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Article de méthode

Un protocole amélioré d’efficacité en termes de temps et de main-d’œuvre pour l’isolement des hépatocytes primaires chez la souris

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DOI :

10.3791/61812

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25 octobre 2021

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Physiology, Temple University School of Medicine, 3Department of Pediatrics, Seattle Children’s Hospital

Dans cet article

Résumé

Les hépatocytes primaires sont un outil précieux pour étudier la réponse hépatique et le métabolisme in vitro. En utilisant des réactifs disponibles dans le commerce, un protocole amélioré d’efficacité en termes de temps et de main-d’œuvre pour l’isolement des hépatocytes primaires chez la souris a été développé.

Résumé

Les hépatocytes primaires sont largement utilisés dans la recherche in vitro sur le foie, en particulier dans les études sur le métabolisme du glucose. Une technique de base a été adaptée en fonction de différents besoins, tels que le temps, la main-d’œuvre, le coût et l’utilisation primaire des hépatocytes, ce qui a donné lieu à divers protocoles d’isolement des hépatocytes primaires. Cependant, les nombreuses étapes et les préparations de réactifs fastidieuses dans l’isolement des hépatocytes primaires sont des inconvénients majeurs pour l’efficacité. Après avoir comparé différents protocoles pour leurs avantages et leurs inconvénients, les avantages de chacun ont été combinés et un protocole d’isolement hépatocytaire primaire rapide et efficace a été formulé. En seulement ~ 35 minutes, ce protocole pourrait produire autant, sinon plus, d’hépatocytes primaires sains que d’autres protocoles. De plus, des expériences sur le métabolisme du glucose réalisées à l’aide des hépatocytes primaires isolés ont validé l’utilité de ce protocole dans les études in vitro sur le métabolisme hépatique. Nous avons également examiné et analysé de manière approfondie l’importance et le but de chaque étape de cette étude afin que les futurs chercheurs puissent optimiser davantage ce protocole en fonction des besoins.

Introduction

Le foie est l’un des organes les plus importants du corps des vertébrés en raison du rôle vital qu’il joue dans de nombreuses fonctions vitales telles que la digestion des aliments, la circulation sanguine et la désintoxication. L’utilisation de la culture in vitro d’hépatocytes primaires de souris est de plus en plus populaire dans les études sur le métabolisme des glucides et le carcinome hépatique. Par conséquent, il est important de développer une méthode pratique pour l’isolement des hépatocytes primaires de souris tout en maintenant sa fonction physiologique innée. En raison de sa fonction de plaque tournante du métabolisme du glucose, le foie est également au cœur de la production et du stockage du glucose1. Les expériences avec des hépatocytes primaires in vitro sont indispensables à la plupart des études sur le métabolisme du glucose. Par conséquent, pendant des années, divers groupes de recherche ont développé des protocoles pour l’isolement des hépatocytes primaires chez la souris.

La procédure générale d’isolement des hépatocytes de souris consiste d’abord à rincer le sang dans le foie avec un liquide isosmotique tel qu’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou la solution saline équilibrée de Hanks (HBSS), puis à utiliser une solution contenant de la collagénase pour dissocier les hépatocytes. Ces protocoles partagent une procédure générale, mais diffèrent par des réactifs et des étapes en fonction de différents besoins. Cependant, la préparation des réactifs requis et l’exécution des étapes d’isolement prennent du temps. Lors de l’élaboration du protocole actuel, l’efficacité a été une priorité, avec tous les réactifs prêts à l’emploi et disponibles sur le marché, et le moins d’étapes possible. L’objectif global de ce protocole est de fournir une méthode rapide et efficace en main-d’œuvre pour isoler les hépatocytes primaires de la souris, sans compromettre la pureté et la viabilité des hépatocytes primaires isolés.

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Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le Johns Hopkins Animal Care and Use Committee. Des souris femelles C57BL/6 (âgées de 8 semaines) ont été utilisées dans cette étude.

1. Préparation :

  1. Mélanger William’s E Medium (GlutaMAX Supplement) avec 10% FBS et 1% de solution antibiotique-antimycotique pour faire le milieu de culture.
  2. Filtrer 25 mL de milieu collagénase-dispase (p. ex. milieu de digestion du foie) à l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 μm pour éliminer les débris de particules.
  3. Réchauffer 50 mL de H2O (ddH2O) double distillé, 35 mL de milieu de perfusion (p. ex. milieu de perfusion hépatique) (ou 50 mL pour la première fois en utilisant ce protocole) et 25 mL de milieu filtré à la collagénase-dispase dans un bain-marie à 45 °C pendant 30 min.
  4. Dans une hotte de culture tissulaire stérile, mélanger 2 mL de 10x HBSS et 18 mL de Percoll dans un tube de 50 mL pour obtenir 20 mL 1x Percoll-HBSS et garder sur la glace ou 4 °C.
    REMARQUE: 1x Percoll-HBSS peut être conservé à 4 °C pendant au moins 6 mois.
  5. Dans une cagoule de culture tissulaire stérile, versez 30 mL de milieu de lavage (p. ex. milieu de lavage des hépatocytes) dans une boîte de Pétri propre et conservez-la sur la glace.
  6. Immergez le tube de pompage dans l’eau d’un bain-marie à 45 °C. Les résultats sont plus fiables si la température ambiante est de 25 °C.
  7. Préparer 2 mL de 1x anesthésiques en mélangeant 225 μL de Kétamine HCL, 93,75 μL de Xylazine et 1681 μL de 1x PBS.
  8. Anesthésiez une souris à l’aide d’une méthode approuvée. Ici, la souris a été injectée par voie intrapéritonéale avec 150 μL de 1x anesthésiques. Effectuer les tests de perte de réflexes tels que la réaction au pincement des orteils pour assurer une anesthésie complète.
  9. Fixez la souris sur le dos sur le coussinet de dissection par quatre membres, en épinglant ou en utilisant du ruban adhésif étanche ou d’autres méthodes approuvées par le Comité des soins et de l’utilisation des animaux de l’établissement (ou des équivalents).
  10. Préparez des pinces stérilisées et des ciseaux pour la dissection. Pour éviter toute contamination possible, effectuez toutes les étapes à l’intérieur d’une hotte stérile.

2. Procédure :

  1. À l’aide d’une pompe péristaltique, commencez à pomper du ddH2O réchauffé à une vitesse de 4 mL/min pendant 5 min. Remplacez le tube de pompage de l’eau par un milieu de perfusion réchauffé.
  2. Désinfectez l’abdomen de la souris anesthésiée avec 70% d’EtOH et coupez-le avec un ciseau pour exposer le foie, la veine porte et la veine cave inférieure (IVC).
  3. Arrêtez la pompe péristaltique. Insérez un cathéter de 24 G (p. ex., cathéter IV fermé, 24 G, 0,75 PO) dans la CIV. Commencez à pomper et coupez la veine porte ouverte.
  4. Continuez à pomper jusqu’à ce que le liquide évacué soit clair (environ 3-5 min). Appuyez sur la veine porte toutes les minutes pour laisser le liquide atteindre tous les coins du foie. Veillez à ne pas laisser les bulles d’air pénétrer dans l’IVC.
    REMARQUE: Cette étape consiste à éliminer autant de sang que possible du foie.
  5. Changer le tube de pompage du milieu de perfusion au milieu collagénase-dispase. Continuez à pomper jusqu’à ce que les 25 mL du milieu collagénase-dispase soient épuisés pendant l’étape 2.6.
  6. Appuyez sur la veine porte toutes les minutes pour laisser le liquide atteindre tous les coins du foie.
    REMARQUE: À ce stade, la perte complète de sang est fatale à la souris. La mort de la souris peut être confirmée par un manque de rythme cardiaque après l’expérience. Jetez la carcasse conformément aux politiques de l’établissement.
  7. Isolez tout le foie sans vésicule biliaire dans le milieu de lavage de 30 ml dans la boîte de Pétri sur de la glace.
  8. Déchirez-le en morceaux avec des pinces pour libérer les hépatocytes primaires en solution. Cette étape transformerait le milieu de lavage en une solution trouble pleine d’hépatocytes primaires libérés et de petits morceaux de foie.
  9. Filtrer la solution trouble à l’étape 2.8 à travers une passoire cellulaire de 70 μm dans le Percoll-HBSS de 20 mL 1x dans un tube de 50 mL sur glace. Mélanger en inversant le tube 20 fois.
  10. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 °C.
  11. Dans la hotte de culture tissulaire, aspirez le surnageant. Laver la pastille avec 30 mL de milieu de lavage froid.
  12. Centrifuger à 50 x g pendant 5 min à 4 °C.
  13. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 25 mL du milieu de culture (ou d’autres volumes appropriés) dans la hotte de culture tissulaire.
  14. Comptez le numéro de cellule et plaquez les cellules sur les plaques de culture souhaitées selon la conception expérimentale.
    REMARQUE: Les hépatocytes primaires correctement isolés d’une souris de 8 semaines sont généralement suffisants pour être plaqués sur quatre plaques de 6 puits ou quatre plaques de 12 puits.

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Résultats

Afin de tester l’efficacité, le protocole actuel d’isolement des hépatocytes primaires a été réalisé sur des souris femelles C57BL/6 âgées de 8 semaines. La fixation et la pureté des hépatocytes primaires isolés ont été testées. L’isolement hépatocytaire primaire est utilisé pour une grande variété d’expériences sur la physiologie du foie, telles que les effets des médicaments hépatiques et le métabolisme du glucose, l’activité des biomarqueurspharmaceutiques 2, la sensibilité à l’insuline et la p...

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Discussion

Divers protocoles d’isolement des hépatocytes primaires ont été développés. Ils ont également été optimisés et adaptés en fonction des différents besoins (tableau 1). Les protocoles d’isolement sont généralement composés de deux parties : la perfusion (y compris la digestion enzymatique) et la purification.

La perfusion peut être réalisée avec l’ensemble du foie in vivo 2,20,21,22,23 ou avec des lobes hépatiqu...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (Subvention 5R01HD095512-02 à S.W.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1x PBSGibco10010023
10x HBSSGibco14065-056
Plaque 12 puitsFALCON353043Revêtement non requis
Plaque 6 puitsFALCON353046Revêtement non requis
anti-AKTCell Signaling2920S
Solution antimycosique antibiotique (100x), stabiliséeSigma-AldrichA5955
anti-FOXO1Signalisation cellulaire97635S
anti-GAPDHSignalisation cellulaire2118S
anti-p-AKT (S473)Signalisation cellulaire9271L
anti-PEPCKSanta CruzSC-166778
anti-p-FOXO1 (S256)Signalisation cellulaire84192S
Crépine cellulaire, 70 et micro ; mCELLTREAT229483
Cathéter IV fermé, calibre 24 0,75 poBecton Dickinson383511
DMEM, sans glucose, sans glutamine, sans rouge de phénolThermoFisher ScientificA1443001
EnzyChrom Kit de dosage du glucoseBioAssay SystemsEBGL-100
Sérum de veau fœtal (FBS)HycloneSH30071.03
ForskolinMilliporeSigmaF3917-10MG
GlucagonSigma-AldrichG2044
Chèvre Anti-souris IgG Anticorps secondaireLI-COR926-68070
Chèvre Anti-lapin IgG Anticorps secondaireLI-COR926-32211
GraphPad Prism 8GraphPad SoftwareNA
Lavage d’hépatocytesMedium Gibco17704-024
IBMXCell Signaling13630S
InsulineLillyNDC 0002-8215-01
Kétamine HCL (100 mg/mL)Hospira IncNDC 0409-2051-05
L-GlutamineGibco25030081
Liver Digest MediumGibco17703-034Aliquote à l’intérieur du capuchon de culture tissulaire à 25 mL chacun dans un tube de 50 mL, et conserver à -20 ° ; C
congélateur Perfusion hépatique MediumGibco17701-038
Pen StrepGibco15140122
PercollGE Healthcare17-0891-01
Pompe péristaltiqueGilsonMinipuls 2Capable de pomper à 4 mL/min
Boîte de PétriFisherbrand08-757-12
CentrifugeuseréfrigéréeSorvallLegend RTCapable de centrifuger un tube de 50 mL à 4 ° ; C
L-lactate de sodiumSigma-AldrichL7022
Pyruvate de sodiumGibco11360070
filtre à seringue, PVDF 0,45 & micro ; m Seringue CELLTREAT 229745 de 30 mm de diamètre
Becton Dickinson0,5 ml
de trypan BectonDickinsonde 60 mL
de 15250061Gibco0,4 %,
Corningde 15 mL
, 50 mlCorning430290
Eau Réservoir de bainCorningCLS6783Ou tout réservoir de bain-marie capable de chauffer jusqu’à 45 ° ; C
William' s E Medium (supplément GlutaMAX)Gibco32551020
Xylozine (100 mg/mL)Vetone Anased LANDC13985-704-10
, seringue 329461 de, solution de bleu 309653 , tube à tube de 430052

Références

  1. Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective. Experimental and Molecular Medicine. 48, 218(2016).
  2. Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
  3. Guidotti, J. E., et al. Liver cell polyploidization: a pivotal role for binuclear hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
  4. Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. Elife. 4, 11214(2015).
  5. Bruening, J., et al. Hepatitis C virus enters liver cells using the CD81 receptor complex proteins calpain-5 and CBLB. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007111(2018).
  6. Silvie, O., et al. Hepatocyte CD81 is required for Plasmodium falciparum and Plasmodium yoelii sporozoite infectivity. Nature Medicine. 9 (1), 93-96 (2003).
  7. Crispe, I. N. Hepatocytes as immunological agents. Journal of Immunology. 196 (1), 17-21 (2016).
  8. Liu, N. C., et al. Loss of TR4 orphan nuclear receptor reduces phosphoenolpyruvate carboxykinase-mediated gluconeogenesis. Diabetes. 56 (12), 2901-2909 (2007).
  9. Wang, Z., et al. Gonadotrope androgen receptor mediates pituitary responsiveness to hormones and androgen-induced subfertility. JCI Insight. 5 (17), 127817(2019).
  10. Santos, S. D., et al. CSF transthyretin neuroprotection in a mouse model of brain ischemia. Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1434-1444 (2010).
  11. Pinhu, L., et al. Overexpression of Fas and FasL is associated with infectious complications and severity of experimental severe acute pancreatitis by promoting apoptosis of lymphocytes. Inflammation. 37 (4), 1202-1212 (2014).
  12. Mi, Y., Lin, A., Fiete, D., Steirer, L., Baenziger, J. U. Modulation of mannose and asialoglycoprotein receptor expression determines glycoprotein hormone half-life at critical points in the reproductive cycle. Journal of Biological Chemistry. 289 (17), 12157-12167 (2014).
  13. Tanowitz, M., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 mediates productive uptake of N-acetylgalactosamine-conjugated and unconjugated phosphorothioate antisense oligonucleotides into liver hepatocytes. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12388-12400 (2017).
  14. Manczak, M., et al. Neutralization of granulocyte macrophage colony-stimulating factor decreases amyloid beta 1-42 and suppresses microglial activity in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 18 (20), 3876-3893 (2009).
  15. Zhang, Y., et al. JAK1-dependent transphosphorylation of JAK2 limits the antifibrotic effects of selective JAK2 inhibitors on long-term treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 76 (8), 1467-1475 (2017).
  16. Shih, S. C., et al. Molecular profiling of angiogenesis markers. American Journal of Pathology. 161 (1), 35-41 (2002).
  17. Liu, G., et al. miR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation, regulates murine macrophage inflammatory responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15819-15824 (2009).
  18. Ding, Q., et al. Mice expressing minimally humanized CD81 and occludin genes support Hepatitis C virus uptake in vivo. Journal of Virology. 91 (4), 01799(2017).
  19. Renshaw, M., et al. Cutting edge: impaired Toll-like receptor expression and function in aging. Journal of Immunology. 169 (9), 4697-4701 (2002).
  20. Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
  21. Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323(2018).
  22. Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993(2018).
  23. Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507(2019).
  24. Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar Journal. 6, 169(2007).
  25. Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion. Cell Transplant. 16 (8), 859-865 (2007).
  26. Hepatocyte media, Thermofisher. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf (2021).
  27. Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L., Llovet, J. M. Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis. Gastroenterology. 152 (4), 745-761 (2017).
  28. Freitas-Lopes, M. A., Mafra, K., David, B. A., Carvalho-Gontijo, R., Menezes, G. B. Differential location and distribution of hepatic immune cells. Cells. 6 (4), 48(2017).
  29. Schachtrup, C., Le Moan, N., Passino, M. A., Akassoglou, K. Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair. Cell Cycle. 10 (11), 1764-1771 (2011).
  30. Geerts, A. History, heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Seminars in Liver Disease. 21 (3), 311-335 (2001).
  31. Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
  32. Peter, M. E., et al. The CD95 receptor: apoptosis revisited. Cell. 129 (3), 447-450 (2007).
  33. Peters, D. T., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells. Development. 143 (9), 1475-1481 (2016).
  34. Willoughby, J. L. S., et al. Evaluation of GalNAc-siRNA conjugate activity in pre-clinical animal models with reduced asialoglycoprotein receptor expression. Molecular Therapy. 26 (1), 105-114 (2018).
  35. Hutchins, N. A., Chung, C. S., Borgerding, J. N., Ayala, C. A., Ayala, A. Kupffer cells protect liver sinusoidal endothelial cells from Fas-dependent apoptosis in sepsis by down-regulating gp130. American Journal of Pathology. 182 (3), 742-754 (2013).

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