Imagerie en direct simultanée d’embryons d’insectes multiples dans des microscopes à fluorescence à feuille de lumière à base de chambre d’échantillonnage

Summary

La microscopie à fluorescence à base de feuilles de lumière est l’outil le plus précieux en biologie du développement. Un problème majeur dans les études comparatives est la variance ambiante. Notre protocole décrit un cadre expérimental pour l’imagerie en direct simultanée de plusieurs spécimens et, par conséquent, aborde cette question de manière proactive.

Abstract

La microscopie à fluorescence à base de feuilles de lumière offre des solutions efficaces pour étudier des processus complexes à plusieurs échelles biologiquement pertinentes. Les configurations basées sur la chambre d’échantillonnage, qui sont spécialement conçues pour préserver l’intégrité tridimensionnelle de l’échantillon et comportent généralement une rotation de l’échantillon, sont le meilleur choix en biologie du développement. Par exemple, ils ont été utilisés pour documenter toute la morphogenèse embryonnaire de la mouche des fruits Drosophila melanogaster et du coléoptère rouge de la farine Tribolium castaneum. Cependant, de nombreux protocoles d’imagerie en direct disponibles ne fournissent que des cadres expérimentaux pour des embryons uniques. En particulier pour les études comparatives, de telles approches sont peu pratiques, car les spécimens estégés séquentiellement sont affectés par la variance ambiante. De plus, cela limite le nombre d’échantillons qui peuvent être analysés dans un délai donné. Nous fournissons un cadre expérimental pour l’imagerie simultanée en direct qui augmente le débit dans les configurations basées sur la chambre d’échantillonnage et garantit ainsi des conditions ambiantes similaires pour tous les échantillons. Tout d’abord, nous fournissons une directive d’étalonnage pour les microscopes à fluorescence à feuille de lumière. Deuxièmement, nous proposons une méthode de montage pour les embryons multiples qui soit compatible avec la rotation des échantillons. Troisièmement, nous fournissons des ensembles de données d’imagerie en direct tridimensionnelles exemplaires de Drosophila, pour lesquels nous juxtaposons trois lignées transgéniques avec des noyaux marqués par fluorescence, ainsi que de Tribolium, pour lequel nous comparons les performances de trois sous-lignées transgéniques qui portent le même transgène, mais à des emplacements génomiques différents. Notre protocole est spécialement conçu pour les études comparatives car il traite de manière proactive la variance ambiante, qui est toujours présente dans l’imagerie séquentielle en direct. Ceci est particulièrement important pour les analyses quantitatives et la caractérisation des phénotypes aberrationnels, qui résultent par exemple d’expériences knock-out. De plus, il augmente le débit global, ce qui est très pratique lorsque l’accès aux microscopes à fluorescence à feuille de lumière est limité. Enfin, la méthode de montage proposée peut être adaptée à d’autres espèces d’insectes et à d’autres organismes modèles, par exemple le poisson zèbre, sans aucun effort d’optimisation.

Introduction

La microscopie à fluorescence est l’une des techniques d’imagerie les plus essentielles dans les sciences de la vie, en particulier en biologie cellulaire et du développement. Dans les microscopes à fluorescence confocale¹, qui sont à la pointe de la technologie pour l’imagerie par fluorescence tridimensionnelle depuis le milieu des années 1990, la même lentille est utilisée pour l’excitation des fluorophores et la détection de la lumière d’émission. Le faisceau laser d’éclairage excite tous les fluorophores le long de l’axe d’éclairage/détection et le signal de mise au point respectif est discriminé avant la détection par un trou d’épingle. Pa....

Protocol

1. Travaux préparatoires

1. Choisissez une combinaison lentille d’éclairage / lentille de détection / caméra pour le LSFM qui convient à la question scientifique et configurez le microscope. La taille du champ de vision est le quotient de la taille de la puce de la caméra et le grossissement de l’objectif de détection. La lentille d’éclairage doit être choisie de telle sorte que tout le champ de vision soit recouvert d’une feuille lumineuse à peu près plane^34. Trois combinaisons recommandées sont énumérées dans le tableau 1.
2. Pour préparer les aliquotes d’agarose et la vaisselle de récupération, ajouter 2 g d’ag....

Results

Notre protocole décrit un cadre expérimental pour l’imagerie en direct par fluorescence comparative dans des LSFM à base de chambre d’échantillonnage. Par exemple, le cadre peut être utilisé pour juxtaposer (i) des embryons de deux espèces ou plus, (ii) des embryons de lignées dans lesquelles un ou plusieurs gènes sont éliminés plus des contrôles de type sauvage, (iii) des embryons multiples de la même lignée transgénique, (iv) des embryons de lignées transgéniques différentes, ou (v) des embryons de sous-lignées porteus.......

Discussion

L’un des domaines d’application exclusifs des LSFM est la biologie du développement. Dans cette discipline, il est important d’examiner les spécimens vivants, sinon les processus morphogénétiques ne peuvent pas être décrits de manière dynamique. Un cadre expérimental pour l’imagerie en direct simultanée dans des LSFM à base de chambre d’échantillonnage, comme décrit ici, est pratique pour deux raisons principales.

La variance ambiante, qui est inévitable dans l’imagerie séquentielle en direct,.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plaque 6 puits	Orange Scientific	4430500<	strong>  ; Plaque
24 puits	Orange Scientific	4430300	Uniquement pour l’imagerie en direct impliquant Tribolium
35-mm & Oslash ; Boîte de Pétri	Fisher Scientific	153066	Uniquement pour l’imagerie en direct impliquant Drosophila.
90 mm et Oslash ; Boîte de Pétri	Fisher Scientific	L9004575
100 µ ; crépine cellulaire à maille m	BD Biosciences	352360
250 µ ; tamis à mailles m	VWR International	200.025.222-038	Uniquement pour l’imagerie en direct impliquant Tribolium
300 µ ; tamis à mailles	VWR International	200.025.222-040	Uniquement pour l’imagerie en direct impliquant Tribolium
710 µ ; Tamis à mailles multiples	VWR International	200.025.222-050	Uniquement pour l’imagerie en direct impliquant Tribolium
800 µ ; Tamis à mailles m	VWR International	200.025.222-051	Uniquement pour l’imagerie en direct impliquant Tribolium
405 farine de blé fine	Demeter e.V.	SP061006	Uniquement pour l’imagerie en direct impliquant Tribolium
milieu Drosophile disponible dans le commerce	Genesee Scientific	66-115	Uniquement pour l’imagerie en direct impliquant Drosophila / Sur mesure Drosophila milieu peut également être utilisé
des microsphères fluorescentes, 1.0 & micro ; m & Oslash ;	Thermo Fisher Scientific	T7282
sèche inactive	Genesee Scientific	62-108
agarose à bas point de fusion	Carl Roth	6351.2
flacons étroits	Genesee Scientific	32-109	Uniquement pour l’imagerie en direct impliquant Drosophila
small pinceau	VWR International	149-2121
hypochlorite de sodium (NaOCl), ~12 % actif Cl	Carl Roth	9062.3	Attention : l’hypochlorite de sodium est corrosif
farine de blé entier	Demeter e.V.	SP061036	Uniquement pour l’imagerie en direct impliquant Tribolium / Royaume-Uni :
flacons larges de	Genesee Scientific	32-110	Uniquement pour l’imagerie en direct impliquant Drosophila