Cytométrie en flux à haute dimensionnalité pour l’analyse de la fonction immunitaire de tissus implantaires disséqués

Summary

L’isolement de cellules à partir d’implants disséqués et leur caractérisation par cytométrie en flux peuvent contribuer de manière significative à la compréhension du schéma de réponse immunitaire contre les implants. Cet article décrit une méthode précise pour l’isolement de cellules d’implants disséqués et leur coloration pour l’analyse par cytométrie en flux.

Abstract

Le succès de l’implantation d’un tissu cultivé en laboratoire ou d’un dispositif médical chez un individu dépend de la réponse immunitaire de l’hôte receveur. Si l’on considère un implant comme un corps étranger, une réponse immunitaire hostile et dérégulée peut entraîner le rejet de l’implant, tandis qu’une réponse régulée et la récupération de l’homéostasie peuvent conduire à son acceptation. L’analyse des microenvironnements d’implants disséqués dans des contextes in vivo ou ex vivo peut aider à comprendre le modèle de réponse immunitaire, ce qui peut finalement aider à développer de nouvelles générations de biomatériaux. La cytométrie en flux est une technique bien connue pour caractériser les cellules immunitaires et leurs sous-ensembles en fonction de leurs marqueurs de surface cellulaire. Cette revue décrit un protocole basé sur le découpage manuel en dés, la digestion enzymatique et la filtration à travers un tamis cellulaire pour l’isolement de suspensions cellulaires uniformes à partir de tissus implantaires disséqués. De plus, un protocole de coloration par cytométrie en flux multicolore a été expliqué, ainsi que des étapes pour les réglages initiaux du cytomètre afin de caractériser et de quantifier ces cellules isolées par cytométrie en flux.

Introduction

Les progrès dans le domaine de la médecine ont conduit à l’utilisation fréquente de matériaux implantés pour soutenir la fonction ou la repousse des tissus endommagés ^1,2. Il s’agit notamment de dispositifs tels que les stimulateurs cardiaques, les implants cosmétiques reconstructifs et les plaques orthopédiques utilisées pour la fixation des fractures osseuses ^3,4. Cependant, les matériaux utilisés pour fabriquer ces implants et les endroits où ils sont implantés jouent un rôle important dans la détermination du succès de ces implants

Protocol

REMARQUE : La figure 1 donne un aperçu du protocole de cytométrie en flux.

1) Préparation des réactifs

1. Préparer les milieux pour la dilution des enzymes et pour la culture tissulaire.
   1. Ajouter 5 mL de solution tampon d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES) dans 500 mL de milieu RPMI et bien agiter. Conservez le milieu à 4 °C jusqu’à une nouvelle utilisation.
2. Calculez le volume de la solution enzymatique.
   REMARQUE : Le volume de la solution enzymatique est le volume du milieu contenant les enzymes (collagénase et DNase I) qui seront nécessaires pou....

Results

Le processus de développement de panels de cytométrie en flux pour l’analyse immunitaire repose souvent sur la comparaison des résultats avec les données existantes et la littérature dans le domaine. La connaissance de la façon dont les populations peuvent se présenter en cytométrie en flux est essentielle pour une interprétation correcte des données. Quoi qu’il en soit, les populations et les types de cellules peuvent apparaître différemment dans différents tissus, il faut donc s’attendr.......

Discussion

Cette revue décrit une méthodologie détaillée pour isoler les cellules des implants de biomatériaux afin d’obtenir une suspension cellulaire uniforme. De plus, un protocole détaillé a été fourni pour la coloration de la suspension cellulaire pour la cytométrie en flux multicolore, ainsi que les étapes de configuration d’un cytomètre en flux pour des résultats optimaux. Les méthodes d’isolement cellulaire peuvent impliquer plusieurs étapes, utilisant souvent la dissection manuelle des tissus suivie d’une digestion enzymat.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubes coniques de 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
Plaque à 6 puits	Fisher Scientific	07-000-646
BD Brilliant Stain Buffer Plus	BD Biosciences	566385
BD Cytofix	BD Biosciences	554655	Pour fixer uniquement les cellules
Albumine sérique bovine	Millipore Sigma	A7906	Pour préparer le FACS tampon de coloration
CD11b AF700	Biolegend	101222	Clone : M1/70
CD11c PerCP/Cy5.5	Biolegend	117325	Clone : N418
CD197 PE/Dazzle594	Biolegend	120121	Clone : 4B12
CD200R3 APC	Biolegend	142207	Clone : Ba13
CD206 PE	Biolegend	141705	Clone : C068C2
CD45 BUV737	BD Biosciences	612778	Clone : 104/A20
CD86 BUV395	BD Biosciences	564199	Clone : GL1
CD8a BV421	Biolegend	100737	Clone : 53-6.7
Comp Bead anti-souris	BD Biosciences	552843	Pour le contrôle de compensation
DNase I	Millipore Sigma	11284932001	Déoxyribonucléase pancréatique bovine I (DNase I)
F4/80 PE/Cy7	Biolegend	123113	Clone : BM8
Fc Block	Biolegend	101301	Clone : 93
Kit de solution de fixation/perméabilisation	BD Biosciences	554714	Pour la fixation et la perméabilisation des cellules.
Tampon HEPES	Thermo Fisher	15630080	Tampon pour compléter les milieux cellulaires
Liberase	Millipore Sigma	5401127001	Mélange de Collagenase I et de Collagenase II
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher	L23105	Teinture de viabilité
Ly6c AF488	Biolegend	128015	Clone : HK1.4
Ly6g BV510	Biolegend	127633	Clone : 1A8
MHCII BV786	BD Biosciences	742894	Clone : M5/114.15.2
Tampon phosphate salin	Thermo Fisher	D8537
RPMI	Thermo Fisher	11875176	Milieu de culture cellulaire
Siglec F BV605	BD Biosciences	740388	Clone : E50-2440
V-bottom 96			puits