entières de haute qualité près de la surface de la tranche dans les chambres d’enregistrement immergées, stockez-les dans des chambres immergées. Vous pouvez également stocker dans une chambre d’interface liquide/gaz pour les enregistrements de l’activité du réseau oscillatoire ou des enregistrements de champ extracellulaire d’interface.
  11. Pour les conditions de stockage immergées, laissez les tranches récupérer à 35 ºC pendant 30 minutes à partir du moment où la dernière tranche entre dans la chambre de stockage. Cela permet de réactiver les processus métaboliques et de refermer les neurites coupées. Après 30 minutes, transférez la chambre de stockage à température ambiante.

3. Enregistrement des neurones dorsaux de l’hippocampe

  1. Fabriquer des pipettes d’enregistrement en verre capillaire. Ce protocole utilise du verre borosilicaté de 1,5 mm de diamètre extérieur et de 0,86 mm de diamètre intérieur avec filament, ce qui donne une résistance de pointe de 3 à 5 MΩ lorsqu’il est rempli d’une solution intracellulaire (Tableau 1). Conserver les solutions intracellulaires réfrigérées sur de la glace pour éviter la dégradation des composants énergétiques et filtrées avant utilisation (filtre à seringue, taille des pores : 0,2 μm).
  2. Enregistrement au carbbogénate ACSF et préchauffage au bain-marie (35-40 ºC). Administrer l’ACSF carbogéné et préchauffé à la chambre d’enregistrement via une tubulure de perfusion assistée d’une pompe péristaltique. Commencez la perfusion plusieurs minutes avant de transférer une tranche dans la chambre.
  3. Arrêtez la perfusion et transférez une tranche de cerveau dans la chambre d’enregistrement avec la surface antérieure vers le haut. Maintenez la tranche en place avec un anneau en platine avec des fibres simples de soie attachées pour former une forme de « harpe ». Positionnez les tranches de manière à ce que la couche pyramidale de CA1 soit perpendiculaire à l’axe de la première pipette d’enregistrement.
  4. Redémarrer le flux d’ACSF carbogéné et préchauffé (35-40 ºC) en enregistrant (Tableau 1) à un débit optimal de 6-8 mL∙min-1.
    REMARQUE : Des débits élevés (6-8 mL∙min-1) sont optimaux pour maintenir l’activité du réseau en tranches32. Des débits plus faibles (c’est-à-dire 2-3 mL∙min-1) peuvent être utilisés pour maintenir la stabilité de la tranche pour les expériences d’imagerie ou lorsque l’activité du réseau biologiquement pertinente n’est pas requise.
  5. Évaluez la qualité de la coupe à l’aide d’une optique infrarouge à contraste d’inférence différentielle (IR-DIC) avec un grossissement d’objectif de 40x (visualisée avec une caméra CCD). On suppose que la coupe est de bonne qualité si un grand nombre de CA1 PC de forme ovoïde et modérément contrastés peuvent être observés dans la pyramidale à des profondeurs de 20 à 30 μm sous une surface lisse et légèrement alvéolée (figure 2A). Les tranches de mauvaise qualité contiennent un grand nombre de cellules très contrastées, rétrécies ou gonflées, avec une surface de coupe inégale.
  6. Remplir les pipettes patch avec une solution intracellulaire (p. ex., basée sur un [Cl-] intracellulaire de 24 mM) pour permettre la comparaison avec d’autres données publiées.
  7. Effectuez des enregistrements patch-clamp de cellules entières comme décrit précédemment22. Exclure les cellules de l’analyse si le potentiel de membrane (VM) à la rupture est plus dépolarisé que -50 mV, la résistance série est de >30 MΩ ; ou la résistance en série change de >20 % au cours de l’enregistrement. Dans ces conditions d’enregistrement, la résistance série est généralement comprise entre 8 et 25 MΩ et stable jusqu’à 1 heure.
  8. Pour examiner l’excitabilité intrinsèque de CA1 de l’hippocampe dorsal, testez les propriétés physiologiques intrinsèques avec des enregistrements de cellules entières avec les protocoles suivants en configuration de pince de courant :
    1. À partir du potentiel de membrane au repos sans courant de polarisation appliqué, appliquez de petits pas de courant (-10 pA, 500 ms) répétés 30 fois.
    2. À partir de -70 mV avec courant de polarisation appliqué, appliquez des paliers de courant hyper à dépolarisant d’une durée de 500 ms (-100 à +400 pA, pas de 25 pA) avec 3 répétitions d’une famille de traces.
    3. Appliquez une onde sinusoïdale d’amplitude crête à crête de 100 pA, avec une fréquence variable de 0,1 à 20 Hz. Répétez l’opération 3 fois.
    4. Appliquez 5 stimuli de 2 nA, 2 ms pour piloter des potentiels d’action à 20, 40, 60, 80, 100 Hz. 10 balayages par fréquence.
    5. À partir d’une pince de tension de -70 mV, appliquez 5 minutes de courants postsynaptiques excitateurs spontanés (EPSC) pour l’enregistrement.
  9. Pour refermer les cellules pour l’analyse histologique après un enregistrement réussi, produisez des patchs vers l’extérieur en rétractant lentement la pipette patch. Lorsqu’une augmentation de la résistance en série est observée à partir des niveaux expérimentaux à >1 GΩ mesurée par une impulsion d’essai de -5 mV, augmentez le potentiel de maintien à -40 mV et rétractez complètement la pipette.
  10. Effectuez des enregistrements supplémentaires dans la même tranche pour satisfaire la puissance statistique requise du plan d’expérience.
  11. Retirez de la chambre d’enregistrement les tranches de cerveau contenant des neurones enregistrés, placez-les dans une plaque à 24 puits, remplacez l’ACSF par du paraformaldéhyde à 4 % (dans un tampon de phosphate à 0,1 M) et laissez reposer toute la nuit.
  12. Le lendemain, remplacer le PFA par un tampon phosphate de 0,1 M et le stocker jusqu’au traitement histologique. Visualisez des cellules avec de la streptavidine conjuguée par fluorescence comme décrit précédemment22.

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Résultats

Le protocole décrit ci-dessus permet de préparer des tranches viables à partir du pôle septal de l’hippocampe dorsal chez les rats matures. Un facteur clé de ce protocole est la perfusion de saccharose-ACSF réfrigéré, avant la préparation de la tranche, ce qui permet d’obtenir des PC CA1 sains à proximité de la surface de la tranche. La qualité de la tranche produite est évaluée visuellement sous optique IR-DIC, et les cellules saines identifiées comme ayant de grands corps cellulaires de forme ovoïde sont situées dans t...

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Discussion

Ici, un protocole est décrit pour produire des coupes cérébrales de haute qualité à partir de l’extension dorsale du CA1 de l’hippocampe, permettant des enregistrements de plusieurs neurones viables dans cette région. L’approche combinatoire de l’enregistrement de cellules entières à partir de coupes quasi-coronales suivie d’une visualisation des neurones est essentielle à la confirmation de la viabilité et de l’identité cellulaires.

Ce protocole produit de ma...

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Déclarations de divulgation

L’auteur déclare qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

L’auteur tient à remercier le professeur David JA Wyllie, le Dr Emma Perkins, Laura Simoes de Oliveira et le professeur Peter C Kind pour leurs commentaires utiles sur l’optimisation du manuscrit et du protocole, ainsi que l’Initiative Simons pour le développement du cerveau pour les frais de publication.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Logiciel d’acquisitionMolecular DevicespClamp 10
Rats adultesDiversn/aToute souche de rat adulte (60 jours et plus)
AmplificateurMolecular DevicesAxopatch 700B
Logiciel d’analyseFreewareStimfithttps://github.com/neurodroid/stimfit
Ciseaux à osFST16152-12Le style Littauer
Verre capillaireHarvard Apparatus30-0060Pipettes en verre borosilicaté avec filament de 1,5 mm de diamètre extérieur, 0,86 mm de diamètre intérieur.
CarbogenBOCDivers95 % O2/5 % CO2
CCDcaméra ScientificaSciCamProhttps://www.scientifica.uk.com/products/
Chemicals/ReagentsSigma AldrichDiversTous les réactifs de laboratoire achetés auprès de Sigma Aldrich.
Cyanoacrylate (c’est-à-dire RS Pro 3)Composants RS918-6872Eviter les formulations de cyanoacrylate à base de gel
NumériseurDispositifs moléculairesDigidata 1550B
Dissection broches/aiguillesDiversUtilisation Aiguillescalibre 16 (ci-dessus)
Système d’électrophysiologieScientificaSliceScopehttps://www.scientifica.uk.com/products/ scientifica-slicescope
Ciseaux à iris finsFST14568-12Avec pointes en carbure de tungstène
Boîte de Pétri en verreFisher Scientific12911408
Aiguilles hypodermiquesBD HealthcareDiverscalibres 16, 18 et 22
Isofluorane 100 % W/W (c’est-à-dire IsoFlo)
Mayo ZoetisFST14110-17
Micromanipulateurs à pointes émousséesScientificaMicrostarhttps://www.scientifica.uk.com/products/scientifica-microstar-micromanipulator
PaintbrushArt storen/aUn pinceau à poils fins, acheté dans un magasin d’art local.
Pipette PasteurFisher Scientific11546963Une pipette Pasteur en verre, mais coupée de manière à ce que l’extrémité émoussée soit utilisée pour la pipette de transfert.
Pompe péristaltiqueWatson Marlow12466260Pompe péristaltique monocanal
Extracteur de pipettesSutter InstrumentsP-97D’autres modèles et méthodes de production de pipettes fonctionneraient tout aussi bien.
Seringues en plastique (1, 2, 5 mL)BD HealthcareDivers
Outil en os de RongeurFST16021-14
Chambre de maintiendes tranches Fait maison
Poids de tranche/harpeHarvard AppareilSHD-22L/15Des alternatives conviendraient.
Pentobarbital sodique (c’est-à-dire Pentoject)Animalcare Ltd10347/4014200 mg/mL ; d’autres formulations de pentobarbital conviendraient
SpatuleBochem3213Disponible auprès de Fisher Scientific
Filtres à seringueFisher Scientific10482012Filtres à seringue de marque Corning, 0,22 & micro ; m diamètre des pores.
VibtratomeLeica1491200S001modèle VT1200S avec bain-marie Vibrocheck
Fisher Scientific15167015bain-marie de 5 litres, par exemple : Grant Instruments&trade ; JBA5 scientifica-scicam-pro
de Ciseaux de type 50019100

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