Injection intravitreal et quantitation des paramètres d’infection dans un modèle de souris de l’endophtalmite bactérienne

Summary

Nous décrivons ici une méthode d’injection intravitreal et de quantitation bactérienne suivante dans le modèle de souris de l’endophtalmitis bactérien. Ce protocole peut être étendu pour mesurer les réponses immunitaires de l’hôte et l’expression bactérienne et du gène hôte.

Abstract

Les infections bactériennes intraoculaires sont un danger pour la vision. Les chercheurs utilisent des modèles animaux pour étudier les facteurs hôtes et bactériens et les voies de réponse immunitaire associées à l’infection afin d’identifier des cibles thérapeutiques viables et de tester des médicaments pour prévenir la cécité. La technique d’injection intravitreal est employée pour injecter des organismes, des drogues, ou d’autres substances directement dans la cavité vitreuse dans le segment postérieur de l’oeil. Ici, nous avons démontré cette technique d’injection pour initier l’infection dans l’œil de la souris et la technique de quantification des bactéries intraoculaires. Bacillus cereus a été cultivé dans les médias liquides d’infusion de coeur de cerveau pendant 18 heures et résuspendait à une concentration 100 unités de formation de colonie (CFU)/0.5 μL. Une souris C57BL/6J a été anesthésiée à l’aide d’une combinaison de kétamine et de xylazine. À l’aide d’un microinjecteur picolitre et d’aiguilles capillaires en verre, 0,5 μL de la suspension Bacillus a été injecté dans le milieu vitreux de l’œil de la souris. L’oeil contralatéral de commande a été injecté avec le médias stérile (contrôle chirurgical) ou n’a pas été injecté (contrôle absolu). À 10 heures après l’infection, les souris ont été euthanasiées, et les yeux ont été récoltés à l’aide de pinces chirurgicales stériles et placés dans un tube contenant 400 μL de PBS stérile et 1 mm de perles de verre stériles. Pour les ELISAs ou myeloperoxidase assays, inhibiteur de la proteinase a été ajouté aux tubes. Pour l’extraction de l’ARN, le tampon de lyse approprié a été ajouté. Les yeux ont été homogénéisés dans un homogénéiseur de tissu pendant 1-2 minutes. Les homogénéisations ont été diluées en série 10 fois dans pbs et la voie diluée sur des plaques d’agar. Le reste des homogénées ont été stockés à -80 °C pour des analyses supplémentaires. Les plaques ont été incubées pendant 24 heures et cfu par oeil a été quantifié. Ces techniques entraînent des infections reproductibles dans les yeux des souris et facilitent la quantitation des bactéries viables, la réponse immunitaire de l’hôte et l’omique de l’expression des gènes de l’hôte et des bactéries.

Introduction

L’endophtalmite bactérienne est une infection dévastatrice qui provoque une inflammation et, si elle n’est pas traitée correctement, peut entraîner une perte de vision ou de cécité. L’endophtalmite résulte de l’entrée de bactéries dans l’intérieur^{de l’œil 1,2,3,4,5}. Une fois dans l’œil, les bactéries se répliquent, produisent des toxines et d’autres facteurs nocifs, et peuvent causer des dommages irréversibles aux cellules et tissus rétiniens délicats. Les dommages oculaires peuvent également être provoqués....

Protocol

Toutes les procédures ont été effectuées à la suite des recommandations du Guide for the Care and Use of Laboratory Animals et de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. Les protocoles ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Centre des sciences de la santé de l’Université de l’Oklahoma (numéros de protocole 15-103, 18-043 et 18-087).

1. Aiguilles de verre stériles

1. Allumez le tire-pipette à aiguilles.
2. Réglez le bouton chauffage jusqu’à ce que l’écran affiche 1....

Results

La génération d’un inoculum reproductible et l’exactitude de la procédure d’injection intravitreal sont des étapes clés dans le développement de modèles d’endophtalmite microbienne. Ici, nous avons démontré la procédure d’injection intravitreal utilisant Gram-positive Bacillus cereus. Nous avons injecté 100 CFU/0,5 μL de B. cereus dans le milieu vitreux de cinq souris C57BL6. Après 10 h postinfection, nous avons observé la croissance intraoculaire de B. cereus à approximativement 1.8 x 10^5.......

Discussion

Même avec la disponibilité d’antibiotiques puissants, de médicaments anti-inflammatoires et de chirurgie vitrectomie, l’endophtalmite bactérienne peut aveugler un patient. Les études cliniques ont été utiles dans l’étude de l’endophtalmite; cependant, les modèles expérimentaux de l’endophtalmite fournissent des résultats rapides et reproductibles qui peuvent être traduits au progrès dans la norme de soin, ayant pour résultat de meilleurs résultats visuels pour des patients.

Le volume vitreux d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-20 et micro ; Pipette L	RANIN	L0696003G	NA
37OC Incubateur	Fisher Scientific	11-690-625D	NA
Bacto Brain Heart Infusion	BD	90003-032
NA Micro-injecteur de cellules	MicroData Instrument, Inc.	PM2000	NA
Pince à pointe fine	Thermo Fisher Scientific	12-000-122	NA
Perles de verre 1,0 mm	BioSpec	11079110	NA
Agitateur d’incubateur	New Brunswick Scientific	NB-I2400	NA
Pipettes microcapillaires 5 Microlitres	Kimble	71900-5
NA Micro-pipette Beveler	Sutter Instrument Co.	BV-10	NA
Microscope Axiostar Plus	Zeiss		NA
Microscope OPMI Lumera	Zeiss		NA
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	Model 607	NA
Pipette multicanaux 30-300 µ ; L	Biohit	15626090	NA
Pipette multicanaux 5-100 & micro ; L	Biohit	9143724	NA
Extracteur d’aiguille/pipette	Kopf	730	NA
PBS	GIBCO		Inhibiteur
protéase de	Cocktail Roche	4693159001	Pince à
action inverse	Katena	K5-8228	NA