Article de méthode

Un petit ARN non codant MicC contribue à la virulence des protéines de la membrane externe chez Salmonella enteritidis

DOI :

10.3791/61808

⸱

27 janvier 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, 2Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, 3Department of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Beijing Agricultural Vocational College

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un système de recombinaison médiée par λ-Red a été utilisé pour créer un mutant de délétion d’un petit micC à ARN non codant.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un petit ARN non codant (ARNs) est un nouveau facteur pour réguler l’expression des gènes au niveau post-transcriptionnel. Une sorte d’ARNs MicC, connu chez Escherichia coli et Salmonella Typhimurium, pourrait réprimer l’expression des protéines de la membrane externe. Pour étudier plus avant la fonction de régulation du micC chez Salmonella Enteritidis, nous avons cloné le gène micC dans la souche 50336 de Salmonella Enteritidis, puis construit le mutant 50336Δ micC par le système de recombinaison à base de λ Red et le mutant 50336Δ micC/p micC complété portant le plasmide recombinant pBR322 exprimant micC. Les résultats de la qRT-PCR ont démontré que la transcription de l’ompD dans 50336Δ micC était 1,3 fois plus élevée que celle de la souche de type sauvage, tandis que la transcription de ompA et ompC dans 50336ΔmicC était 2,2 fois et 3 fois plus élevée que celles de la souche de type sauvage. Ceux-ci indiquent que micC réprime l’expression de ompA et ompC. Dans l’étude suivante, la pathogénicité de 50336ΔmicC a été détectée par des souris Balb/c âgées de 6 semaines et des poulets âgés de 1 jour. Le résultat a montré que la DL50 de la souche de type sauvage 50336, les mutants 50336Δ micC et 50336Δ micC/p micC pour les souris Balb/c âgées de 6 semaines étaient respectivement de 12,59UFC, 5,01 UFC et 19,95 UFC. La DL 50 des souches pour les poulets âgés de 1 jour était de 1,13 x 109 UFC, 1,55 x 10 8 UFC et2,54 x 10 8 UFC, respectivement. Il a indiqué que la délétion de micC améliorait la virulence de S. Enteritidis chez la souris et le poulet en régulant l’expression des protéines de la membrane externe.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les petits ARN non codants (ARNs) ont une longueur de 40 à 400 nucléotides, qui ne codent généralement pas pour des protéines mais pourraient être transcrits indépendamment dans les chromosomes bactériens 1,2,3. La plupart des ARNs sont codés dans les régions intergéniques (IGR) entre les régions codant pour les gènes et interagissent avec les ARNm cibles par des actions d’appariement de bases, et régulent l’expression des gènes cibles au niveau post-transcriptionnel 4,5. Ils jouent un rôle régulateur important dans le métabolisme des substances, la synthèse des protéines de la membrane externe, la détection du quorum et l’expression des gènes de virulence5.

MicC est un petit transcrit d’ARN de 109 nucléotides présent dans Escherichia coli et Salmonella enterica sérovar Typhimurium, qui pourrait réguler l’expression de plusieurs protéines de la membrane externe telles que OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 et Omp36 6,7,8,9. MicC régule l’expression de l’OmpC en inhibant la liaison du ribosome au leader de l’ARNm ompC in vitro et nécessite le chaperon d’ARN Hfq pour sa fonction chez Escherichia coli6. Chez Salmonella Typhimurium, MicC réduit au silence l’ARNm ompD via un duplex d’ARN ≤12-bp dans la séquence codante (codons 23-26) puis déstabilise l’ARNm endonucléolytique7. Ce processus de régulation est assisté par la protéine chaperonne Hfq10. L’OmpC est une protéine membranaire externe abondante que l’on croyait importante dans les environnements où les concentrations de nutriments et de toxines étaient élevées, comme dans l’intestin6. La porine OmpD est la protéine membranaire externe la plus abondante chez Salmonella Typhimurium et représente environ 1% de la protéine cellulaire totale11. L’OmpD est impliqué dans l’adhérence aux macrophages humains et aux cellules épithéliales intestinales12. MicC réprime également l’expression des porines OmpC et OmpD. On pense que MicC peut réguler la virulence. Pour explorer de nouveaux gènes cibles régulés par MicC et étudier la fonction de régulation de la virulence de micC, nous avons cloné le gène micC dans la souche 50336 de Salmonella Enteritidis (SE), puis construit le mutant 50336ΔmicC et le mutant complété 50336ΔmicC/p micC. De nouveaux gènes cibles ont été criblés par qRT-PCR. La virulence de 50336ΔmicC a été détectée par des souris et des infections de poulet.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les expériences ont été menées conformément au Guide sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire du Conseil national de recherches. Le comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Yangzhou a approuvé toutes les expériences et procédures appliquées aux animaux (SYXK2016-0020).

1. Souches bactériennes, plasmides et conditions de culture

  1. Utilisez les bactéries et les plasmides énumérés dans le tableau 1.
  2. Culture de bactéries dans un bouillon LB ou sur des plaques de gélose LB à 37 °C, en présence de 50 μg/mL d’ampicilline (Amp), le cas échéant.
  3. Des souches de culture contenant des plasmides sensibles à la température sont utilisées pour la construction de mutants de délétion à 30 °C.

2. Cloner le gène micC de S. Souche 50336 d’Enteritidis

  1. Basé sur la séquence amont et aval du gène micC de S. La souche SL1344 de Typhimurium conçoit les amorces vmicC-F et vmicC-R pour amplifier un fragment contenant le gène micC par PCR en utilisant l’ADN génomique SE50336 comme modèle.
  2. Mélanger 5 μL de tampon réactionnel PCR 10x, 2 μL de mélange dNTP (2,5 mM), 1 μL d’amorces vmicC-F et vmicC-R, respectivement, 5 μL de matrice, 1 μL d’ADN polymérase Taq et 35 μL deddH2Oensemble pour la PCR.
  3. Utiliser les conditions de réaction PCR suivantes : prédénaturation à 94 °C pendant 4 min ; 94 °C pendant 30 s, 53 °C pendant 1 min, 72 °C pendant 1 min pendant 25 cycles, et extension à 72 °C pendant 10 min.
  4. Séquencer le produit PCR pour obtenir la séquence du gène micC .

3. Construction du mutant de délétion micC

NOTA : Le mutant micC-négatif de la souche 50336 de Salmonella Enteritidis a été construit en utilisant la recombinaison médiée par λ-Red comme décrit précédemment13,14. Les amorces utilisées sont énumérées dans le tableau 2.

  1. Amplifier la cassette de chloramphénicol contenant des fragments d’homologie du gène micC .
    1. Concevoir des amorces micC-F et micC-R pour amplifier la cassette de chloramphénicol (Cm) à partir du plasmide pKD3, y compris des extensions d’homologie de 50 pb à partir des 5' et 3' du gène micC .
    2. Extrayez le plasmide pKD3 comme modèle de PCR.
    3. Mélanger 5 μL de tampon réactionnel PCR 10x, 2 μL de mélange dNTP (2,5 mM), 1 μL d’amorces micC-F et micC-R, respectivement, 5 μL de matrice, 1 μL d’ADN polymérase Taq et 35 μL deddH2Oensemble comme mélange réactionnel PCR
    4. Amplifier la cassette Cm avec les conditions de réaction PCR suivantes : prédénaturation à 94 °C pendant 4 min ; 94 °C pendant 1 min, 52 °C pendant 1 min, 72 °C pendant 1 min pendant 10 cycles; 94 °C pendant 1 min, 63 °C pendant 1 min, 72 °C pendant 1 min pendant 25 cycles, et extension à 72 °C pendant 10 min.
    5. Détecter la taille du produit PCR par électrophorèse sur gel d’agarose. Purifier et récupérer le produit PCR avec le kit de récupération de gel d’ADN, et déterminer la concentration d’ADN par spectrophotomètre.
      ATTENTION : La PCR doit être réalisée deux fois. Le premier produit de PCR a été dilué dans un rapport de 1:200 et utilisé comme matrice pour la PCR secondaire, afin d’éliminer l’interférence d’une recombinaison ultérieure par le plasmide pKD3.
  2. Construire la 1èresouche recombinante 50336ΔmicC::cat
    1. Mélanger uniformément 100 μL de cellules compétentes SE50336 avec 5 μL de plasmide pKD46 et incuber sur de la glace pendant 30 min. Choc thermique du mélange ci-dessus à 42 °C pendant 90 s et transfert rapide du mélange dans la glace pendant 2 min pour transformer le plasmide pKD46 en SE50336. Cribler les colonies positives en les cultivant pendant la nuit à 30 °C sur une plaque résistante à l’ampère (50 μg/mL).
    2. Ajouter 30 mM de L-arabinose à la culture liquide SE50336/pKD46 et induire l’expression de la recombinase par une culture d’agitation à 30 °C pendant 1 h. Ensuite, préparez les cellules compétentes.
    3. Mélanger 100 ng de produit PCR purifié (étape 3.1) et 40 μL de cellules compétentes SE50336/pKD46 dans une coupelle à chocs électriques (p. ex., Bio-Rad). Effectuer la transformation des chocs électriques avec les paramètres de tension 1,8 kV, impulsion 25 μF et résistance 200 Ω.
    4. Après électrotransformation, transférer le mélange dans 1 mL de milieu SOC et une culture d’agitation à 150 rpm et 30 °C pendant 1 h. Ensuite, étaler le mélange sur une plaque LB résistante à Cm (34 μg/mL) et la cultiver à 37 °C pendant la nuit pour dépister la colonie positive.
    5. Culture de la colonie positive ci-dessus à 42 °C pendant 2 h. Cribler la colonie sensible à l’Amp (50 μg/mL) mais résistante au Cm (34 μg/mL) à 37 °C pendant la nuit pour obtenir la 1ère souche recombinante sans pKD46.
  3. Identifier la 1ère souche recombinante 50336ΔmicC::Cat.
    1. Extraire l’ADN génomique 50336ΔmicC::Cat comme modèle de PCR. Utiliser les mêmes composants de réaction PCR qu’à l’étape 2.1. Effectuer la réaction PCR dans les mêmes conditions qu’à l’étape 2.1.
    2. Détecter la taille du produit PCR par électrophorèse sur gel d’agarose et séquencer le produit PCR.
  4. Construire le mutant de suppression 50336ΔmicC.
    1. Électroporate 100 ng de plasmide pCP20 dans 40 μL de cellules compétentes 50336ΔmicC::Cat avec les paramètres de tension 1,8 kV, impulsion 25 μF et résistance 200 Ω, transformants positifs sur écran sur plaque résistante à l’amplificateur (50 μg/mL) et au Cm (34 μg/mL) à 30 °C.
    2. Transférer au-dessus des transformants positifs en LB non résistants et les cultiver pendant une nuit à 42 °C, puis isoler les colonies individuelles sur une plaque LB à 37 °C. Sélectionnez la colonie sensible à la fois à Amp et à Cm. Ce mutant est le mutant de délétion micC SE50336ΔmicC.
    3. Vérifiez 50336ΔmicC par PCR.
      1. Extraire l’ADN génomiquemicC 50336Δ comme modèle de PCR. Mélanger 5 μLof 10x tampon réactionnel PCR, 2 μL de mélange dNTP (2,5 mM), 1 μL d’amorce vmicC-F, 1 μL d’amorce vmicC-R, 5 μL de matrice, 1 μL d’ADN polymérase Taq et 35 μL deddH2Oensemble pour la PCR.
      2. Utiliser les conditions de réaction PCR suivantes : prédénaturation à 94 °C pendant 4 min ; 94 °C pendant 30 s, 53 °C pendant 1 min, 72 °C pendant 1 min pendant 25 cycles, et extension à 72 °C pendant 10min.

4. Construction de la souche complétée par le micC

  1. Concevoir des amorces pBR-micC-F et pBR-micC-R avec des sites de restriction NheI et SalI.
    1. Amplifier le gène micC pleine longueur avec des séquences de flanc en utilisant un mélange réactionnel PCR contenant 5 μL d’ADN génomique SE50336 comme matrice, des amorces 1 μL de pBR-micC-F et 1 μL de pBR-micC-R comme amorces, 5 μL de tampon de réaction PCR 10x, 2 μL de mélange dNTP (2,5 mM), 2 μL de mélange dNTP (2,5 mM) et 35 μL de ddH2O.
    2. Utiliser les conditions de réaction PCR suivantes : prédénaturation à 94 °C pendant 4 min ; 94 °C pendant 30 s, 52 °C pendant 50 s, 72 °C pendant 1 min pendant 25 cycles et extension à 72 °C pendant 10 min. Purifier et récupérer le produit PCR.
  2. Digérer le produit PCR et le plasmide pBR322 respectivement en utilisant l’enzyme de restriction NheI et SalI, et les ligaturer en utilisant la T4 ligase à 16 °C pendant la nuit pour obtenir le plasmide pBR322-micC.
  3. Transformer pBR322-micC en cellules compétentes SE50336ΔmicC et cribler le transformant positif pour obtenir la souche complémentaire SE50336ΔmicC/pmicC. Extraire le plasmide pBR322-micC de la souche complétée et le vérifier par digestion et séquençage des enzymes de restriction.

5. Isolement de l’ARN et PCR quantitative en temps réel

  1. Culture SE50336, 50336ΔmicC et 50336ΔmicC/pmicC en milieu LB pendant une nuit à 24 °C avec culture sous agitation de 180 rpm jusqu’à une DO600 de 2,0. Recueillir la culture bactérienne par centrifugation à 13000 rpm pendant 2 min.
  2. Extraire l’ARN total à l’aide du réactif TRIzol. Incuber 50 μL d’ARN isolé avec 2 μL de DNaseI et 6 μL de tampon 10x à 37 °C pendant 30 min pour éliminer l’ADN. Déterminer la quantité d’ARN en pipetant 1 μL d’échantillon d’ARN vers un micro-spectrophotomètre.
  3. Synthèse de l’ADNc
    1. Utiliser 1 μg d’ARN total pour la synthèse de l’ADNc dans 20 μL de système de réaction de transcription inverse (4 μL de tampon 5x, 1 μL de mélange d’enzymes RT, 1 μL de mélange d’amorces RT, 10 μL d’ARN total et 4 μL deddH2O). Incuber au-dessus du système réactionnel à 37 °C pendant 15 min, puis à 85 °C pendant 5 s.
  4. Concevoir des amorces basées sur la séquence des gènes cibles ompA, ompC et ompD. Effectuez une PCR de transcription inverse à l’aide d’un kit de réactif RT. Les composants de réaction PCR contiennent 2,5 μL de tampon réactionnel PCR 10x, 1 μL de mélange dNTP (2,5 mM), 1 μL d’amorces du gène cible (ompA, ompC ou ompD), 2,5 μL de matrice, 0,5 μL d’ADN polymérase Taq et 17,5 μL de ddH2O.
    1. Utiliser les conditions de réaction PCR suivantes : prédénaturation à 94 °C pendant 4 min ; 94 °C pendant 30 s, 60 °C pendant 1 min, 72 °C pendant 1 min pendant 25 cycles, et extension à 72 °C pendant 10min.
  5. Effectuez une PCR en temps réel à l’aide du kit RT-PCR vert SYBR dans un instrument RT-PCT en trois exemplaires.
    1. Utilisez les composants de réaction PCR suivants : 10 μL de tampon SYBR 2x, 0,4 μLof d’amorce directe et d’amorce inverse respectivement, 0,4 μL de RoxDye II, 2 μLd d’ADNc et 6,8 μL de H2O libre de RNase.
    2. Utiliser les conditions de réaction PCR suivantes : prédénaturation à 95 °C pendant 1 min pendant un cycle; 95 °C pendant 5 s, 60 °C pendant 34 s pendant 40 cycles.
    3. Normaliser toutes les données du gène de référence endogène gyrA. Utiliser la méthode 2-Δ ΔCT pour la quantification des données15.

6. Tests de virulence

  1. Culture SE50336, 50336ΔmicC et 50336ΔmicC/pmicC en phase stationnaire LB moyenne à précoce (OD600 de 2-3) à 24 °C, récolte par centrifugation et dilution à l’UFC appropriée mL-1 dans du PBS stérile.
  2. Pour les infections chez les souris, diluer les souches cultivées à 10 UFC/200 μL, 102 UFC/200 μL et 103 UFC/200 μL en suspension. Infecter des groupes de cinq souris Balb/c âgées de 6 à 8 semaines par souche par injection sous-cutanée. Injectez au groupe témoin 200 μL de solution saline physiologique.
  3. Pour les infections chez le poulet, diluer au-dessus de trois souches à 107 UFC/200 μL, 108 UFC/200 μL et 109 UFC/200 μL en suspension. Infecter des groupes de vingt poulets âgés de 1 jour par souche par injection sous-cutanée.
  4. Surveiller quotidiennement les signes de maladie et de décès d’animaux de laboratoire. Calculer la DL50 (dose létale médiane) 14 jours après l’infection comme décrit précédemment16. Traiter les données à l’aide d’un logiciel d’analyse de données.
  5. Dans les groupes infectés, prélever le cœur, le foie, la rate, les poumons et les reins des poussins fraîchement morts. Pesez 0,5 g des tissus ci-dessus séparément et broyez-les avec une opération stérile. Diluer progressivement les échantillons, les étaler sur une plaque LB et les cultiver pendant 8-10 h à 37 °C. Noter la quantité de souches de Salmonella colonisées dans les tissus des poussins.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Construction du micC mutant 50336Δ et de la souche 50336Δ micC /p micC
Le résultat du clone du gène micC indiquait que ce gène était composé de 109 pb montrant une identité de 100% avec celle de S. Typhimurium. Sur la base des données de séquence, le mutant de délétion 50336ΔmicC et le mutant complété 50336ΔmicC/pmicC ont été cons...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L. Enteritidis est un important agent pathogène intracellulaire facultatif qui peut infecter les jeunes poulets et produire des symptômes allant de l’entérite à l’infection systémique et à la mort17,18. De plus, S. Enteritidis provoque des infections latentes chez les poulets adultes et les porteurs chroniques contaminent les produits avicoles, ce qui entraîne des infections d’origine alimentaire chez les humains19. Le mé...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a été financée par des subventions de la Fondation nationale chinoise des sciences (n° 31972651 et 31101826), de la Fondation scientifique du lycée du Jiangsu (n ° 14KJB230002), du Laboratoire clé d’État de biotechnologie vétérinaire (n ° SKLVBF201509), de la subvention de la Fondation des sciences de la nature de Yangzhou (n ° YZ2014019), un projet financé par le développement de programmes académiques prioritaires des établissements d’enseignement supérieur du Jiangsu (PAPD).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
dextroseSangon BiotechA610219pour la préparation du bouillon
Kit de purification de l’ADNTIANGENDP214pour la purification de l’ADN
Ex TaqTaKaRaRR01APCR
KH2PO4Sinopharm Réactif chimique10017608pour la préparation du bouillon
K2HPO4Sinopharm Réactif20032116pour la préparation du bouillon
L-ArabinoseSangon BiotechA610071&lambda ;-Red recombination
Mini PlasmideKit TIANGENDP106du plasmide
NaClSinopharm Réactif chimique10019308pour la préparation du bouillon
(NH4)2SO4Sinopharm Réactifchimique 10002917pour la préparation du bouillon
PrimeScriptRRT Kit de réactifs avec gomme d’ADNg  ;TaKaRaRR047qRT-PCR
SYBRR Premix Ex Taq IITaKaRaRR820qRT-PCR
T4 DNA LigaseNEBM0202Ligation
TRIzol  ;Invitrogen15596018isolement de l’ARN
TryptoneOxoidLP0042pour la préparation du bouillon
Extrait de levureOxoidLP0021pour la préparation du bouillon
centrifugeuseEppendorf5418Centrifugation Appareil d’électrophorèse
Bio-Rad164-5050Électrophorèse
  ; Système d’électroporationBio-Rad165-2100pour la transformation bactérienne
SpectrophotomètreBioTekDétection del’absorbance
d’époque Système PCR en temps réelSystème Applied Biosystems7500qRT-PCR
chimique extraction

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jørgensen, M. G., Pettersen, J. S., Kallipolitis, B. H. sRNA-mediated control in bacteria: An increasing diversity of regulatory mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), 194504(2020).
  2. Wagner, E. G. H., Romby, P. Small RNAs in bacteria and archaea: who they are, what they do, and how they do it. Advances In Genetics. 90, 133-208 (2015).
  3. Vogel, J. A rough guide to the non-coding RNA world of Salmonella. Molecular Microbiology. 71 (1), 1-11 (2009).
  4. Dutta, T., Srivastava, S. Small RNA-mediated regulation in bacteria: A growing palette of diverse mechanisms. Gene. 656, 60-72 (2018).
  5. Waters, L. S., Storz, G. Regulatory RNAs in bacteria. Cell. 136 (4), 615-628 (2009).
  6. Chen, S., Zhang, A., Blyn, L. B., Storz, G. MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 186 (20), 6689-6697 (2004).
  7. Pfeiffer, V., Papenfort, K., Lucchini, S., Hinton, J. C., Vogel, J. Coding sequence targeting by MicC RNA reveals bacterial mRNA silencing downstream of translational initiation. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (8), 840-846 (2009).
  8. Dam, S., Pagès, J. M., Masi, M. Dual Regulation of the Small RNA MicC and the Quiescent Porin OmpN in Response to Antibiotic Stress in Escherichia coli. Antibiotics (Basel). 6 (4), 33(2017).
  9. Hao, M., et al. Porin Deficiency in Carbapenem-Resistant Enterobacter aerogenes Strains. Microbial Drug Resistance. 24 (9), 1277-1283 (2018).
  10. Wroblewska, Z., Olejniczak, M. Hfq assists small RNAs in binding to the coding sequence of ompD mRNA and in rearranging its structure. RNA. 22 (7), 979-994 (2016).
  11. Santiviago, C. A., Toro, C. S., Hidalgo, A. A., Youderian, P., Mora, G. C. Global regulation of the Salmonella enterica serovar typhimurium major porin, OmpD. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5901-5905 (2003).
  12. Hara-Kaonga, B., Pistole, T. G. OmpD but not OmpC is involved in adherence of Salmonella enterica serovar typhimurium to human cells. Canadian Journal of Microbiology. 50 (9), 719-727 (2004).
  13. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  14. Meng, X., et al. The RNA chaperone Hfq regulates expression of fimbrial-related genes and virulence of Salmonella enterica serovar Enteritidis. FEMS Microbiology Letters. 346 (2), 90-96 (2013).
  15. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  16. Vander Velden, A. W., Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Heffron, F. Multiple fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2803-2808 (1998).
  17. Prescott, J. F. Salmonella enterica serovar enteritidis in humans and animals: Epidemiology, pathogenesis, and control. Canadian Veterinary Journal La Revue Veterinaire Canadienne. 40 (10), 736(1999).
  18. Balasubramanian, R., et al. The global burden and epidemiology of invasive non-typhoidal. Hum Vaccin Immunother. 15 (6), 1421-1426 (2019).
  19. De Buck, J., Van Immerseel, F., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. Colonization of the chicken reproductive tract and egg contamination by Salmonella. Journal of General and Applied Microbiology. 97 (2), 233-245 (2004).
  20. Padalon-Brauch, G., et al. Small RNAs encoded within genetic islands of Salmonella typhimurium show host-induced expression and role in virulence. Nucleic Acids Research. 36 (6), 1913-1927 (2008).
  21. Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), 1000477(2009).
  22. Gong, H., et al. A Salmonella small non-coding RNA facilitates bacterial invasion and intracellular replication by modulating the expression of virulence factors. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002120(2011).
  23. Hébrard, M., et al. sRNAs and the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium. RNA Biology. 9 (4), 437-445 (2012).
  24. Vogel, J., Papenfort, K. Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane. Current Opinion in Microbiology. 9 (6), 605-611 (2006).
  25. Papenfort, K., et al. SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay. Molecular Microbiology. 62 (6), 1674-1688 (2006).
  26. Udekwu, K. I., et al. Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA. Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).
  27. Papenfort, K., Vogel, J. Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level. Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).
  28. Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).
  29. Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites. Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).
  30. Boisset, S., et al. Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism. Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).
  31. Massé, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).
  32. Papenfort, K., Vogel, J. Regulatory RNA in bacterial pathogens. Cell Host & Microbe. 8 (1), 116-127 (2010).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

MicC RNAGene DeletionLambda Red RecombinationqRT PCR AnalysisLD50 AssayChloramphenicol CassetteElectroporation TransformationVirulence Enhancement

Articles connexes