Un protocole amélioré d’efficacité en termes de temps et de main-d’œuvre pour l’isolement des hépatocytes primaires chez la souris

Summary

Les hépatocytes primaires sont un outil précieux pour étudier la réponse hépatique et le métabolisme in vitro. En utilisant des réactifs disponibles dans le commerce, un protocole amélioré d’efficacité en termes de temps et de main-d’œuvre pour l’isolement des hépatocytes primaires chez la souris a été développé.

Abstract

Les hépatocytes primaires sont largement utilisés dans la recherche in vitro sur le foie, en particulier dans les études sur le métabolisme du glucose. Une technique de base a été adaptée en fonction de différents besoins, tels que le temps, la main-d’œuvre, le coût et l’utilisation primaire des hépatocytes, ce qui a donné lieu à divers protocoles d’isolement des hépatocytes primaires. Cependant, les nombreuses étapes et les préparations de réactifs fastidieuses dans l’isolement des hépatocytes primaires sont des inconvénients majeurs pour l’efficacité. Après avoir comparé différents protocoles pour leurs avantages et leurs inconvénients, les avantages de chacun ont été combinés et un protocole d’isolement hépatocytaire primaire rapide et efficace a été formulé. En seulement ~ 35 minutes, ce protocole pourrait produire autant, sinon plus, d’hépatocytes primaires sains que d’autres protocoles. De plus, des expériences sur le métabolisme du glucose réalisées à l’aide des hépatocytes primaires isolés ont validé l’utilité de ce protocole dans les études in vitro sur le métabolisme hépatique. Nous avons également examiné et analysé de manière approfondie l’importance et le but de chaque étape de cette étude afin que les futurs chercheurs puissent optimiser davantage ce protocole en fonction des besoins.

Introduction

Le foie est l’un des organes les plus importants du corps des vertébrés en raison du rôle vital qu’il joue dans de nombreuses fonctions vitales telles que la digestion des aliments, la circulation sanguine et la désintoxication. L’utilisation de la culture in vitro d’hépatocytes primaires de souris est de plus en plus populaire dans les études sur le métabolisme des glucides et le carcinome hépatique. Par conséquent, il est important de développer une méthode pratique pour l’isolement des hépatocytes primaires de souris tout en maintenant sa fonction physiologique innée. En raison de sa fonction de plaque tournante du métabolisme du glucose, le foie est égale....

Protocol

Toutes les procédures ont été approuvées par le Johns Hopkins Animal Care and Use Committee. Des souris femelles C57BL/6 (âgées de 8 semaines) ont été utilisées dans cette étude.

1. Préparation :

1. Mélanger William’s E Medium (GlutaMAX Supplement) avec 10% FBS et 1% de solution antibiotique-antimycotique pour faire le milieu de culture.
2. Filtrer 25 mL de milieu collagénase-dispase (p. ex. milieu de digestion du foie) à l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 μm pour éliminer les débris de particules.
3. Réchauffer 50 mL de H₂O (ddH₂O) double distillé, 35 mL de milieu de perfusion ....

Results

Afin de tester l’efficacité, le protocole actuel d’isolement des hépatocytes primaires a été réalisé sur des souris femelles C57BL/6 âgées de 8 semaines. La fixation et la pureté des hépatocytes primaires isolés ont été testées. L’isolement hépatocytaire primaire est utilisé pour une grande variété d’expériences sur la physiologie du foie, telles que les effets des médicaments hépatiques et le métabolisme du glucose, l’activité des biomarqueurs^{pharmaceutiques 2}, la sensibilité à l’insuline et la p.......

Discussion

Divers protocoles d’isolement des hépatocytes primaires ont été développés. Ils ont également été optimisés et adaptés en fonction des différents besoins (tableau 1). Les protocoles d’isolement sont généralement composés de deux parties : la perfusion (y compris la digestion enzymatique) et la purification.

La perfusion peut être réalisée avec l’ensemble du foie in vivo 2,20,21,22,23 ou avec des lobes hépatiqu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco	10010023
10x HBSS	Gibco	14065-056
Plaque 12 puits	FALCON	353043	Revêtement non requis
Plaque 6 puits	FALCON	353046	Revêtement non requis
anti-AKT	Cell Signaling	2920S
Solution antimycosique antibiotique (100x), stabilisée	Sigma-Aldrich	A5955
anti-FOXO1	Signalisation cellulaire	97635S
anti-GAPDH	Signalisation cellulaire	2118S
anti-p-AKT (S473)	Signalisation cellulaire	9271L
anti-PEPCK	Santa Cruz	SC-166778
anti-p-FOXO1 (S256)	Signalisation cellulaire	84192S
Crépine cellulaire, 70 et micro ; m	CELLTREAT	229483
Cathéter IV fermé, calibre 24 0,75 po	Becton Dickinson	383511
DMEM, sans glucose, sans glutamine, sans rouge de phénol	ThermoFisher Scientific	A1443001
EnzyChrom Kit de dosage du glucose	BioAssay Systems	EBGL-100
Sérum de veau fœtal (FBS)	Hyclone	SH30071.03
Forskolin	MilliporeSigma	F3917-10MG
Glucagon	Sigma-Aldrich	G2044
Chèvre Anti-souris IgG Anticorps secondaire	LI-COR	926-68070
Chèvre Anti-lapin IgG Anticorps secondaire	LI-COR	926-32211
GraphPad Prism 8	GraphPad Software	NA
Lavage d’hépatocytes	Medium Gibco	17704-024
IBMX	Cell Signaling	13630S
Insuline	Lilly	NDC 0002-8215-01
Kétamine HCL (100 mg/mL)	Hospira Inc	NDC 0409-2051-05
L-Glutamine	Gibco	25030081
Liver Digest Medium	Gibco	17703-034	Aliquote à l’intérieur du capuchon de culture tissulaire à 25 mL chacun dans un tube de 50 mL, et conserver à -20 ° ; C
congélateur Perfusion hépatique Medium	Gibco	17701-038
Pen Strep	Gibco	15140122
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Pompe péristaltique	Gilson	Minipuls 2	Capable de pomper à 4 mL/min
Boîte de Pétri	Fisherbrand	08-757-12
Centrifugeuse	réfrigéréeSorvall	Legend RT	Capable de centrifuger un tube de 50 mL à 4 ° ; C
L-lactate de sodium	Sigma-Aldrich	L7022
Pyruvate de sodium	Gibco	11360070
filtre à seringue, PVDF 0,45 & micro ; m Seringue CELLTREAT 229745 de 30 mm de diamètre
		Becton Dickinson	0,5 ml
de trypan Becton	Dickinson		de 60 mL
de 15250061	Gibco	0,4 %,
		Corning	de 15 mL
, 50 ml	Corning	430290
Eau Réservoir de bain	Corning	CLS6783	Ou tout réservoir de bain-marie capable de chauffer jusqu’à 45 ° ; C
William' s E Medium (supplément GlutaMAX)	Gibco	32551020
Xylozine (100 mg/mL)	Vetone Anased LA	NDC13985-704-10