Nous décrivons ici deux protocoles: d’abord pour propager, extraire, purifier et quantifier de grandes quantités de particules virales non enveloppées d’abeilles mellifères, y compris une méthode pour éliminer les pupes d’abeilles mellifères et ensuite pour tester les effets de l’infection virale à l’aide d’un essai biologique en cage hautement reproductible et à haut débit.
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Article de méthode
Préparation de l’inoculum enrichi en virus pour l’infection orale des abeilles mellifères (Apis mellifera)
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les abeilles mellifères sont d’une grande importance écologique et agricole dans le monde entier, mais sont également soumises à diverses pressions qui affectent négativement la santé des abeilles, y compris l’exposition à des agents pathogènes viraux. De tels virus peuvent causer une grande variété d’effets dévastateurs et peuvent souvent être difficiles à étudier en raison de multiples facteurs qui rendent difficile la séparation des effets des traitements expérimentaux de l’infection de fond préexistante. Nous présentons ici une méthode pour produire en masse de grandes quantités de particules virales ainsi qu’un essai biologique à haut débit pour tester l’infection virale et ses effets. Rendues nécessaires par l’absence actuelle d’une lignée cellulaire continue et exempte de virus, les particules virales sont amplifiées in vivo à l’aide de pupes d’abeilles mellifères, qui sont extraites de la ruche en grands volumes en utilisant une méthodologie peu stressante. Ces particules virales peuvent ensuite être utilisées dans les essais biologiques en cage d’abeilles mellifères pour tester la viabilité de l’inocula, ainsi que diverses autres dynamiques d’infection virale, y compris les interactions avec la nutrition, les pesticides et d’autres agents pathogènes. Un avantage majeur de l’utilisation de telles particules est qu’elle réduit considérablement les chances d’introduire des variables inconnues dans les expérimentations ultérieures par rapport aux alternatives actuelles, telles que l’infection par l’hémolymphe ou l’homogénat d’abeille infectée, bien qu’il faille toujours faire attention lors de l’approvisionnement des abeilles, à minimiser la contamination virale de fond. Les essais en cage ne remplacent pas les expériences réalistes à grande échelle qui testent les effets de l’infection virale au niveau de la colonie, mais fonctionnent plutôt comme une méthode pour établir des réponses virales de base qui, en combinaison avec les particules virales semi-pures, peuvent servir d’outils importants pour examiner diverses dimensions des interactions physiologiques entre les abeilles mellifères et les virus.
Introduction
Les abeilles mellifères (Apis mellifera) jouent un rôle essentiel dans le paysage agricole mondial moderne, mais souffrent actuellement d’une combinaison de facteurs de stress biotiques et abiotiques, notamment l’exposition aux pesticides, le mauvais fourrage, les parasites et les agents pathogènes 1,2. L’un des agents pathogènes les plus préoccupants sont les virus, dont beaucoup sont vecteurs par un autre des principaux facteurs de stress des abeilles mellifères, l’acarien parasite Varroa (Varroa destructor). Ces virus peuvent causer une série d’effets négatifs chez les abeilles mellifères,....
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Protocole
1. Option d’extraction massive des abeilles 1 : auto-élimination larvaire
- Mettez en cage une reine des abeilles sur un cadre Langstroth vide et étiré et ramenez-la dans sa colonie. Laissez la reine pondre des œufs sur ce cadre pendant 24 h.
- Vérifiez le cadre après 24 h pour vous assurer que la plupart des cellules du peigne contiennent des œufs nouvellement pondus. Selon la reine et la colonie, les œufs ne sont parfois pas très bien pondus dans les premières 24 heures. Si cela se produit, prévoyez 24 heures supplémentaires et ajustez le temps si nécessaire.
- Après la période de ponte de 24 heures, relâchez la reine. Marquez clair....
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Résultats
Le respect réussi des protocoles (figures 1) pour l’injection nymphale et l’extraction virale devrait produire de grandes quantités de particules virales. Cependant, l’échantillonnage et l’injection de pupes provenant de diverses colonies à plusieurs moments maximisent les chances d’acquérir le virus cible avec une faible contamination. La dynamique par laquelle les virus se répliquent et interagissent les uns avec les autres au sein d’une abeille mellifère n’est pas bien comprise; en plus de la probabil.......
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Discussion
Ici, nous avons décrit des méthodes détaillant chaque étape du processus d’amplification du virus et de préparation du stock d’inoculum, y compris la collecte des larves et la propagation, l’extraction et la concentration du virus, ainsi que le traitement viral sous la forme d’expériences d’alimentation en cage. Ces méthodes permettent de produire des particules virales semi-pures (figure 4), dont l’efficacité peut être quantifiée de manière cohérente par des tests de mortalité dose-réponse .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous tenons à remercier la Dre Julia Fine pour ses idées et ses discussions au cours du processus de création du protocole, ainsi que la Dre Cassondra Vernier pour ses commentaires utiles tout au long de l’édition. Ces documents ont contribué à des projets qui ont été soutenus en partie par la Fondation pour la recherche sur l’alimentation et l’agriculture, dans le cadre de la subvention ID 549025.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| d’eau de Javel à 10 % | |||
| 24:1 Alcool chloroforme :isoamylique | SigmaAldrich | C0549 | |
| d’éthanol à 70 % | |||
| Cages pour essai biologique | En fonction de la configuration expérimentale | ||
| Combitips Advanced 0,1 mL | Eppendorf | 30089405 | Facultatif (si aucun appareil d’injection n’est disponible) |
| Les récipients pour l’auto-élimination | Doivent mesurer environ 19 » x 9-1/8 » (dimensions du cadre profond Langstroth) | ||
| Pince | émoussée, pince douce pour la séparation des larves ; pince émoussée, dure pour l’excision des nymphes | ||
| Hotte | |||
| Incubateur | Capable de maintenir 34 º ; C et 50 % d’humidité relative | ||
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | N’importe quelle lingette absorbante fera l’affaire |
| Bateaux de poids moyen Servir | de plateaux d’inoculum | ||
| Microcon-100kDa avec membrane Biomax | MilliporeSigma | MPE100025 | |
| NaCl | |||
| nitrile | |||
| Phosphate solution saline tamponnée (PBS) | SigmaAldrich | P5119 | |
| Polyéthylène glycol 8000 (PEG) | SigmaAldrich | 1546605 | |
| Centrifugeuse | Capable de 15 000 x g | ||
| Centrifugeuse | Capable de 21 000 x g | ||
| Répéteur M4 Multipipette | Eppendorf | 4982000322 | Facultatif (si aucun injecteur n’est disponible) |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000TS1 | |
| Eau sans RNAse | SigmaAldrich | W4502 | |
| Saccharose | |||
| TES | SigmaAldrich | T1375 |
Références
- vanEngelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. Journal of Invertebrate Pathology. 103, Suppl. 1 80-95 (2010).
- Goulson, D., Nicholls, E., Botías, C., Rotheray, E. L.
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Réimpressions et autorisations
