Mesure des distributions cAMP à 3 dimensions dans des cellules vivantes à l’aide de l’imagerie et de l’analyse FRET hyperspectrales en 4 dimensions (x, y, z et λ)

Résumé

En raison du faible rapport signal/bruit (SNR) inhérent aux capteurs basés sur le transfert d’énergie par résonance Fӧrster (FRET), la mesure des signaux cAMP a été difficile, en particulier dans trois dimensions spatiales. Nous décrivons ici une méthodologie d’imagerie et d’analyse FRET hyperspectrale qui permet de mesurer la distribution de l’AMPc en trois dimensions spatiales.

Résumé

L’AMP cyclique est un deuxième messager impliqué dans un large éventail d’activités cellulaires et physiologiques. Plusieurs études suggèrent que les signaux cAMP sont compartimentés et que le compartimentation contribue à la spécificité de la signalisation dans la voie de signalisation cAMP. Le développement de biocapteurs basés sur le transfert d’énergie par résonance de Fӧrster (FRET) a renforcé la capacité de mesurer et de visualiser les signaux cAMP dans les cellules. Cependant, ces mesures sont souvent limitées à deux dimensions spatiales, ce qui peut entraîner une mauvaise interprétation des données. À ce jour, il n’y a eu que des mesures très limitées des signaux cAMP dans trois dimensions spatiales (x, y et z), en raison des limitations techniques liées à l’utilisation des capteurs FRET qui présentent intrinsèquement un faible rapport signal/bruit (SNR). En outre, les approches traditionnelles d’imagerie par filtre sont souvent inefficaces pour mesurer avec précision les signaux cAMP dans les régions subcellulaires localisées en raison d’une gamme de facteurs, notamment la diaphonie spectrale, la force limitée du signal et l’autofluorescence. Pour surmonter ces limites et permettre aux biocapteurs à base de FRET d’être utilisés avec plusieurs fluorophores, nous avons développé des approches d’imagerie et d’analyse FRET hyperspectrales qui fournissent une spécificité spectrale pour le calcul des efficacités FRET et la capacité de séparer spectralement les signaux FRET de l’autofluorescence confondante et / ou des signaux d’étiquettes fluorescentes supplémentaires. Nous présentons ici la méthodologie de mise en œuvre de l’imagerie FRET hyperspectrale ainsi que la nécessité de construire une bibliothèque spectrale appropriée qui n’est ni sous-échantillonnée ni suréchantillonnée pour effectuer un démélange spectral. Bien que nous présentions cette méthodologie pour la mesure des distributions tridimensionnelles de l’AMPc dans les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires (PMVEC), cette méthodologie pourrait être utilisée pour étudier les distributions spatiales de l’AMPc dans une gamme de types de cellules.

Introduction

L’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) est un deuxième messager impliqué dans les processus cellulaires et physiologiques clés, notamment la division cellulaire, l’afflux de calcium, la transcription des gènes et la transduction du signal. Un nombre croissant de preuves suggère l’existence de compartiments cAMP dans la cellule à travers lesquels la spécificité de signalisation est atteinte^{1,2,3,4,5,6,7}. Jusqu’à récemment, la compartime....

Protocole

Ce protocole suit les procédures approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de South Alabama.

1. Préparation des cellules, des échantillons et des réactifs pour l’imagerie

1. Isoler les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires (PMVEC) du rat comme décrit précédemment³⁵.
   REMARQUE: Les cellules ont été isolées et cultivées par le noyau de culture cellulaire de l’Université de South Alabama, Mobile, AL sur des paraboles de culture cellulaire de 100 mm.
2. Ensemencez les PMVÉC isolés sur des couvercles de verre rond de 25 mm et laissez-les se ....

Résultats

Ce protocole décrit l’utilisation d’approches hyperspectrales d’imagerie et d’analyse FRET pour mesurer les gradients cAMP dans trois dimensions spatiales dans des cellules vivantes. La génération de ces résultats implique plusieurs étapes clés, pour lesquelles une attention particulière est requise lors de l’analyse et de la quantification des données. Ces étapes clés comprennent la construction d’une bibliothèque spectrale appropriée, le démélange spectral de fond, le seuillage pour identifier les frontières cellulaire.......

Discussion

Le développement des biocapteurs FRET a permis la mesure et la visualisation des signaux nucléotidiques cycliques dans des cellules individuelles, et il existe de grandes promesses pour visualiser les événements de signalisation subcellulaire^13,22,37,38. Cependant, l’utilisation de biocapteurs FRET présente plusieurs limites, notamment les faibles caractéristiques signal-bruit de nombreux rappo.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Attofluor	Invitrogen	A7816	Attofluor contient des chambres cellulaires en acier et un joint torique en caoutchouc. La chambre cellulaire maintient la lamelle et le joint torique fournit un mécanisme de verrouillage pour maintenir le tampon dans la chambre cellulaire sans fuite
sulfoxyde de diméthyle (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100	Solvant utilisé pour préparer la solution mère de forskoline.
DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution	Thermo Scientific	62252	Étiquette nucléaire
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-092	Contient des nutriments et des facteurs de croissance pour que les cellules se développent et se divisent dans les boîtes de culture.
Sérum fœtal bovin (FBS)	Sigma	F6178	Apport de facteur de croissance qui est ajouté au milieu de culture, DMEM
Forskolin	Sigma	F3917	Activateur de l’Adenyly cyclase.
H188 Cyclic AMP FRET biocapteur	Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink	Gift	Plasmide codant pour Turquoise (fluorophore donneur), Vénus (fluorophore accepteur) et domaine de liaison obtenu à partir d’Epac.
Image J	image.net	Téléchargement gratuit	Une autre plate-forme de traitement d’images utilisée pour extraire des informations spectrales et le traitement d’images.
Intégration de Sphere	Ocean Optics	FOIS-1	Utilisé pour mesurer l’intensité d’éclairage de la ligne laser à différentes intensités laser ( ?).
Protéine de souris laminine,	Invitrogen	naturel 23017-015	Les lamelles sont recouvertes de laminine, ce qui aide à l’attachement, à la croissance et à la motilité de la cellule.
Lipofectamine 3000 Transfection Kit	Invitrogen	L3000-015	Réactif de transfection utilisé pour transfecter des cellules avec un biocapteur H188 FRET
MATLAB	Mathworks	R2019a	opérations de traitement d’images (démélange linéaire et calculs d’efficacité FRET) sont effectuées en écrivant des programmes personnalisés dans l’environnement de programmation MATLAB
Microscope confocal Nikon A1R	Nikon Instruments	Nikon A1R	L’acquisition d’images spectrales est réalisée à l’aide d’un microscope confocal.
Logiciel Nikon Elements Logiciel	Nikon Instruments	Dongle utilisé	pour exporter et gérer des fichiers d’image nd2 (fichiers d’images multidimensionnels) acquis à l’aide de la lampe d’étalonnage Nikon A1R
NIST-Traceable Calibration	Optique Ocean Optics	LS-1-CAL-INT	Une lampe avec un spectre connu pour une utilisation en tant que norme
PBS pH 7,4 (1X)	Gibco	10010-023	tampon utilisé principalement pour la culture cellulaire
Cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires (PMVECs)	En interne - Noyau de culture cellulaire, Université du sud de l’Alabama	Isolés de la microvascularisation pulmonaire du rat,	les PMVECs forment la paroi interne d’un vaisseau sanguin.
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/ml)	Les antibiotiques Gibco	15140-122	sont ajoutés à la culture medum pour prévenir la contamination des cellules.
Microlames Gold Seal pré-nettoyées Clay	Adams	3010	Lames de microscope utilisées pour la fixation cellulaire
ProLong Diamond Antifade Mounting Media	Invitrogen	P36961	Si les échantillons sont fixés à l’aide d’un enrobeur anti-décoloration, ce dernier protège les colorants fluorescents et les chromophores de la décoloration.
Spectromètre	Ocean Optics	QE65000	Utilisé pour mesurer la réponse spectrale de la source lumineuse ( ?)
Trypsine-EDTA (0,25 %)	Gibco	25200-056	Digère la liaison protéine-protéine entre la cellule et la matrice cellulaire et aide à disscocier et à soulever les cellules pendant le placage cellulaire.
		Le	tampon Tyrodes est utilisé pour fabriquer des solutions de travail et pour maintenir les cellules en solution aqueuse pendant l’acquisition d’images.
Plaque de culture cellulaire à 6 puits	Corning	3506	Les lamelles recouvertes de laminine sont placées dans une boîte de culture à 6 puits (une couverture/puits). Des cellules ainsi que du milieu sont ajoutés dans chaque puits.
Couvercles de microscope ronds de 25 mm	Fisher Scientific	12545102	Les cellules ont été cultivées sur des lamelles en verre rond
60X Ojective	Nikon Instruments	Plan Apo VC 60X/1.2 WI &infin ;/0.15-0.18 WD 0.27	Immersion dans l’eau et objectif couramment utilisé pour les cellules

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