Ici, nous décrivons, comparons, et contrastons deux techniques différentes pour le comptage précis de follicule des tissus ovariens fixes de souris.
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Article de méthode
Dénombrement précis des follicules chez les ovaires de souris adultes
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les mammifères femelles se reproduisant sexuellement naissent avec tout leur approvisionnement en ovocytes tout au long de leur vie. Les ovocytes immatures et tranquilles se trouvent dans les follicules primordiaux, l’unité de stockage de la lignée germinale femelle. Ils ne sont pas renouvelables, donc leur nombre à la naissance et le taux de perte qui en résulte dictent en grande partie la durée de vie fertile des femelles. Une quantification précise du nombre de follicules primordiaux chez les femmes et les animaux est essentielle pour déterminer l’impact des médicaments et des toxiques sur la réserve ovarienne. Elle est également nécessaire pour évaluer la nécessité et le succès des techniques existantes et émergentes de préservation de la fertilité. Actuellement, aucune méthode n’existe pour mesurer avec précision le nombre de follicules primordiaux comprenant la réserve ovarienne chez les femmes. En outre, il n’est souvent pas possible d’obtenir du tissu ovarien de gros animaux ou d’espèces en voie de disparition à des fins expérimentales. Ainsi, les souris sont devenues un modèle essentiel pour de telles études, et la capacité d’évaluer le nombre primordial de follicules dans les ovaires entiers de souris est un outil essentiel. Cependant, les rapports du nombre absolu de follicules dans les ovaires de souris dans la littérature sont très variables, ce qui rend difficile la comparaison et/ou la réplication des données. Cela est dû à un certain nombre de facteurs, y compris la souche, l’âge, les groupes de traitement, ainsi que les différences techniques dans les méthodes de comptage utilisées. Dans cet article, nous fournissons un guide d’instruction étape par étape pour la préparation des sections histologiques et le comptage des follicules primordiaux dans les ovaires de souris en utilisant deux méthodes différentes: [1] stéréologie, qui repose sur la technique de fractionnement / dissecteur optique; et [2] la technique du comptage direct. Certains des principaux avantages et inconvénients de chaque méthode seront mis en évidence afin que la reproductibilité puisse être améliorée sur le terrain et pour permettre aux chercheurs de choisir la méthode la plus appropriée pour leurs études.
Introduction
Les ovocytes immatures et méiotically-arrêtés stockés dans les follicules primordiaux dans l’ovaire sont l’unité de stockage pour la lignée germinale femelle et comprennent la réserve ovarienne à vie d’un individu. Le nombre de follicules primordiaux diminue naturellement avec l’âgede 1, ou bien, peut être prématurément épuisé à la suite d’une exposition à des produits chimiques exogènes, y compris certains produits pharmaceutiques et toxiques environnementaux dans l’air, les aliments et l’eau2. Étant donné que le nombre de follicules primordiaux est fini, la quantité et la qualité des follicules présents dans l’ovaire d....
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Protocole
Des ovaires ont été prélevés sur des souris femelles C57BL6J. Toutes les procédures et expériences sur les animaux ont été effectuées conformément au code de pratique australien NHMRC pour le soin et l’utilisation des animaux et approuvées par le comité d’éthique animale de la plate-forme de recherche sur les animaux Monash.
REMARQUE: Un agent chimiothérapeutique montré pour épuiser les ovocytes primordiaux de follicule, tel que déterminé utilisant la stéréologie11 et les comptes directs12,13 a été employé dans ce rapport pour comparer les deux méthodes de co....
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Résultats
Un modèle bien caractérisé d’épuisement des follicules a été utilisé, dans lequel de jeunes souris femelles adultes ont reçu une dose unique de chimiothérapie au cyclophosphamide, ou un contrôle de véhicule salin (n = 5/groupe) et les deux ovaires ont été récoltés de chaque animal après 48 heures. Un ovaire par animal a été préparé comme décrit à l’étape 1 pour chacune des deux méthodes : stéréologie ou comptage direct. L’ovaire gauche et droit de chaque animal a été assigné au hasard à chaque groupe. Ces données montren.......
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Discussion
Cet article fournit un protocole étape par étape pour la technique de référence pour énumérer les follicules primordiaux de souris, la stéréologie, et la méthode plus généralement employée de compter direct de follicule. Le traitement de chimiothérapie a été employé pour comparer et contraster les résultats obtenus à partir de ces deux méthodes différentes dans l’ovaire gauche et droit du même animal. Les deux méthodes ont indiqué la variabilité inter-animale élevée dans les nombres primordiaux de follicule. Un épuisemen.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été rendu possible grâce au soutien de l’infrastructure opérationnelle du gouvernement de l’État de Victoria et au gouvernement australien NHMRC IRIISS et soutenu par le financement du National Health and Medical Research Council (ALW #1120300) et de l’Australian Research Council (KJH #FT190100265). Les auteurs tiennent à souligner le soutien technique de la plateforme de recherche sur les animaux Monash, de la plateforme d’histologie Monash et de l’installation de micro-imagerie Monash.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1-Butanol (HPLC) | Fisher Chemical | #A383-1 | |
| Alcool acide | Amber Scientific | #ACDL | |
| Bouin' s fixateur | Sigma-Aldrich | #HT10132 | Acide picrique 0,9 % (p/v), formaldéhyde 9 % (v/v), acide acétique 5 % (p/v) |
| Cyclophosphamide | Sigma-Aldrich | #C0768-5G | |
| Dibutylphtalate Polystyrène xylène (DPX) | Sigma-Aldrich | #06522 | |
| Ethanol | Amber Scientific | #ETH | Ethanol 100 % |
| Micro Feather scalpel ophtalmique avec manche en aluminium | Designs for Vision | #FEA-745-SR | Lame de plume pour dissections (voir la figure 1) |
| Fixateur de formol | Australian Biostain | #ANBFC | |
| Lamelle en verre | Thermo Scientific | #MENCS22501GP | 22 mm x 50 mm |
| Résine glycométhacrylate RM2165 microtome | Leica Microsystems | #RM2165 | |
| Glycolméthacrylate DPX | *fabriqué en interne | *Mélanger 1,5 L de xylène ; 800 g de granulés de polystyrène ; 100 ml de phtalate de dibutyle pendant 3 semaines | |
| Histolene | Trajan | #11031 | |
| Mayer' s haematoxylin | Amber Scientific | #MH | |
| Microscope Olympus BX50 | Olympus | #BX50 | Microscope à fond clair équipé d’un objectif à immersion 10x sec et 100x à l’huile (ouverture numérique 1.3) |
| Huile d’immersion Olympus type-F | Olympus | #IMMOIL-F30CC | |
| Olympus TH4-200 Source lumineuse Olympus | #TH4-200 | ||
| Cire de paraffine | Sigma-Aldrich | #03987 | |
| Acide périodique | Trajan | #PERI1 % | Acide périodique 1 % |
| Microtome rotatif CUT 4060 | MicroTec | #4060R/F | Utilisé pour couper les sections de paraffine |
| Schiff' s réactif | Trajan | #SCHF | |
| Scott’s eau du robinet | Amber Scientific | #SCOT | Carbonate de potassium, sulfate de magnésium, eau |
| StereoInvestigator Système stéréologique | MBF Bioscience | Comprend le logiciel StereoInvestigator, l’unité multi-contrôle, la platine automatique et le joystick | |
| Lames de microscope Superfrost | Thermo Scientific | #MENSF41296SP | 1 mm, 72 pcs |
| Technovit 7100 Système d’enrobage en plastique | Emgrid Australie | #64709003 | 500 mL/5 x 1 g/40 mL |
| Technovit 3040 jaune | Emgrid Australie | #64708805 | 100 g/80 mL |
Références
- Stringer, J. M., Winship, A., Liew, S. H., Hutt, K. The capacity of oocytes for DNA repair. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2777-2792 (2018).
- Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J.
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