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Article de méthode

Une méthode mini-invasive pour l’instillation intratrachéale de médicaments chez les rongeurs néonatals pour traiter les maladies pulmonaires

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DOI :

10.3791/61729

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4 août 2021

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1Department of Pediatrics, Case Western Reserve University

Dans cet article

Résumé

Cette technique consistant à instiller des médicaments directement dans la trachée des rongeurs néonatals est importante pour étudier l’impact des médicaments ou des produits biologiques administrés localement sur les maladies pulmonaires néonatales. En outre, cette méthode peut également être utilisée pour induire des lésions pulmonaires dans des modèles animaux.

Résumé

Le traitement du rongeur néonatal avec des médicaments instillés directement dans la trachée pourrait servir d’outil précieux pour étudier l’impact d’un médicament administré localement. Cela a un impact translationnel direct car les tensioactifs et les médicaments sont administrés localement dans les poumons. Bien que la littérature compte de nombreuses publications décrivant l’intubation transorale mini-invasive de souris et de rats adultes dans des expériences thérapeutiques, cette approche chez les ratons néonatals fait défaut. La petite taille de la région orotrachéale / pharynx chez les chiots rend difficile la visualisation de la lumière laryngée (cordes vocales), contribuant au taux de réussite variable de l’administration intratrachéale de médicaments. Nous démontrons par la présente une intubation orale efficace du chiot de rat néonatal - une technique non traumatique et peu invasive, de sorte qu’elle peut être utilisée pour l’administration en série de médicaments. Nous avons utilisé un otoscope de fonctionnement avec un système d’éclairage et une lentille grossissante pour visualiser l’ouverture trachéale des nouveau-nés de rat. Le médicament est ensuite instillé à l’aide d’une seringue de 1 mL reliée à une pointe de pipette. La précision de la méthode d’administration a été démontrée en utilisant l’administration de colorant bleu Evans. Cette méthode est facile à former et pourrait servir de moyen efficace d’instiller des médicaments dans la trachée. Cette méthode pourrait également être utilisée pour l’administration d’inoculum ou d’agents pour simuler des conditions pathologiques chez les animaux et, également, pour des stratégies de traitement cellulaires pour diverses maladies pulmonaires.

Introduction

Les nouveau-nés nés prématurément ont des poumons peu développés nécessitant de nombreuses thérapies interventionnelles telles que la ventilation à long terme. Ces interventions exposent les nouveau-nés survivants à un risque élevé de séquelles ultérieures1. Les modèles animaux expérimentaux constituent un outil important pour simuler diverses maladies, étudier la pathobiologie des maladies et évaluer les interventions thérapeutiques. Même si un large éventail de modèles animaux allant des souris, des rats et des lapins aux agneaux et aux porcs prématurés est disponible, les souris et les rats sont les plus utilisés.

Le principal avantage de l’utilisation de souris et de rats est la période de gestation relativement courte et le coût réduit. Ils sont également facilement disponibles, faciles à entretenir dans des environnements exempts de maladies, génétiquement homogènes et ont relativement moins de préoccupations éthiques 2,3. Un autre avantage majeur du modèle rongeur est qu’à la naissance, le chiot néonatal est au stade canaliculaire tardif / sacculaire précoce du développement pulmonaire, ce qui est morphologiquement équivalent au poumon d’un nourrisson humain néonatal prématuré de 24 semaines développant une dysplasie bronchopulmonaire4. De plus, comme leur développement pulmonaire progresse rapidement jusqu’à son achèvement dans les 4 premières semaines de vie, il est possible d’étudier la maturation pulmonaire postnatale dans un délai raisonnable4. Malgré ces avantages, la petite taille des souris et des ratons est une source de préoccupation pour diverses interventions, ce qui oblige la plupart des chercheurs à utiliser des animaux adultes plutôt que des chiots5. Les poumons néonatals sont à un stade de développement et la réponse d’un nouveau-né à un agent incitant diffère de celle d’un adulte. Il est donc approprié d’utiliser des modèles animaux néonatals pour étudier les maladies néonatales humaines.

Il existe différentes méthodes pour administrer des médicaments / agents biologiques au poumon. Cela comprend l’instillation intranasale 6,7 ou intratrachéale 8,9,10 ainsi que l’inhalation d’aérosols11,12. Chaque approche a ses propres défis techniques, avantages et limites13. La voie intratrachéale d’administration d’agents thérapeutiques est préférable pour étudier l’impact thérapeutique direct dans l’organe en contournant les effets systémiques. Cette voie pourrait également être utilisée pour étudier la pathologie pulmonaire causée par des agents incitants. Il existe des techniques invasives et mini-invasives pour ce faire et est facile à effectuer chez les adultes. Cependant, chez les chiots, en raison de la petite taille de l’animal, il existe des défis techniques associés au processus d’intubation. La présente étude présente une méthode d’instillation intratrachéale (ITI) simple, cohérente et non chirurgicale chez les ratons qui pourrait être utilisée pour étudier l’efficacité de diverses interventions thérapeutiques néonatales ainsi que pour générer des modèles animaux simulant des maladies respiratoires néonatales.

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Protocole

Toutes les expériences ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (protocole no 2020-0035) de l’Université Case Western Reserve. Tous les animaux ont été traités conformément aux directives des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.

1. Animaux

  1. Obtenez commercialement des rats Sprague Dawley gravides.
  2. Maintenir les animaux dans un établissement vétérinaire approuvé avec un cycle lumière-obscurité de 14 h/10 h et une humidité relative de 45 à 60 %.

2. Préparation du composé d’essai

  1. Utilisez le colorant bleu d’Evans comme composé d’essai pour évaluer l’efficacité de la procédure d’instillation intratrachéale.
  2. Préparer une solution à 0,25 % (p/v) du colorant dans une solution saline tamponnée au phosphate (pH 7,2) et filtrer la stérilisation à l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 μm.

3. Administration de l’anesthésie

  1. Anesthésier les ratons sous anesthésie gazeuse (3% d’isoflurane dans 100% d’oxygène), en utilisant un système d’administration modifié adapté aux petits nouveau-nés de rat.
  2. Vérifiez la perte des réflexes de queue et de pédale et la respiration peu profonde pour assurer la bonne profondeur d’anesthésie pour effectuer la procédure.

4. Instillation intratrachéale (ITI)

  1. Utilisez des ratons au jour postnatal 5 (PN 5) pour l’ITI. Le poids moyen d’un chiot de rat PN 5 est de 12 grammes.
  2. Retenez le chiot de rat anesthésié sur une plate-forme plate inclinée à l’aide de ruban adhésif d’étiquetage de laboratoire. Le chiot est retenu à un angle d’environ 45° en position couchée.
  3. Ouvrez la bouche du nouveau-né et tirez doucement la langue d’un côté à l’aide d’une pince émoussée.
  4. Utilisez un petit spéculum d’otoscope de 2 mm de diamètre relié à l’otoscope pour tenir doucement la langue et pour une visualisation correcte du larynx.
  5. Utilisez le système d’enlumineur de gorge, c’est-à-dire l’otoscope opératoire et la loupe pour une visualisation appropriée des cordes vocales (Figure 1).
  6. Positionnez les animaux à un angle de 45° dans un plan incliné. Les couvercles de barres câblées des cages de souris sont utilisés (Figure 2).
    REMARQUE: Le positionnement de l’animal à un angle de 45 ° permet une meilleure visualisation de l’ouverture trachéale sans l’interférence de l’épiglotte.
  7. Prenez une pointe de pipette à angle long qui est utilisée pour charger les gels western blot. Coupez la base de la pointe de la pipette à l’aide d’une lame chirurgicale afin qu’elle s’insère bien dans la pointe de la seringue de 1 cc.
  8. Utilisez la seringue stérile de 1 mL insérée dans une pointe de pipette à long angle pour délivrer 30 à 50 μL de la substance dans les poumons. Inverser la seringue et aspirer près de 0,9 cc d’air dans la seringue de 1 mL reliée à l’embout de la pipette suivie du colorant ou de la substance à délivrer. Cela permet à l’air derrière le colorant d’être poussé dans la trachée après l’administration du colorant, comme le montre la figure 3. L’administration intratrachéale est réalisée en visualisant la lumière laryngée (cordes vocales) et en insérant la pointe de la pipette montée sur une seringue dans la lumière trachéale.
  9. Utilisez le spéculum de l’otoscope pour tenir la langue et exposer les cordes vocales. Le spéculum joue le rôle de lame d’un laryngoscope. Pliez la pointe de la pipette à un angle de 30° pour faciliter l’introduction de l’agent à travers le spéculum en forme de cône dans l’ouverture trachéale.
  10. Introduisez la pointe de la pipette dans l’ouverture trachéale jusqu’à environ 2 mm au-delà des cordes vocales. Poussez le piston de la seringue pour administrer le colorant ou le médicament à travers le spéculum de l’otoscope opératoire, comme illustré à la figure 3. L’introduction d’air dans les poumons peu de temps après l’administration de l’agent empêche la substance de revenir dans la cavité laryngée.
  11. Après avoir administré au chiot le colorant ou une solution saline normale, placez les chiots sur un coussin chauffant à liquide circulant intégré (38 ° C) jusqu’à ce que leurs mouvements respiratoires soient réguliers. Après une récupération complète de l’anesthésie, réunissez les chiots avec la mère.

5. Caractérisation de la prestation de l’ITI

  1. Après ITI, euthanasier les ratons en leur donnant une anesthésie excessive (Kétamine 100 mg/kg et Xylazine 10 mg/kg) / thiopenttone suivie d’une exsanguination à un moment approprié après l’administration. L’euthanasie a été réalisée dans le cadre de l’expérience pour prélever du tissu pulmonaire afin de démontrer l’efficacité.
  2. Fixez le rat euthanasié sur une planche de dissection et essuyez la poitrine et l’abdomen avec de l’alcool éthylique à 70%.
  3. Pour évaluer la distribution du colorant dans l’ensemble des poumons, retirer les poumons de l’animal à l’aide d’une technique stérile et afficher les poumons comme il convient pour l’imagerie (figure 4A, B).

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Résultats

L’instillation du bleu d’Evans a révélé une distribution multifocale du colorant impliquant tous les lobes pulmonaires (Figure 4A,B). Notre résultat, tel que illustré à la figure 4, démontre l’efficacité de la distribution à tous les lobes. La photo est prise immédiatement après l’ITI du colorant dans la trachée. Une efficacité de 100% a été obtenue en instillant le colorant dans la trachée, suivie de sa propagation dans tous les lobes des deux ...

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Discussion

L’instillation intratrachéale est une excellente méthode qui offre plusieurs avantages par rapport aux méthodes existantes pour les interventions contre les maladies respiratoires ainsi que pour le développement de modèles de maladies. C’est une méthode rapide et avec de l’expérience, peut être effectuée avec une vitesse moyenne de 2-3 minutes par animal. Les considérations clés pour une intubation réussie sont une sédation correcte de l’animal, son positionnement correct, en particulier la tête, ainsi que la profondeur ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu en partie par R01HD090887-01A1 de NICHD à AH. Les auteurs reconnaissent également les installations fournies par le laboratoire du Dr Peter Mc Farlane, telles que l’anesthésie par inhalation / système de coussin chauffant. L’aide précieuse de Mme Catherine Mayer dans la mise en place du système est appréciée. Aucun rôle n’a été joué par l’organisme de financement dans la conception de l’étude, de la collecte, de l’analyse et de l’interprétation des données ou dans la rédaction du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Evans Blue colorantSigma-Aldrich, St Louis, MO, États-Unis314-13-6Confirmation de l’administration du médicament dans les poumons Chlorhydrate de
kétamineHospira. Inc, Lake Forest, IL, États-UnisDispensé d’un établissement de soins aux animauxPour la sédation
l’otoscopeWelch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, États-Unis21770- 3,5 VPour la visualisation des cordes vocales
Otoscope Poignée rechargeableWelch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, États-Unis71050-C
Pointe de pipette (chargement de gel)Fisherbrand02-707-139Administration du médicament
Plate-forme de contention (plan incliné)Établissement de soinsaux animaux Dispensé de l’établissement de soins aux animauxLe toit câblé de la cage des souris peut être utilisé
3M Micropore Surgical White Paper (ruban adhésif)3M, St. Paul, MN, USA1530-2
Luer Lock SeringuesSeringues (1 ml)BD Franklin Lakes, NJ , USANBD2515Administration du médicament
XylazineHospira. Inc, Lake Forest, IL, États-UnisPour la sédation
Utilisation de

Références

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