Imagerie en direct simultanée d’embryons d’insectes multiples dans des microscopes à fluorescence à feuille de lumière à base de chambre d’échantillonnage

Summary

La microscopie à fluorescence à base de feuilles de lumière est l’outil le plus précieux en biologie du développement. Un problème majeur dans les études comparatives est la variance ambiante. Notre protocole décrit un cadre expérimental pour l’imagerie en direct simultanée de plusieurs spécimens et, par conséquent, aborde cette question de manière proactive.

Abstract

La microscopie à fluorescence à base de feuilles de lumière offre des solutions efficaces pour étudier des processus complexes à plusieurs échelles biologiquement pertinentes. Les configurations basées sur la chambre d’échantillonnage, qui sont spécialement conçues pour préserver l’intégrité tridimensionnelle de l’échantillon et comportent généralement une rotation de l’échantillon, sont le meilleur choix en biologie du développement. Par exemple, ils ont été utilisés pour documenter toute la morphogenèse embryonnaire de la mouche des fruits Drosophila melanogaster et du coléoptère rouge de la farine Tribolium castaneum. Cependant, de nombreux protocoles d’imagerie en direct disponibles ne fournissent que des cadres expérimentaux pour des embryons uniques. En particulier pour les études comparatives, de telles approches sont peu pratiques, car les spécimens estégés séquentiellement sont affectés par la variance ambiante. De plus, cela limite le nombre d’échantillons qui peuvent être analysés dans un délai donné. Nous fournissons un cadre expérimental pour l’imagerie simultanée en direct qui augmente le débit dans les configurations basées sur la chambre d’échantillonnage et garantit ainsi des conditions ambiantes similaires pour tous les échantillons. Tout d’abord, nous fournissons une directive d’étalonnage pour les microscopes à fluorescence à feuille de lumière. Deuxièmement, nous proposons une méthode de montage pour les embryons multiples qui soit compatible avec la rotation des échantillons. Troisièmement, nous fournissons des ensembles de données d’imagerie en direct tridimensionnelles exemplaires de Drosophila, pour lesquels nous juxtaposons trois lignées transgéniques avec des noyaux marqués par fluorescence, ainsi que de Tribolium, pour lequel nous comparons les performances de trois sous-lignées transgéniques qui portent le même transgène, mais à des emplacements génomiques différents. Notre protocole est spécialement conçu pour les études comparatives car il traite de manière proactive la variance ambiante, qui est toujours présente dans l’imagerie séquentielle en direct. Ceci est particulièrement important pour les analyses quantitatives et la caractérisation des phénotypes aberrationnels, qui résultent par exemple d’expériences knock-out. De plus, il augmente le débit global, ce qui est très pratique lorsque l’accès aux microscopes à fluorescence à feuille de lumière est limité. Enfin, la méthode de montage proposée peut être adaptée à d’autres espèces d’insectes et à d’autres organismes modèles, par exemple le poisson zèbre, sans aucun effort d’optimisation.

Introduction

La microscopie à fluorescence est l’une des techniques d’imagerie les plus essentielles dans les sciences de la vie, en particulier en biologie cellulaire et du développement. Dans les microscopes à fluorescence confocale¹, qui sont à la pointe de la technologie pour l’imagerie par fluorescence tridimensionnelle depuis le milieu des années 1990, la même lentille est utilisée pour l’excitation des fluorophores et la détection de la lumière d’émission. Le faisceau laser d’éclairage excite tous les fluorophores le long de l’axe d’éclairage/détection et le signal de mise au point respectif est discriminé avant la détection par un trou d’épingle. Par conséquent, pour chaque image bidimensionnelle, l’ensemble du spécimen est illuminé. Par conséquent, pour chaque image tridimensionnelle, c’est-à-dire un empilement d’images bidimensionnelles spatialement consécutives, l’ensemble du spécimen est illuminé plusieurs dizaines à quelques centaines de fois^2,ce qui favorise le photobleaching et la phototoxicité^3.

Il y a près de vingt ans, la technologie à base de feuilles lumineuses⁴ est apparue comme une alternative prometteuse pour l’imagerie par fluorescence tridimensionnelle et est ainsi devenue un outil précieux en biologie du développement⁵. Dans cette approche, l’éclairage et la détection sont découplés. La lentille d’éclairage est utilisée pour générer une feuille de lumière d’une profondeur de seulement quelques micromètres dans le plan focal de la lentille de détection disposée perpendiculairement. Par conséquent, pour chaque image bidimensionnelle, seul un mince volume planaire autour du plan focal est éclairé. Par conséquent, pour chaque image tridimensionnelle, l’échantillon entier n’est éclairé qu’une seule fois, ce qui diminue fortement le photobleaching et la phototoxicité⁶. Pour cette raison, les microscopes à fluorescence à feuille de lumière (LSFM) offrent des solutions efficaces pour étudier des processus complexes à de multiples échelles biologiquement pertinentes et sont, par conséquent, d’une valeur particulière en biologie du développement, où des échantillons aussi grands que plusieurs millimètres doivent être analysés au niveau subcellulaire.

Historiquement, les LSFM ont été échantillonnés à base de chambre^7,8. Dans ces configurations, les axes d’éclairage (x) et de détection (z) sont généralement disposés perpendiculairement à l’axe de gravité (y). Les chambres d’échantillonnage offrent une grande liberté expérimentale. Tout d’abord, ils fournissent de grandes capacités tampons d’imagerie, ce qui facilite l’utilisation d’un système de perfusion pour contrôler l’environnement, par exemple, pour maintenir une température spécifique^{de 9} ou pour appliquer des facteurs de stress biochimiques. De plus, ils prennent en charge des méthodes de montage personnalisées¹⁰ qui sont adaptées aux besoins expérimentaux respectifs tout en préservant l’intégrité tridimensionnelle, dans certains cas dynamique^11,de l’échantillon. De plus, les configurations basées sur la chambre d’échantillonnage sont généralement équipées d’une fonction de rotation qui est utilisée pour faire tourner les échantillons autour de l’axe des y et ainsi les imager le long de deux, quatre ou même plus de directions. Puisque les embryons des organizations modèles couramment utilisées sont, dans le cadre de la microscopie, l’imagerie relativement grande et successive le long des axes ventral-dorsal, latéral, et/ou antérieur-postérieur de corps fournit une représentation plus complète. Cela permet par exemple un suivi à long terme des cellules qui se déplacent le long de chemins de migration tridimensionnels complexes^12,13.

La microscopie à fluorescence à base de feuille de lumière a été largement appliquée pour étudier la morphogenèse embryonnaire de Drosophila melanogaster,à la fois systématiquement^14,15 ainsi qu’avec un accent particulier sur les aspects biophysiques du développement. Par exemple, il a été utilisé pour recueillir des données morphogénétiques à haute résolution afin de détecter un lien biomécanique entre l’invagination de l’endoderme et l’extension de l’axe lors de l’allongement de la bande germinale¹⁶ et de relier davantage le flux cellulaire complexe avec des modèles de génération de force lors de la gastrulation^17. Il a également été combiné avec d’autres techniques de pointe, par exemple, l’optogénétique pour étudier la régulation de la signalisation Wnt lors du modelage antérieur-postérieur dans l’épiderme^18.

Cependant, l’étude d’une seule espèce ne permet pas de mieux comprendre l’évolution du développement. Pour comprendre l’embryogenèse dans le contexte phylogénétique, des recherches intensives ont été menées avec d’autres organismes modèles d’insectes. L’une des espèces les plus étudiées est le coléoptère rouge de la farine Tribolium castaneum,un ravageur des grains stocké économiquement pertinent^19,dont la morphogenèse embryonnaire a également déjà été systématiquement étiquetée avec LSFM^20. La morphogenèse embryonnaire de ces deux espèces diffère remarquablement à plusieurs égards, par exemple, le mode de segmentation^21,ainsi que la formation et la dégradation de membranes extra-embryonnaires^22. Ce dernier aspect a déjà fait l’objet d’une analyse approfondie à l’aide de LSFMs. Par exemple, il a été démontré que la séreuse, un tissu extra-embryonnaire qui enveloppe et protège l’embryon de Tribolium de divers dangers pour la majeure partie de son embryogenèse^23,24,agit également comme le « moteur » morphogénétique de son propre processus de retrait lors de la fermeture dorsale^25. De plus, il a été démontré que lors de la gastrulation, une région particulière du blastoderme reste ancrée à la membrane vitelline afin de créer des mouvements tissulaires asymétriques²⁶ et, suite à cette observation, que la fluidisation tissulaire régionalisée permet aux cellules de quitter séquentiellement le bord du sérosa lors de la fermeture de la fenêtre du séreuse^27.

Dans toutes les études associées à la drosophileet au triboliumcitées ci-dessus, des LSFM à base d’échantillons en chambre ont été utilisés. Dans la plupart des cas, les embryons ont été enregistrés dans plusieurs directions à l’aide de la fonction de rotation de l’échantillon. Bien que cela ne soit pas indiqué explicitement, on peut supposer qu’ils ont été enregistrés individuellement et donc indépendants les uns des autres dans des tests d’imagerie en direct séquentiels, similaires à nos travaux précédents sur Tribolium^20,28. Dans certains scénarios, une telle approche est acceptable, mais surtout dans les approches comparatives quantitatives, la variance ambiante peut fausser les résultats. Par exemple, on sait depuis longtemps que la vitesse de développement des insectes dépend de la température²⁹, mais une étude plus récente suggère en outre que chez la drosophile, la température peut également affecter la concentration de morphogènes³⁰. Par conséquent, si certaines caractéristiques de l’embryogenèse, par exemple les proportions dynamiques, les taux de division et les vitesses de migration des cellules, doivent être quantifiées avec précision, des répétitions suffisantes sans variance ambiante sont nécessaires. Cela minimise les écarts types et les erreurs types, ce qui facilite la juxtaposition avec d’autres conditions expérimentales, même marginalement divergentes.

Cependant, les LSFM à base de chambre d’échantillonnage sont principalement conçus pour des tests à haute teneur plutôt que pour des tests à haut débit. Contrairement aux microscopes confocaux, qui sont généralement équipés de mécanismes de serrage normalisés pour les lames de microscopie, les boîtes de Petri et les plaques de puits, presque tous les LSFM à base de chambre d’échantillonnage utilisent des mécanismes de serrage à base de cylindres. Ces mécanismes sont destinés aux porte-échantillons sur mesure qui sont compatibles avec la rotation ainsi que non invasifs^10,mais généralement non conçus pour plus d’un échantillon^20,31,32. Un cadre pour l’imagerie simultanée en direct de deux embryons ou plus, dans lequel les avantages des configurations basées sur la chambre d’échantillonnage ne sont pas compromis, résout le problème de la variance ambiante, augmentant ainsi la valeur des LSFM pour les études comparatives.

Dans notre protocole, nous présentons un cadre expérimental pour l’imagerie comparative en direct dans des LSFM à base de chambres d’échantillonnage (Figure 1A) dans lequel l’axe des y est utilisé comme option pour « empiler » des embryons. Tout d’abord, nous fournissons une directive d’étalonnage basée sur la microsphère fluorescente pour les LSFM basés sur une chambre d’échantillonnage, ce qui est particulièrement important pour les instruments qui ne disposent pas d’un assistant d’étalonnage. Deuxièmement, nous décrivons un procédé de montage pour embryons multiples basé sur le support de toile d’araignée²⁸ (figure 1B)qui est compatible avec la rotation des échantillons et permet ainsi l’imagerie simultanée de plusieurs échantillons dans plusieurs directions(figure 1C). Plusieurs embryons sont alignés sur un mince film d’agarose et, après insertion dans la chambre d’échantillonnage, déplacés successivement à travers la feuille de lumière pour acquérir des images tridimensionnelles. Troisièmement, nous fournissons trois ensembles de données d’imagerie en direct exemplaires pour la drosophile ainsi que pour Tribolium. Pour le premier, nous juxtaposons des lignées transgéniques avec des noyaux marqués par fluorescence. Pour ce dernier, nous comparons les performances des sous-lignées transgéniques qui portent le même transgène, mais à des endroits génomiques différents. Enfin, nous discutons de l’importance de la parallélisation en ce qui concerne l’imagerie en direct comparative et la variance ambiante^33,débattons de la limite de débit de notre cadre expérimental et évaluons l’adaptation de notre approche à d’autres organismes modèles.

Protocol

1. Travaux préparatoires

1. Choisissez une combinaison lentille d’éclairage / lentille de détection / caméra pour le LSFM qui convient à la question scientifique et configurez le microscope. La taille du champ de vision est le quotient de la taille de la puce de la caméra et le grossissement de l’objectif de détection. La lentille d’éclairage doit être choisie de telle sorte que tout le champ de vision soit recouvert d’une feuille lumineuse à peu près plane^34. Trois combinaisons recommandées sont énumérées dans le tableau 1.
2. Pour préparer les aliquotes d’agarose et la vaisselle de récupération, ajouter 2 g d’agarose à faible fusion à 200 ml d’eau du robinet autoclavée et chauffer le mélange dans un four à micro-ondes à 600-800 W jusqu’à ce que toutes les particules d’agarose soient dissoutes. Préparez plusieurs aliquotes d’agarose de 1 mL dans des tubes de réaction de 1,5 mL ou 2 mL, puis remplissez plusieurs boîtes de Petri Ø de 90 mm de 3 à 5 mm de haut avec de l’agarose. Conserver les aliquotes et la vaisselle solidifiées à 4 °C.
3. Pour la drosophile: Pour préparer des flacons d’élevage frais, cuire une quantité suffisante de milieu de drosophile sur mesure ou disponible dans le commerce, transférer 5-15 mL dans de larges flacons et les stocker à 4 °C. Pour préparer des plats pondants, ajoutez 1 g d’agarose à faible teneur en fusion à 50 mL d’eau du robinet autoclavée et chauffez le mélange dans un four à micro-ondes à 600-800 W jusqu’à ce que toutes les particules d’agarose soient dissoutes. Laisser refroidir le mélange à 45 °C, puis ajouter 50 ml de jus de fruits (de préférence du raisin de pomme ou rouge) et bien mélanger. Verser le mélange dans des boîtes de Pétri de 35 mm Ø et conserver les boîtes de ponte solidifiées à 4 °C.
4. Pour Tribolium: Pour préparer le milieu de croissance, passez la farine de blé entier ainsi que la levure sèche inactive à travers un tamis de maillage de 710 μm, puis complétez la farine tamisée avec 5% (p / p) de levure tamisée. Pour préparer un milieu de ponte, passez de la farine de blé fine ainsi que de la levure sèche inactive à travers un tamis de maillage de 250 μm, puis complétez la farine tamisée avec 5% (p / p) de levure tamisée.

2. Étalonnage des LSFM à base de chambres d’échantillonnage à l’aide de microsphères fluorescentes

NOTA : Le but de l’étalonnage est d’aligner les points focaux des lentilles d’éclairage et de détection(figure 2A),car c’est la prémisse pour des images claires. Les LSFM doivent être étalonnés régulièrement, au moins une fois toutes les 3-4 semaines.

1. Re-liquéfier une partie aliquote d’agarose dans un réchauffeur/mélangeur à bloc sec à 80 °C, puis laisser la partie aliquote d’agarose refroidir à 35 °C.
2. Transférer 50 μL d’agarose dans un tube réactionnel de 1,5 mL et ajouter 0,5 μL de solution de microsphère fluorescente. Mélanger à 1 400 tr/min pendant 1 min.
3. Remplissez le trou fendu du support de toile d’araignée avec 10 μL de mélange de solution d’agarose/microsphère fluorescente, puis aspirez autant d’agarose que possible jusqu’à ce qu’il ne reste qu’un mince film d’agarose. Attendez 30-60 s pour la solidification.
4. Remplissez la chambre d’échantillonnage avec de l’eau du robinet autoclavée. Insérez lentement le support de toile d’araignée dans la chambre d’échantillonnage et déplacez le trou fendu avec les étages de microtranslation devant la lentille de détection.
5. Faites pivoter le porte-toile d’araignée avec l’étage de rotation à une position de 45° par rapport aux axes d’éclairage (x) et de détection (z). Le support de toile d’araignée ne doit pas être visible dans le canal lumineux de transmission.
6. Passez au canal de fluorescence respectif et ajustez la puissance laser ainsi que le temps d’exposition afin que les microsphères fluorescentes fournissent un signal approprié.
7. Spécifiez un volume de vue qui couvre complètement le film d’agarose maintenant orienté transversalement. Définissez l’espacement z en calculant la résolution axiale maximale possible pour la combinaison lentille d’éclairage/lentille de détection^{respective 34.} Alternativement, 4 fois la résolution latérale peut être utilisée comme une approximation approximative.
8. Enregistrer une pile z d’essai tridimensionnelle des microsphères fluorescentes et comparer les projections maximales x, y et z à la carte d’étalonnage (Figure 2). Si les microsphères apparaissent floues, floues et/ou déformées(Figure 2B,C),ajustez les positions de la lentille d’éclairage et/ou de détection.

3. Collecte d’embryons de drosophiles

1. Transférer 100 à 200 adultes de la lignée de drosophiles de choix dans un flacon d’élevage frais 2-3 jours avant l’analyse d’imagerie afin d’établir une culture de collecte d’œufs. S’il n’existe pas encore, envisagez d’utiliser l’ancien flacon d’élevage pour démarrer une culture de progéniture. Pour s’assurer que les adultes n’ont pas plus de deux semaines, remplacez la culture de collecte d’embryons à temps par la culture de la progéniture.
2. Réchauffer un plat de ponte à température ambiante et ajouter une goutte de pâte de levure sur la gélose.
3. Transférer les adultes de la culture de collecte d’œufs dans un flacon étroit vide et le placer sur le dessus du plat de ponte. Incuber la configuration de collecte des œufs à température ambiante pendant 15 min. Évitez l’anesthésie (froid,_CO2)pendant cette étape si possible.
4. Retournez les adultes dans le flacon d’élevage. Incuber le plat de ponte à une combinaison température/temps pratique, puis transférer 10 à 20 embryons avec un petit pinceau du plat de ponte vers une passoire cellulaire de 100 μm. Jetez le plat de ponte.
5. Répétez les étapes 3.1 à 3.4 pour chaque lignée de drosophiles.

4. Collecte d’embryons de Tribolium

REMARQUE: Pour plus de commodité, un schéma de la procédure de collecte des œufs de Tribolium est fourni(figure 3A)auquel se réfèrent également les chiffres entre crochets de cette étape.

1. Transférer 200 à 300 adultes (environ 400 à 700 mg) de la lignée Tribolium de choix dans une bouteille en verre vide de 1 L 2 à 10 jours avant l’essai d’imagerie pour établir une culture de collecte d’œufs(figure 3A_01). Remplissez la bouteille avec 50-100 g de milieu de croissance frais. S’il n’existe pas encore, envisagez de commencer une culture de descendance en utilisant les larves et les pupes disponibles. Pour s’assurer que les adultes n’ont pas plus de 3 mois, remplacez la culture de collecte d’œufs à temps par la culture de la progéniture.
2. Faire passer la culture de collecte d’œufs à travers un tamis de maillage de 800 μm (figure 3A_02). Ramener le milieu de croissance, qui contient des embryons non étagés, dans le flacon initial(figure 3A_03)et transférer les adultes dans une bouteille en verre vide de 1 L(figure 3A_04). Ajouter 10 g de milieu de ponte(figure 3A_05)et incuber la configuration de collecte des œufs à température ambiante pendant 1 h(figure 3A_06,07).
3. Passez la configuration de la collecte d’œufs à travers le tamis de maillage de 800 μm(figure 3A_08). Ramener les adultes à leur bouteille initiale(figure 3A_09). Selon le processus de développement qui devrait être céfique, incuber le milieu de ponte, qui contient maintenant environ 30 à 100 embryons, à une combinaison température/temps pratique(figure 3A_10).
4. Faire passer le milieu de ponte à travers le tamis de maillage de 300 μm (figure 3A_11) et transférer les embryons(figure 3A_12) dans une passoire cellulaire de maillage de 100 μm. Jeter les milieux de ponte tamisé (figure 3A_13).
5. Répétez les étapes 4.1 à 4.4 pour chaque ligne Tribolium.

5. Déchorionation à base d’hypochlorite de sodium

REMARQUE: Les embryons de drosophile et de tribolium sont recouverts d’un chorion, une couche de protéines protectrice et fortement diffusante de la lumière qui n’est pas essentielle au bon développement tant que les embryons sont maintenus humides après le retrait. Le protocole de dchorionation pour les embryons des deux espèces est identique.

1. Préparer une plaque de 6 puits en remplissant les puits A1, A2, A3 et B3 avec 8 mL d’eau du robinet autoclavée et les puits B1 et B2 avec 7 mL d’eau du robinet autoclavée et 1 mL de solution d’hypochlorite de sodium (NaOCl)(figure 3B). Observez le processus de dchorionation sous un stéréomicroscope, idéalement en lumière de transmission.
   ATTENTION : L’hypochlorite de sodium est corrosif.
2. Insérez la passoire cellulaire contenant des embryons (étape 3.4 et/ou 4.4) dans le puits A1 et lavez les embryons environ 30 à 60 s sous une agitation douce.
3. Déplacez la passoire cellulaire vers le puits B1 et secouez vigoureusement les plaques pendant 30 s, puis transférez-la dans le puits A2 et lavez les embryons pendant 1 min sous agitation douce.
4. Déplacez la passoire cellulaire vers le puits B2 et secouez vigoureusement la plaque jusqu’à ce que la plupart des embryons soient complètement déchorionés(figure 3C),puis transférez-la dans le puits A3 et lavez les embryons pendant 1 min sous agitation douce.
5. Rangez la passoire de la cellule dans le B3 bien avant de procéder à la procédure de montage.
6. Répétez les étapes 5.1 à 5.5 pour chaque ligne.

6. Montage d’embryons multiples à l’aide du support de toile d’araignée

1. Re-liquéfier une partie aliquote d’agarose dans un réchauffeur/mélangeur à bloc sec à 80 °C, puis laisser la partie aliquote d’agarose refroidir à 35 °C.
2. Pipet 10 μL d’agarose sur le dessus du trou fendu du support de toile d’araignée. Avec la pointe de la pipette, étalez l’agarose sur le trou fendu, puis aspirez autant d’agarose que possible jusqu’à ce qu’il ne reste qu’un mince film d’agarose. Attendez 30-60 s pour la solidification.
3. Pour chaque ligne, choisissez soigneusement un ou plusieurs embryons avec un petit pinceau et placez-les sur le film d’agarose.
4. Disposez les embryons le long de l’axe long du trou fendu, puis alignez également leur axe antérieur-postérieur avec l’axe long du trou fendu(Figure 3D).
5. Stabiliser soigneusement les embryons en piper 1-2 μL d’agarose dans l’espace entre les embryons et le film d’agarose. Attendez 30-60 s pour la solidification.
6. Insérez lentement le support de toile d’araignée avec les embryons montés dans la chambre d’échantillonnage remplie de tampon d’image.

7. Imagerie en direct comparative dans des LSFM à base de chambre d’échantillonnage

1. Déplacez l’un des embryons avec les étapes de microtranslation devant la lentille de détection. S’assurer que le porte-toile d’araignée est dans une position de 45° par rapport aux axes d’éclairage (x) et de détection (z) (cf. figure 1C).
2. Dans le canal lumineux de transmission, déplacez l’embryon au centre du champ de vision. Le support de toile d’araignée ne doit pas être visible.
3. Déplacez l’embryon avec les étapes de microtraduction en z jusqu’à ce que le plan médian de l’embryon chevauche le plan focal, c’est-à-dire jusqu’à ce que le contour semble net. Sans passer au canal de fluorescence, spécifiez le volume de vue en vous éloignant de 250 μm du fond de panier central dans les deux sens.
4. Éventuellement, si une imagerie dans plusieurs directions est nécessaire, faites pivoter l’embryon de manière appropriée et répétez les étapes 7.2 et 7.3. Le porte-toile d’araignée supporte jusqu’à quatre orientations par pas de 90°.
5. Répétez les étapes 7.1 à 7.3 (ou 7.4) pour tous les autres embryons montés sur le support de toile d’araignée(figure 3E). Assurez-vous que l’embryon le plus haut ne quitte pas le tampon d’imagerie lorsque l’embryon le plus bas se trouve devant la lentille de détection.
6. Définissez les paramètres du canal de fluorescence (puissance laser, temps d’exposition, filtre de détection) et time lapse (intervalle, durée totale) et démarrez le processus d’imagerie. Pour obtenir des valeurs indicatives, consultez le tableau de métadonnées des exemples de jeux de données (Tableau supplémentaire 1). Pour les essais qui durent plusieurs jours, envisagez de recouvrir la chambre d’échantillonnage qui s’ouvre au moins partiellement pour réduire l’évaporation.

8. Récupération et culture ultérieure d’embryons cétés

1. Une fois l’essai d’imagerie terminé, retirez soigneusement le porte-toile d’araignée de la chambre d’échantillonnage.
2. Détachez les embryons du film d’agarose avec un petit pinceau et transférez-les sur une lame de microscope correctement étiquetée. Placez la lame dans une parabole de récupération et incuber dans les conditions d’élevage standard respectives.
3. En ce qui concerne les modalités expérimentales, estimer quand l’embryogenèse est terminée. À l’approche du point d’éclosion, vérifiez fréquemment les plats de récupération et transférez les larves de drosophile écloses dans des fioles d’élevage individuelles et des larves de Tribolium dans des puits individuels d’une plaque de 24 puits. Remplissez les puits jusqu’à la moitié avec un milieu de croissance. Incuber dans les conditions d’élevage standard respectives.
4. Une fois que les individus observés sont adultes, fournissez-leur un partenaire d’accouplement approprié et vérifiez la progéniture après plusieurs jours.

9. Traitement des données d’image et documentation des métadonnées

REMARQUE: Pour le traitement des données d’image, le dérivé d’ImageJ FIJI³⁵ est recommandé (imagej.net/Fiji/Downloads). FIJI ne nécessite pas d’installation et des versions 32 et 64 bits sont disponibles. L’un des formats les plus fréquemment utilisés pour les données LSFM est le format de fichier d’image balisé (TIFF), qui permet le stockage de piles d’images sous la forme d’un conteneur TIFF.

1. Calculer les projections z maximales pour toutes les piles z (Image | Piles | Z Project, choisissez Max Intensity). Les projections maximales sont des approches de simplification des données qui réduisent le nombre de dimensions spatiales de trois à deux. Un script FIJI pour le traitement par lots est fourni(fichier supplémentaire 1).
2. Concaténez les projections z maximum respectives pour créer des piles de temps (piles t). Enregistrez-les dans un conteneur TIFF. Faites-le pour tous les embryons enregistrés ainsi que les directions respectives et les canaux de fluorescence, le cas échéant.
3. Faites pivoter les piles z et t autour de l’axe z pour aligner l’axe antérieur-postérieur des embryons avec l’axe d’image x ou y (Image | Transformer | Rotation). Recadrez les piles z le long des trois axes d’image et la pile t dans les axes d’image x et y afin que seul un espace tampon minimal (20-40 pixels le long des axes x et y, 5-10 images le long de l’axe z) autour de l’embryon reste(Image | Ajuster | Taille du canevas pour les axes x et y, image | Piles | Outils | Slice Keeper pour l’axe z).
   1. Faites-le individuellement pour tous les embryons enregistrés ainsi que les directions respectives, le cas échéant. Les canaux de fluorescence, le cas échéant, doivent être traités avec des paramètres de rotation et de recadrage identiques.
4. Documentez les métadonnées aussi détaillées que possible. À titre indicatif, le tableau de métadonnées des exemples de jeux de données, qui figurent dans la section Résultats représentatifs, peut être utilisé(tableau supplémentaire 1).

10. Visualisation des données

REMARQUE : Cette ligne directrice sur la visualisation des données se concentre principalement sur la création de matrices d’image de projection z maximum qui montrent plusieurs embryons enregistrés le long de plusieurs directions et/ou au fil du temps. Les étapes suivantes décrivent la procédure de visualisation des données qui a été appliquée aux exemples de jeux de données pour la création des figures affichées et des vidéos liées dans la section Résultats représentatifs.

1. Combinez t piles de plusieurs directions (Image | Piles | Outils | Combiner) et/ou fusionner plusieurs canaux de fluorescence (Image | | couleur Fusionner les canaux) pour visualiser la structure biologique et / ou le processus d’intérêt.
2. Ajuster les intensités des piles t (Image | Ajuster | Luminosité/Contraste) selon les besoins en utilisant la fonction "Set« . La valeur minimale affichée doit être définie légèrement au-dessus du signal d’arrière-plan, la valeur maximale affichée doit entraîner un contraste pratique. Documentez les deux valeurs, car elles peuvent être utilisées pour un ajustement cohérent des piles z respectives. Réglages d’impression à l’aide de la fonction "Appliquer« . Selon les modalités expérimentales, envisagez de traiter tous les embryons enregistrés avec des valeurs identiques.
3. Enregistrez les piles t ajustées en fonction de l’intensité en tant que fichiers distincts, ne remplacez pas les piles t non ajustées. Compiler des sous-piles appropriées à partir des piles t ajustées avec des fonctions de sélection d’images dédiées (par exemple, Image | Piles | Outils | Slice Keeper) et utilisez l’outil de montage (Image | Piles | Make Montage) pour créer des grilles d’image qui peuvent être utilisées pour la conception de figures.

Results

Notre protocole décrit un cadre expérimental pour l’imagerie en direct par fluorescence comparative dans des LSFM à base de chambre d’échantillonnage. Par exemple, le cadre peut être utilisé pour juxtaposer (i) des embryons de deux espèces ou plus, (ii) des embryons de lignées dans lesquelles un ou plusieurs gènes sont éliminés plus des contrôles de type sauvage, (iii) des embryons multiples de la même lignée transgénique, (iv) des embryons de lignées transgéniques différentes, ou (v) des embryons de sous-lignées porteus...

Discussion

L’un des domaines d’application exclusifs des LSFM est la biologie du développement. Dans cette discipline, il est important d’examiner les spécimens vivants, sinon les processus morphogénétiques ne peuvent pas être décrits de manière dynamique. Un cadre expérimental pour l’imagerie en direct simultanée dans des LSFM à base de chambre d’échantillonnage, comme décrit ici, est pratique pour deux raisons principales.

La variance ambiante, qui est inévitable dans l’imagerie séquentielle en direct,...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plaque 6 puits	Orange Scientific	4430500<	strong>  ; Plaque
24 puits	Orange Scientific	4430300	Uniquement pour l’imagerie en direct impliquant Tribolium
35-mm & Oslash ; Boîte de Pétri	Fisher Scientific	153066	Uniquement pour l’imagerie en direct impliquant Drosophila.
90 mm et Oslash ; Boîte de Pétri	Fisher Scientific	L9004575
100 µ ; crépine cellulaire à maille m	BD Biosciences	352360
250 µ ; tamis à mailles m	VWR International	200.025.222-038	Uniquement pour l’imagerie en direct impliquant Tribolium
300 µ ; tamis à mailles	VWR International	200.025.222-040	Uniquement pour l’imagerie en direct impliquant Tribolium
710 µ ; Tamis à mailles multiples	VWR International	200.025.222-050	Uniquement pour l’imagerie en direct impliquant Tribolium
800 µ ; Tamis à mailles m	VWR International	200.025.222-051	Uniquement pour l’imagerie en direct impliquant Tribolium
405 farine de blé fine	Demeter e.V.	SP061006	Uniquement pour l’imagerie en direct impliquant Tribolium
milieu Drosophile disponible dans le commerce	Genesee Scientific	66-115	Uniquement pour l’imagerie en direct impliquant Drosophila / Sur mesure Drosophila milieu peut également être utilisé
des microsphères fluorescentes, 1.0 & micro ; m & Oslash ;	Thermo Fisher Scientific	T7282
sèche inactive	Genesee Scientific	62-108
agarose à bas point de fusion	Carl Roth	6351.2
flacons étroits	Genesee Scientific	32-109	Uniquement pour l’imagerie en direct impliquant Drosophila
small pinceau	VWR International	149-2121
hypochlorite de sodium (NaOCl), ~12 % actif Cl	Carl Roth	9062.3	Attention : l’hypochlorite de sodium est corrosif
farine de blé entier	Demeter e.V.	SP061036	Uniquement pour l’imagerie en direct impliquant Tribolium / Royaume-Uni :
flacons larges de	Genesee Scientific	32-110	Uniquement pour l’imagerie en direct impliquant Drosophila