Détermination rapide de l’affinité anticorps-antigène par photométrie de masse

Summary

Nous décrivons une approche à molécule unique aux mesures d’affinité d’antigène-anticorps utilisant la photométrie de masse (MP). Le protocole basé sur mp est rapide, précis, utilise une très petite quantité de matériel, et ne nécessite pas de modification des protéines.

Abstract

Les mesures de la spécificité et de l’affinité des interactions antigène-anticorps sont d’une importance cruciale pour les applications médicales et de recherche. Dans ce protocole, nous décrivons la mise en œuvre d’une nouvelle technique à molécule unique, la photométrie de masse (MP), à cette fin. MP est une technique sans étiquette et sans immobilisation qui détecte et quantifie les masses moléculaires et les populations d’anticorps et de complexes anticorps à un niveau d’une seule molécule. MP analyse l’échantillon d’antigène-anticorps en quelques minutes, permettant la détermination précise de l’affinité contraignante et fournissant simultanément des informations sur la stoichiométrie et l’état oligomérique des protéines. Il s’agit d’une technique simple et simple qui ne nécessite que des quantités picomoles de protéines et pas de consommables coûteux. La même procédure peut être utilisée pour étudier la liaison protéines-protéines pour les protéines dont la masse moléculaire est supérieure à 50 kDa. Pour les interactions protéiques multivalentes, les affinités de plusieurs sites de liaison peuvent être obtenues en une seule mesure. Cependant, le mode de mesure à molécule unique et l’absence d’étiquetage imposent certaines limites expérimentales. Cette méthode donne les meilleurs résultats lorsqu’elle est appliquée à des mesures d’affinités d’interaction sous-micromolaire, d’antigènes d’une masse moléculaire de 20 kDa ou plus, et d’échantillons de protéines relativement purs. Nous décrivons également la procédure d’exécution des étapes de montage et de calcul requises à l’aide d’un logiciel d’analyse de données de base.

Introduction

Les anticorps sont devenus des outils omniprésents de la biologie moléculaire et sont largement utilisés dans les applications médicales et de recherche. En médecine, ils sont d’une importance cruciale dans le diagnostic, mais leurs applications thérapeutiques sont également en expansion et de nouvelles thérapies à base d’anticorps sont constamment développés^1,2,3,4. Les applications scientifiques des anticorps incluent beaucoup de techniques indispensables de laboratoire telles que l’immunofluorescence^5,l’immunopréci....

Protocol

1. Préparer les chambres d’écoulement

1. Nettoyez les couvertures en verre
   1. À l’aide de bouteilles de lavage à l’eau distillée, à l’éthanol et à l’isopropanol, rincez les couvercles de 24 mm x 50 mm dans l’ordre suivant : eau, éthanol, eau, isopropanol, eau. Séchez les couvertures avec un jet d’azote propre. Il est important de rincer les coverslips de haut en bas, en tenant le coin inférieur avec des forceps à pointe molle. Séchez le coverslip dans la même direction pour éviter de transférer la contamination par les forceps (Figure 2A).
   2. De même, rincez les couvercles de 24 mm x 24 mm avec de l’eau distillée, de l....

Results

Nous avons précédemment examiné l’interaction de la α-thrombine humaine (HT) et de l’anticorps anti-thrombine anti-humain de souris (AHT) utilisant l’essai basé sur MP^11. Étant donné que la masse moléculaire du HT (37 kDa) est inférieure à la limite de détection de 40 kDa, la concentration maximale de l’échantillon peut dépasser la limite de concentration de 50 nM MP sans affecter négativement la résolution des distributions de masse. L’expérience a été planifiée comme une série de titration avec .......

Discussion

Le protocole basé sur la photométrie de masse décrit ici fournit une méthode rapide et précise de mesure des affinités de liaison antigène-anticorps. L’analyse mp utilise une très petite quantité de matériel, et des informations supplémentaires , y compris la stoichiométrie, l’oligomérisation et la pureté , peuvent être évaluées à partir des mêmes données (figure 5). Sans modifications, cette méthode s’applique aux mesures des constantes de dissociation d’environ 5 nM à 500 nM, et aux molécu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AcquireMP	Refeyn		MP logiciel de collecte de données
Anti-thrombine	humaine Haematologic Technologies	AHT-5020	RRID : AB_2864302
Applicateurs à embout en coton	Thorlabs	CTA10	cotons-tiges pour le nettoyage des lentilles
Lamelles de protection 24x24 mm	Globe Scientific	1405-10
Plaques de protection 24x50 mm	Fisher Scientifique	12-544-EP
DiscoverMP	Refeyn		MP logiciel de traitement de données
Forceps	Microscopy Electron Sciences	78080-CF	Pince à embout souple pour la manipulation des lamelles
Hématologique	humaine &alpha ;-thrombine	HCT-0020
Huile d’immersion	Thorlabs	MOIL-30
Isopropanol	Alfa Aesar	36644
Microsoft Excel	Microsoft		tableur
OneMP	Refeyn		Instrument de photométrie de masse
Origin	OriginLab		logiciel de graphisme scientifique
PBS	Corning	46-013-CM	10x stock
Filtre à seringue	Millipore	SLGSR33SS	tampon et échantillon filtrage