Visualisation de l’innervation immunoréactive du peptide lié au gène de la calcitonine du dura mater crânien de rat avec immunofluorescence et traçage neuronal

Résumé

Ici nous présentons un protocole pour visualiser la corrélation spatiale du peptide gène-connexe de calcitonine (CGRP) - fibres nerveuses immunoreactive et vaisseaux sanguins dans le mater crânien de dura utilisant l’immunofluorescence et l’histochimie fluorescente avec CGRP et phalloidin, respectivement. En outre, l’origine de ces fibres nerveuses a été tracée rétrograde avec un traceur neural fluorescent.

Résumé

Le but de cette étude était d’examiner la distribution et l’origine du peptide gène-connexe de calcitonine (CGRP) - fibres nerveuses sensorielles immunoreactive du mater crânien de dura utilisant l’immunofluorescence, la reconstruction (3D) tridimensionnelle et la technique de tracé rétrograde. Ici, les fibres nerveuses et les vaisseaux sanguins ont été souillés utilisant l’immunofluorescence et les techniques histochimiques avec CGRP et le phalloïdine fluorescent, respectivement. La corrélation spatiale des fibres nerveuses CGRP-immuoreactive dural et des vaisseaux sanguins ont été démontrées par reconstruction 3D. Pendant ce temps, l’origine des fibres nerveuses CGRP-immunoreactive ont été détectées par technique neurale de traçage avec le fluorogold (FG) du secteur autour de l’artère méningitique moyenne (MMA) dans le mater crânien de dura au ganglion de trigeminal (TG) et aux ganglions dorsaux cervicaux (C) de racine (DRGs). En outre, les caractéristiques chimiques des neurones FG-marqués dans le TG et le DRGs ont été également examinées ainsi que CGRP utilisant de doubles immunofluorescences. Profitant de l’échantillon transparent de tout-montage et de la reconstruction 3D, on lui a montré que les fibres nerveuses CGRP-immunoreactive et les artérioles phalloidin-étiquetées fonctionnent ensemble ou formant séparément un réseau neurovascular dural dans une vue 3D, alors que les neurones FG-marqués étaient trouvés dans les branches ophtalmiques, maxillaires, et mandibulaires de TG, aussi bien que le C2-3 DRGs ipsilateral du côté de l’application de traceur dans laquelle certains des neurones FG-marqués ont présenté avec l’expression CGRP-immunoreactive. Avec ces approches, nous avons démontré les caractéristiques distributionnelles des fibres nerveuses CGRP-immunoreactive autour des vaisseaux sanguins dans le mater crânien de dura, aussi bien que l’origine de ces fibres nerveuses de TG et de DRGs. Du point de vue de la méthodologie, il peut fournir une référence valable pour comprendre la structure neurovascular compliquée du mater crânien de dura sous l’état physiologique ou pathologique.

Introduction

La dura mater crânienne est la couche la plus externe des méninges pour protéger le cerveau et contient des vaisseaux sanguins abondants et différents types de fibres nerveuses^1,2. De nombreuses études ont montré que le dura mater crânien sensibilisé peut être le facteur clé conduisant à l’apparition de maux de tête, impliquant la vasodilatation et l’innervation anormales^3,4,5. Ainsi, la connaissance de la structure neurovascular dans le mater crânien de dura est importante pour comprendre la pathogénie des maux de tê....

Protocole

Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’Institut d’acupuncture et de moxibustion de l’Académie chinoise des sciences médicales (numéro de référence D2018-09-29-1). Toutes les procédures ont été effectuées conformément au National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Douze rats mâles adultes Sprague-Dawley (poids 220 ± 20 g) ont été utilisés dans cette étude. Les animaux [numéro de licence SCXK (JING) 2017-0005] ont été fournis par les National Institutes for Food and Drug Control.

1. Innervation de la dura mater crânienne de rat

Résultats

Structure neurovasculaire de la dure-mère crânienne
Après la souillure histochimique immunofluorescente et fluorescente avec CGRP et phalloïdine, des fibres nerveuses CGRP-immunoreactive et des artérioles dural phalloïdine-marqués et des tissus conjonctifs ont été clairement démontrés dans tout le mater crânien de dura de montage entier dans un modèle 3D(figure 2C,D, E, F). Il a été montré que les fibres nerveuses cgrp-imm.......

Discussion

Dans cette étude, nous avons avec succès démontré la distribution et l’origine des fibres nerveuses CGRP-immunoreactive dans le mater crânien de dura utilisant l’immunofluorescence, la reconstruction 3D et les approches neurales de traçage avec l’anticorps CGRP et le traceur neural FG, fournissant les preuves histologiques et chimiques pour mieux comprendre le réseau neurovascular dural.

Comme on le savait, cgrp joue un rôle essentiel dans la pathogénie de la migraine^4,.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Alexa Fluor 488 âne anti-souris IgG (H+L)	Invitrogen de Thermo Fisher Scientific	A21202	Protéger de la lumière ; RRID : AB_141607
Instrument de stéréotaxie cérébrale	Narishige	SR-50
CellSens Dimension	Olympus	Version 1.1	Logiciel de microscope fluorescent
Système d’imagerie confocale	Olympus	FV1200
Fluorogold (FG)	Fluorochrome	52-9400	Protection contre la lumière
Système d’imagerie fluorescente	Olympus	BX53
Microtome de congélation	Thermo	Microm International  ; GmbH
Olympus FV10-ASW 4.2a	Olympus	Version 4.2	Système logiciel de traitement d’images confocal
Micro Drill	Saeyang Microtech	Marathon-N7
Souris anti-CGRP	Abcam	ab81887	RRID : AB_1658411
Sérum d’âne normal	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Phalloïdine 568	Moléculaire& nbsp ; Sondes	A12380	Protéger de la lumière
Photoshop et  ; Illustration	Adobe	CS6	Logiciel de retouche photo
Rabbit anti- Fluorogold	Abcam	ab153	RRID : AB_90738
Sprague Dawley	National Institutes for Food and Drug Control	SCXK (JING) 2014-0013
Superfrost plus lames de microscope	Thermo	#4951PLUS-001	25x75x1mm