Identification des inhibiteurs de l’EGFR et du SRA à l’aide de Caenorhabditis elegans

Summary

Le nématode génétiquement traitable Caenorhabditis elegans peut être utilisé comme modèle simple et peu coûteux pour la découverte de médicaments. Décrit ici est un protocole pour identifier les thérapies anticancéreux qui inhibent la signalisation en aval des protéines RAS et EGFR.

Abstract

Les changements dans la localisation de la membrane plasmique du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) et de son effecteur en aval RAS ont été impliqués dans plusieurs maladies, y compris le cancer. Le nématode libre C. elegans possède une cascade de signaux MAP EGFR-RAS-ERK évolutive et fonctionnellement conservée qui est centrale pour le développement de la vulve. Gain de mutations fonctionnelles dans l’homologue RAS LET-60 et l’homologue EGFR LET-23 induisent la génération de pseudovulva ectopique non fonctionnelle visible le long de la paroi ventrale du corps de ces vers. Auparavant, il a été démontré que le phénotype multivulval (Muv) de ces vers était inhibé par de petites molécules chimiques. Nous décrivons ici un protocole d’utilisation du ver dans un test à base de liquide pour identifier les inhibiteurs qui abolissent les activités des protéines EGFR et RAS. En utilisant ce test, nous montrons que la R-fendiline, un inhibiteur indirect de K-RAS, supprime le phénotype Muv exprimé dans les vers mutants let-60(n1046) et let-23(sa62). Le test est simple, peu coûteux, ne prend pas de temps à mettre en place et peut être utilisé comme plate-forme initiale pour la découverte de thérapies anticancéreux.

Introduction

Les voies cellulaires qui régulent les événements de développement au sein des organismes sont hautement conservées chez tous les métazoaires. L’une de ces voies est la cascade de signalisation de la protéine kinase activée par le mitogène EGFR-RAS-ERK (MAPK) qui est une voie critique qui régit la prolifération, la différenciation, la migration et la survie des cellules^1,2. Les défauts de cette voie de signalisation peuvent conduire à des états pathologiques ou pathologiques tels que le cancer. Le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) s’est avéré être fortement exprimé dans les tumeurs humaines....

Protocol

1. Préparation de plaques de milieu de croissance des nématodes (NGM)

1. Ajouter 2,5 g de peptone et 3 g de NaCl à 970 mL d’eau désionisée contenue dans une fiole d’Erlenmeyer de 2 L. Remuer le contenu à l’aide d’une barre d’agitation magnétique. Par la suite, ajouter 20 g de gélose à la fiole. Autoclaver le contenu de la fiole à 121 °C et une pression de 15 lb/po² pendant 30 min. Après la stérilisation, placer la fiole sur une plaque d’agitation et laisser refroidir le milieu jusqu’à ce que la température atteigne 50 °C.
2. Pour préparer les plaques NGM, ajoutez les réactifs suivants au milieu refroidi : 25 mL de tampon phosphate de potassium....

Results

Nous démontrons d’abord que la R-fendiline est capable de supprimer le phénotype Muv dans la souche mutante let-60(n1046) par rapport aux vers traités par DMSO. Nos données montrent que la R-fendiline est capable de bloquer le phénotype Muv dans le let-60(n1046) de manière dose-dépendante(Figure 2A,B). Cependant, une non-inversion du phénotype Muv a été observée dans la souche mutante nulle lin-1 en réponse à l’augmentation des concentrations de R-.......

Discussion

Les tests que nous décrivons à l’aide du ver sont simples et peu coûteux pour identifier les inhibiteurs de la fonction EGFR et RAS. C. elegans est un modèle attrayant pour la découverte de médicaments car il est facile à cultiver en laboratoire en raison du cycle de vie court (3 jours à 20 ° C) et de la capacité de générer un grand nombre de larves. Plus important encore, la voie EGFR-RAS-ERK MAPK est conservée de manière évolutionnaire et fonctionnelle avec des mammifères fournissant un système génétiquement t.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
forts et produits chimiques
;	Millipore Sigma  ;	A9539-50G
Bacto Peptone  ;	Fisher Scientific	DF0118-17-0
BD Difco Agar  ;	Fisher Scientific	DF0145-17-0
BD Difco LB Bouillon	Fisher Scientific	DF0446-17-3
Chlorure de calcium	Fisher Scientific	BP510-500
Cholestérol	Fisher Scientific	ICN10138201 Sulfate de
magnésium	Fisher Scientific	BP213-1
Nystatine	Acros organics
Phosphate de potassium dibasique	Fisher Scientific	BP363-500
Phosphate de potassium monobasique	Fisher Scientific	BP362-500
R-Fendiline			synthétisé commercialement (qualité pharmaceutique)
Azoture de sodium	Millipore Sigma  ;	S2002-25G
Chlorure de sodium  ;	Fisher Scientific	BP358-1
Hydroxyde de sodium	Fisher Scientific	SS266-1
Hypochlorite de sodium à 8,25 %  ;			Eau de Javel
Phosphate de Sodium Dibasique  ;	Fisher Scientific	BP332-500
Sulfate de streptomycine  ;	Fisher Scientific	BP910-50
(&minus ;)-Chlorhydrate de tétramisole	Millipore Sigma  ;	L9756
UO126 (inhibiteur de MEK)	Millipore Sigma  ;	19-147
Consommables  ;
15mL Tubes à centrifuger coniques stériles en polypropylène  ;	Fisher Scientific	12-565-269
50 ml	Fisher Scientific	12-565-271
Pipettes sérologiques jetables en polystyrène 10 ml	Fisher Scientific	07-200-574
Pipettes sérologiques jetables en polystyrène 25 ml	Fisher Scientific	07-200-575
n° 1,5 x 18 mm	Fisher Scientific	12-541A
Boîte de Pétri avec couvercle transparent (60 x 15 mm)	Boîtes	de
avec couvercle transparent (100 x 15 mm)		en verre ordinaire Fisher Scientific FB0875712
(75 x 25 mm)	Fisher Scientific	12-544-4
Plaques de culture tissulaire à 12 puits	Fisher Scientific	50-197-4804
fort  ;
Prism	Graphpad
Souches bactériennes
E. coli OP50
Worm Strains
Strain	Genotype	Transgene	Source
MT2124   ;	let-60(n1046) IV.		CGC
MT7567	lin-1(sy254) IV.		CGC
PS1839	let-23(sa62) II.		CGC