Sélection assistée de biomarqueurs par taille d’effet d’analyse discriminante linéaire (LEfSe) dans les données du microbiome

Résumé

LEfSe (LDA Effect Size) est un outil d’exploration de biomarqueurs de haute dimension pour identifier les caractéristiques génomiques (telles que les gènes, les voies et les taxonomies) qui caractérisent de manière significative deux groupes ou plus dans les données du microbiome.

Résumé

On s’intéresse de plus en plus aux génomes biologiques fermés dans l’environnement et dans la santé. Pour explorer et révéler les différences entre les groupes entre différents échantillons ou environnements, il est crucial de découvrir des biomarqueurs avec des différences statistiques entre les groupes. L’application de l’analyse discriminante linéaire Effect Size (LEfSe) peut aider à trouver de bons biomarqueurs. Sur la base des données génomiques originales, le contrôle de la qualité et la quantification de différentes séquences basées sur des taxons ou des gènes sont effectués. Tout d’abord, le test de rang de Kruskal-Wallis a été utilisé pour distinguer les différences spécifiques entre les groupes statistiques et biologiques. Ensuite, le test de rang de Wilcoxon a été effectué entre les deux groupes obtenus à l’étape précédente pour évaluer si les différences étaient cohérentes. Enfin, une analyse discriminante linéaire (LDA) a été menée pour évaluer l’influence des biomarqueurs sur des groupes significativement différents en fonction des scores LDA. Pour résumer, LEfSe a fourni la commodité pour identifier les biomarqueurs génomiques qui caractérisent les différences statistiques entre les groupes biologiques.

Introduction

Les biomarqueurs sont des caractéristiques biologiques qui peuvent être mesurées et peuvent indiquer certains phénomènes tels que l’infection, la maladie ou l’environnement. Parmi eux, les biomarqueurs fonctionnels peuvent être des fonctions biologiques spécifiques d’une seule espèce ou communes à certaines espèces, telles que les gènes, les protéines, les métabolites et les voies. En outre, les biomarqueurs taxonomiques indiquent une espèce inhabituelle, un groupe d’organismes (règne, embranchement, classe, ordre, famille, genre, espèce), la variation de séquence amplicon (ASV)¹ ou l’unité taxonomique opérationnelle (OTU)². Afin de trouver des biomarqueurs plus rapidement et avec plus de précision, un outil d’analyse des données biologiques est nécessaire. Les différences entre les classes peuvent être expliquées par LEfSe couplé à des tests standard de signification statistique et à des tests supplémentaires codant pour la cohérence biologique et la pertinence de l’effet³. LEfSe est disponible sous la forme d’un module galaxie, d’une formule conda, d’une image docker et inclus dans bioBakery (VM et cloud)⁴. En général, l’analyse de la diversité microbienne utilise souvent un test non paramétrique pour la distribution incertaine d’une communauté d’échantillons. Le test de somme de rang est une méthode de test non paramétrique, qui utilise le rang des échantillons pour remplacer la valeur des échantillons. Selon la différence des groupes d’échantillons, il peut être divisé en deux échantillons avec le test de somme de rang de Wilcoxon et en plusieurs échantillons avec le test de Kruskal-Wallis ^5,6. Notamment, lorsqu’il existe des différences significatives entre plusieurs groupes d’échantillons, un test de somme de rang de comparaison par paires de plusieurs échantillons devrait être effectué. LDA (qui signifie Linear Discriminant Analysis) inventé par Ronald Fisher en 1936, est un type d’apprentissage supervisé, également connu sous le nom de Fisher’s Linear Discriminant⁷. Il s’agit d’un algorithme classique et populaire dans le domaine actuel de l’exploration de données d’apprentissage automatique.

Ici, le test LEfSe a été optimisé par les serveurs Conda et Galaxy. Trois groupes de séquences de gènes d’ARNr 16S sont analysés pour démontrer les différences significatives entre les différents groupes ayant des scores LDA de communautés microbiennes et des résultats de visualisation.

Protocole

NOTE: Le protocole provient et a été modifié à partir des recherches de Segata et ^al.3. La méthode est fournie à https://bitbucket.org/biobakery/biobakery/wiki/lefse.

1. Préparation du fichier d’entrée pour analyse

1. Préparez le fichier d’entrée (Tableau 1) de LEfSe, qui pourrait être facilement généré par de nombreux workflows⁸ ou protocoles précédents⁹ avec les fichiers d’origine (fichier d’exemple et fichier d’annotation d’espèce correspondant).

2. Analyse native LEfSe (limitée au serveur Linux)

1. LEfSe Installation
   REMARQUE : Il est recommandé d’installer le pipeline LEfSe avec Conda¹⁰.
   1. Exécutez les commandes suivantes pour exclure la possibilité de conflit de dépendances. Créez un environnement conda pour LEfSe (cette étape est recommandée mais pas obligatoire. -n signifie le nom de l’environnement.
      $ conda create -n LEfSe-env
   2. Pour activer l’environnement LEfSe créé, exécutez :
      $ source activer LEfSe-env
   3. Pour installer LEfSe avec le canal bioBakery où -c signifie nom du canal, exécutez :
      $ conda installer -c biobakery lefse
2. Formater les données pour LEfSe
   1. Exécutez la commande suivante pour formater le fichier d’origine au format interne de LEfSe. Table .txt est le fichier d’entrée et Table-reformat.in est le fichier de sortie. -c est utilisé pour définir la fonction, qui est utilisée comme classe (1 par défaut) et -o est utilisé pour définir la valeur de normalisation (par défaut -1.0 signifiant aucune normalisation).
      Tableau format_input.py $ .txt Table-reformat.in -c 1 -o 1000000
3. Calcul de la taille de l’effet de l’analyse discriminante linéaire (LDA)
   1. Exécutez la commande suivante. Le but de cette étape est d’effectuer la LDA du résultat précédent et de générer le fichier de résultats pour la visualisation. Table-reformat.in est généré à l’aide de l’étape précédente et est utilisé comme fichier d’entrée dans cette étape. Table-reformat.res est le fichier de résultats.
      $ run_lefse.py Table-reformat.in Table-reformat.res
4. Visualisation par tracés
   1. Tracez les résultats LEfSe. Pour tracer la taille de l’effet des biomarqueurs dans un fichier pdf,. Table-reformat.res est généré à l’aide de l’étape précédente et le LDA.pdf est le fichier de tracé. –format est utilisé pour définir le format du fichier de sortie.
      $ plot_res.py Table-reformat.res LDA.pdf --format pdf
   2. Tracez le cladogramme. Dessiner l’arbre de l’espèce et afficher les biomarqueurs dans un cladogramme. cladogramme.pdf est le fichier de sortie.
      $ plot_cladogram.py Cladogramme Table-reformat.res.pdf --format pdf
   3. Tracer une fonction (facultatif) Tracer les différences d’un seul biomarqueur entre différents groupes. -f est utilisé pour définir les caractéristiques de l’intrigue. Si l’un d’entre eux a été défini, le feature_name doit être donné.
      $ plot_features.py -f one --feature_name « k__Bacteria.p__Firmicutes.c__Bacilli.o__Bacillales » --format pdf Table-reformat.in Table-reformat.res Bacillales.pdf
   4. Tracez les caractéristiques différentielles (facultatif) pour dessiner toutes les caractéristiques, mais il y a trop à faire avec prudence. --archive permet de choisir de compresser ou non les résultats. ./ signifie le chemin des résultats.
      $ plot_features.py -f diff --archive none --format pdf Table-reformat.in Table-reformat.res ./

3. Analyse en ligne LEfSe (galaxie)

1. Allez sur le serveur huttenhower galaxy¹¹: http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy.
2. Téléchargez les fichiers. Appuyez sur le bouton fléché Haut dans le volet gauche et téléchargez le fichier. Cliquez sur Choisir un fichier local pour sélectionner le fichier d’entrée et sélectionnez le format tabulaire, puis cliquez sur le bouton Démarrer .
   REMARQUE : Reportez-vous à la page Web (https://bitbucket.org/biobakery/biobakery/wiki/lefse), utilisez le script (taxonomy_summary. R) pour générer le fichier d’entrée de LEfSe, et le format (chaque colonne avec un nom de groupe, chaque ligne avec un niveau d’annotation différent séparé par « | ») est requis comme indiqué dans le tableau 1. Une vue d’ensemble schématique du processus de téléchargement est illustrée à la figure 1.
3. Formatez les données pour LEfSe. Cliquez sur le | LEfSe Mettre en forme le lien Données pour LEfSe dans le volet gauche, sélectionner les lignes spécifiques pour la classe dans le fichier, puis cliquer sur le bouton Exécuter . Un aperçu schématique du processus opérationnel et des paramètres utilisés est illustré à la figure 2.
4. Calculez la taille de l’effet LDA. Cliquez sur le | LEfSe LDA Effect Size (LEfSe) dans le volet gauche et sélectionnez les valeurs des paramètres en fonction des exigences d’analyse. Cliquez sur Exécuter. Un aperçu schématique du processus opérationnel et des paramètres utilisés est illustré à la figure 3.
5. Tracez les résultats LEfSe. Cliquez sur le | LEfSe Tracez le lien Résultats LEfSe dans le volet gauche, puis cliquez sur le bouton Exécuter . Un aperçu schématique du processus opérationnel et des paramètres utilisés est illustré à la figure 4.
6. Tracez le cladogramme. Cliquez sur Cladogramme de tracé dans le volet gauche, puis cliquez sur le bouton Exécuter après avoir sélectionné les valeurs des paramètres. Un aperçu schématique du processus opérationnel et des paramètres utilisés est illustré à la figure 5.
7. Tracez une fonction en cliquant sur Tracer une fonction dans le volet gauche, puis en cliquant sur le bouton Exécuter après avoir sélectionné les valeurs des paramètres. Un aperçu schématique du processus opérationnel et des paramètres utilisés est illustré à la figure 6.
8. Tracez les fonctions différentielles en cliquant sur Tracer les fonctions différentielles dans le volet gauche et en cliquant sur le bouton Exécuter après avoir sélectionné les valeurs des paramètres. Un aperçu schématique du processus opérationnel et des paramètres utilisés est illustré à la figure 7.
   REMARQUE: Ces chiffres générés peuvent être visualisés et téléchargés par rapport à la sortie résultante dans le volet droit.

Résultats

Les scores LDA des communautés microbiennes avec des différences significatives dans chaque groupe en analysant les séquences de gènes d’ARNr 16S de trois échantillons sont illustrés à la figure 8. La couleur de l’histogramme représente différents groupes, tandis que la longueur représente le score LDA, qui est l’influence de l’espèce avec des différences significatives entre les différents groupes. L’histogramme montre les espèces présentant des différences significatives dont le score LDA ...

Discussion

Ici, le protocole pour l’identification et la caractérisation des biomarqueurs au sein de différents groupes est décrit. Ce protocole peut facilement être adapté à d’autres types d’échantillons, tels que les OTU de micro-organismes. La méthode statistique de LEfSe permet de trouver les micro-organismes caractéristiques dans chaque groupe (la valeur par défaut est LDA >2), c’est-à-dire les micro-organismes les plus abondants dans ce groupe par rapport aux autres¹². LEfSe est disponible en versions ...

Matériaux

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