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Article de méthode

Segmentation de la croissance des cellules endothéliales dans des plaques à 6 puits sur un agitateur orbital pour les études mécanobiologiques

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DOI :

10.3791/61817

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3 juin 2021

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1Department of Bioengineering, Imperial College London, 2Institute of Molecular and Cell Biology, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 3Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University Singapore, 4Singapore Eye Research Institute, The Academia

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode de revêtement pour limiter la croissance des cellules endothéliales à une région spécifique d’une plaque de 6 puits pour l’application de contrainte de cisaillement à l’aide du modèle de shaker orbital.

Résumé

L’effort de cisaillement imposé sur la paroi artérielle par le flux de sang affecte la morphologie et la fonction endothéliales de cellules. De basse ampleur, les contraintes oscillatoires et multidirectionnelles de cisaillement tous ont été postulés pour stimuler un phénotype pro-athérosclérotique en cellules endothéliales, tandis que l’ampleur élevée et le cisaillement unidirectionnel ou uniaxial sont pensés pour favoriser l’homéostasie endothéliale. Ces hypothèses exigent l’enquête plus approfondie, mais les techniques in vitro traditionnelles ont des limites, et sont particulièrement pauvres à imposer des contraintes de cisaillement multidirectionnel sur des cellules.

Une méthode qui gagne de plus en plus d’utilisation est de culturer des cellules endothéliales dans des plaques multi-puits standard sur la plate-forme d’un agitateur orbital; dans cette méthode simple, peu coûteuse, à haut débit et chronique, le milieu tourbillonnant produit différents modèles et amplitudes de cisaillement, y compris un cisaillement multidirectionnel, dans différentes parties du puits. Cependant, il a une limite importante: les cellules d’une région, exposées à un type d’écoulement, peuvent libérer des médiateurs dans le milieu qui affectent les cellules dans d’autres parties du puits, exposées à des écoulements différents, faussant ainsi la relation apparente entre l’écoulement et le phénotype.

Nous présentons ici une modification facile et abordable de la méthode qui permet aux cellules d’être exposées uniquement à des caractéristiques de contrainte de cisaillement spécifiques. L’ensemencement cellulaire est limité à une région définie du puits en recouvrant la région d’intérêt de fibronectine, suivie d’une passivation à l’aide d’une solution passivante. Par la suite, les plaques peuvent être tourbillonnées sur le shaker, ce qui entraîne l’exposition des cellules à des profils de cisaillement bien définis tels que le cisaillement multidirectionnel de faible magnitude ou le cisaillement uniaxial de magnitude élevée, selon leur emplacement. Comme précédemment, l’utilisation de plastiques de culture cellulaire standard permet une analyse plus approfondie des cellules. La modification a déjà permis la démonstration de médiateurs solubles, libérés par l’endothélium sous des caractéristiques de contrainte de cisaillement définies, qui affectent les cellules situées ailleurs dans le puits.

Introduction

Les réponses des cellules vasculaires à leur environnement mécanique sont importantes dans le fonctionnement normal des vaisseaux sanguins et dans le développement de la maladie1. La mécanobiologie des cellules endothéliales (CE) qui tapent la surface intérieure de tous les vaisseaux sanguins a été un centre particulier de la recherche mécanobiologique parce que les CE subissent directement le stress de cisaillement généré par le flux sanguin sur eux. Divers changements phénotypiques tels que les réponses inflammatoires, la rigidité et la morphologie altérées, la libération de substances vasoactives, ainsi que la localisation et l’expression des protéines jonctionnelles dépendent de l’exposition à la CE au stress de cisaillement2,3,4. Les propriétés endothéliales dépendantes du cisaillement peuvent également expliquer le développement inégal de maladies telles que l’athérosclérose5,6,7.

Il est utile d’étudier l’effet du cisaillement sur les CE en culture, où les contraintes peuvent être contrôlées et où les CE peuvent être isolés d’autres types de cellules. Les dispositifs in vitro couramment utilisés pour appliquer une contrainte de cisaillement aux CE comprennent la chambre d’écoulement à plaques parallèles et le viscosimètre à cône et plaque, mais seuls les écoulements uniaxiaux stables, oscillatoires et pulsatiles peuvent être appliqués8,9. Bien que des chambres d’écoulement modifiées avec des géométries coniques ou ramifiées et des puces microfluidiques imitant une géométrie par sténose aient été développées, leur faible débit et la durée de culture relativement courte qui est possible posent un défi10, 11.

La méthode du shaker orbital (ou du tourbillon bien) pour l’étude de la mécanotransduction endothéliale, dans laquelle les cellules sont cultivées dans un plastique de culture cellulaire standard placé sur la plate-forme d’un shaker orbital, attire de plus en plus l’attention parce qu’elle est capable d’imposer de manière chronique des modèles de contrainte de cisaillement complexes et spatialement variables sur les CE à haut débit (voir l’examen par Warboys et al.12). Des simulations de dynamique des fluides numérique (CFD) ont été utilisées pour caractériser la variation spatiale et temporelle de la contrainte de cisaillement dans un puits tourbillonnant. Le mouvement tourbillonnant du milieu de culture causé par le mouvement orbital de la plate-forme agitatrice sur laquelle la plaque est placée conduit à un écoulement multidirectionnel de faible magnitude (LMMF, ou flux putativement pro-athérogène) au centre et à un écoulement uniaxial de magnitude élevée (HMUF, ou flux putativement athéroprotecteur) au bord des puits d’une plaque de 6 puits. Par exemple, la contrainte de cisaillement de la paroi moyenne dans le temps (TAWSS) est d’environ 0,3 Pa au centre et de 0,7 Pa au bord d’une plaque à 6 puits tourbillonnante à 150 tr/min avec un rayon orbital de 5 mmde 13. La méthode ne nécessite que de la vaisselle disponible dans le commerce et le shaker orbital lui-même.

Il y a cependant un inconvénient à la méthode (et à d’autres méthodes d’imposition des écoulements in vitro) : les CE libèrent des médiateurs solubles et des microparticules de manière dépendante du cisaillement14,15,16 et ce sécrétome peut affecter les CE dans des régions du puits autres que celle dans laquelle ils ont été libérés, en raison du mélange dans le milieu tourbillonnant. Ceci peut masquer les effets réels de l’effort de cisaillement sur le phénotype d’EC. Par exemple, Ghim et al. ont émis l’hypothèse que cela explique l’influence apparemment identique de différents profils de cisaillement sur le transport transcellulaire de grosses particules17.

Ici nous décrivons une méthode pour favoriser l’adhérence endothéliale humaine de cellules de veine ombilicale (HUVEC) dans des régions spécifiques d’un plat de 6 puits utilisant le revêtement de fibronectin tout en utilisant pluronique F-127 pour passivate la surface et empêcher la croissance ailleurs. La méthode résout la limitation décrite ci-dessus car, en segmentant la croissance cellulaire, les CE n’éprouvent qu’un seul type de profil de cisaillement et ne sont pas influencés par les sécrétomes des CE exposés à d’autres profils ailleurs dans le puits.

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Protocole

1. Fabrication de dispositifs et préparation de réactifs

  1. Fabrication d’un module en acier inoxydable
    1. Fabriquer le module en acier inoxydable à partir d’un acier inoxydable de nuance 316 à l’aide d’une fraiseuse CNC selon le dessin technique fourni(figure 1).
  2. Impression 3D d’un moule en polydiméthylsiloxane (PDMS)
    1. Préparez un modèle de conception assistée par ordinateur (CAO) 3D du moule PDMS à l’aide de SolidWorks conformément au dessin technique fourni(Figure 2).
    2. Exportez le modèle CAO vers un fichier STL et importez le fichier STL dans Cura 2.6.2.
    3. Découpez le modèle en couches avec une vitesse d’impression de 50 mm/s et une densité de remplissage de 60 %.
    4. Exportez le fichier en tant que code G et téléchargez-le sur une imprimante 3D Ultimaker2 pour l’impression. Utilisez l’acide polylactique (PLA) comme matériau d’impression.
  3. Coulée de l’anneau PDMS
    1. Mélanger la base PDMS et l’agent de durcissement (tous deux à partir d’un kit d’élastomère de silicone) avec le rapport de 90,9% de base et 9,1% d’agent de durcissement.
    2. Verser environ 2,6 mL de la solution bien mélangée dans le moule imprimé en 3D.
    3. Retirez les bulles dans une chambre de dégazage sous vide.
    4. Durcir pendant 1 h dans un four à 80 °C.
    5. Laissez l’anneau PDMS refroidir à température ambiante, puis retirez soigneusement l’anneau PDMS durci du moule. Le dessin technique de l’anneau PDMS est illustré à la figure 3.
  4. Préparation de 1% Pluronic F-127
    1. Peser 5 g de Pluronic F-127, le verser dans une bouteille en verre, puis ajouter 100 mL d’eau stérile dans la bouteille en verre. Cela donne une solution pluronique F-127 à 5%.
    2. Assurez-vous que toute la poudre pluronique F-127 est immergée dans l’eau, fermez le bouchon et autoclavez-le à l’aide d’un programme de cycle de stérilisation liquide.
    3. Après l’autoclave, laissez la solution refroidir à température ambiante avant utilisation.
    4. Ajouter 10 mL de solution pluronique F-127 à 5% à 40 mL d’eau stérile autoclavée pour faire une solution pluronique F-127 à 1%. Effectuez la dilution dans une hotte d’armoire de biosécurité (ESB).
    5. Conservez 1 % et 5 % de Pluronic F-127 à température ambiante.
  5. Préparation de paraformaldéhyde à 4% (PFA)
    1. Ajouter 800 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sur un bécher en verre et le chauffer à 60 °C sous agitation (continuer à agiter de l’étape 1.5.1 à 1.5.5).
    2. Peser 40 g de poudre de PFA et l’ajouter à la solution de PBS chaude.
      ATTENTION: PFA est dangereux, effectuez les étapes 1.5.2 à 1.5.6 dans une hotte.
    3. Ajouter de l’hydroxyde de sodium (NaOH) 1 M lentement dans la solution de PFA jusqu’à ce que les solutions deviennent claires.
    4. Ajuster le pH de la solution de PFA à environ 7,4 avec 1 M d’acide chlorhydrique (HCl).
    5. Rechargez la solution à 1 L avec un PBS 1X. Cela donne 1 L de 4% PFA.
    6. Filtrer la solution de PFA avec des filtres de 0,2 μm pour éliminer les particules, aliquoter et congeler dans un congélateur à -20 °C.
  6. Préparation de 0,1% Triton-X
    1. Ajouter 50 μL de Triton-X pur dans 50 mL de PBS pour obtenir une solution de Triton-X à 0,1 %.
  7. Préparation de 1% d’albumine sérique bovine (BSA)
    1. Peser 0,5 g de BSA, le verser dans un tube centrifuge de 50 mL, puis ajouter 50 mL de PBS dans le tube.
    2. Laissez rouler pendant 1 h à température ambiante sur un rouleau pour le dissoudre.
    3. Conservez 1 % de BSA à 4 °C jusqu’à deux semaines.

2. Revêtement d’une plaque de 6 puits

  1. Module en acier inoxydable autoclave, bague PDMS et pince à épiler avant utilisation. Effectuez toutes les procédures suivantes dans une hotte BSC et observez les techniques aseptiques pour assurer la stérilité.
  2. Placez l’anneau PDMS dans un 6-well à l’aide d’une pince à épiler. Utilisez le bord externe de l’anneau PDMS pour aligner l’anneau PDMS concentriquement avec le puits.
    NOTA : Seules les plaques de puits traitées par culture non tissulaire doivent être utilisées.
  3. Placez le module en acier inoxydable sur le dessus de l’anneau PDMS à l’aide d’une pince à épiler.
  4. Insérez les extrémités de la pince interne de l’anneau de retenue dans les trous de poignée de l’anneau de retenue, pressez le support pour réduire le diamètre de l’anneau de retenue. Placez-le dans le 6-well, appuyez fermement sur le module en acier inoxydable et relâchez les pinces pour fixer l’anneau PDMS dans le puits.
  5. Ajouter 1 mL de fibronectine de 5 μg/mL au centre ou au bord du puits (selon la région d’intérêt) par l’ouverture de l’anneau PDMS et du module en acier inoxydable.
  6. Faire tourbillonner la plaque pour s’assurer que la solution de fibronectine couvre toute la région d’intérêt.
  7. Incuber pendant 30 min à 37°C dans un incubateur humidifié sous 95% d’air/5% deCO2.
  8. Retirer la solution de fibronectine du puits et laver deux fois avec du PBS. Retirez complètement le PBS du puits.
  9. Retirez l’anneau de retenue, le module en acier inoxydable et l’anneau PDMS du puits.
  10. Ajouter 1,5 mL de 1 % de Pluronic F-127 au centre ou au bord du puits (surface non revêtue) et incuber pendant 1 h à température ambiante pour passiver la surface non revêtue.
  11. Retirez la solution Pluronic F-127 du puits et lavez trois fois avec du PBS.
  12. Utilisez le puits enduit immédiatement ou conservez-le à 4 °C jusqu’à deux semaines avec une couche de PBS dans le puits enduit.

3. Ensemencement des HUVECs

  1. Utilisez HUVECs sous le passage 5 dans l’expérience.
  2. Retirer tout milieu de culture et laver les cellules une fois avec du PBS.
  3. Ajouter 3 mL de trypsine à 0,05 % et incuber pendant 3 min à 37 °C dans un incubateur humidifié sous 95 % d’air/5 % deCO2. Tapotez doucement le ballon pour déloger les cellules.
    REMARQUE: Ce protocole a été testé à l’aide de HUVECs et la concentration de trypsine et son temps d’incubation peuvent être différents pour d’autres types de CE.
  4. Transférer la solution dans un tube à centrifuger de 15 mL et neutraliser la trypsine à l’aide de 6 mL de milieu de culture (p. ex. Lonza EGM-2) pré-feu à 37 °C.
  5. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min. Retirer la solution neutralisée de trypsine et ressusciter les cellules avec 1 mL de milieu de culture pré-feu.
  6. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et ensemencez des cellules de 180 k dans une plaque de 6 puits enrobée dans 1,5 mL de milieu de culture pré-feu.
  7. Agiter latéralement la plaque du puits pour s’assurer que les cellules se répartissent uniformément dans le puits.
  8. Laissez-le dans un incubateur humidifié à 37 °C sous 95 % d’air/5 % deCO2 pendant la nuit.
  9. Retirer les cellules et le milieu de culture non attachés et les remplacer par 2 ml de milieu de culture pré-conformé.
    Remarque : de nombreuses cellules non attachées flottant dans le milieu sont attendues.

4. Application de contraintes de cisaillement à l’aide d’un agitateur orbital

  1. HUVECs devrait atteindre la confluence après 3 jours de croissance. Remplacer le milieu par 1,9 mL de milieu de culture pré-feu (pour atteindre une hauteur de 2 mm).
  2. Placer la plaque sur la plate-forme d’un agitateur orbital dans un incubateur humidifié sous 95% d’air/5% deCO2 et la faire tourbillonner à 150 rpm pendant 3 jours.
    REMARQUE: Essuyez la surface extérieure du shaker orbital à l’aide d’éthanol à 70% avant de le placer dans l’incubateur.
  3. (Facultatif) Après 2 jours de cisaillement, des cytokines peuvent être ajoutées au milieu de culture pour étudier l’interaction entre les cytokines et le stress de cisaillement. Après le traitement, caillez les cellules pour un autre jour. Dans cette étude, le TNF-α a été utilisé pour activer les cellules.
  4. Effectuer des analyses après 3 jours d’application de contrainte de cisaillement.

5. Coloration et imagerie des cellules

  1. Après 3 jours de cisaillement, retirez la plaque de l’incubateur et lavez les cellules deux fois avec du PBS.
  2. Fixer les cellules en ajoutant 1,5 mL de 4% de PFA dans le puits et incuber pendant 10 min à température ambiante.
  3. Retirer le PFA à 4 % du puits et laver deux fois avec du PBS.
  4. Perméabiliser les cellules en ajoutant 0,1% de Triton-X dans le puits et incuber pendant 5 min à température ambiante.
  5. Retirez la solution Triton-X à 0,1 % du puits et ajoutez 1,5 mL de BSA à 1 % dans le puits pour le bloquer. Incuber les cellules avec 1% BSA pendant 1 h à température ambiante.
  6. Diluer l’anticorps anti-humain ZO-1 de lapin à une dilution de 1:200 dans BSA de 1%. Ajouter 1,5 mL d’anticorps dilués dans le puits et l’incuber avec les cellules pendant une nuit à 4 °C.
  7. Après une incubation nocturne, retirer les anticorps dilués et laver les cellules trois fois avec du PBS.
  8. Diluer l’anticorps secondaire IgG anti-lapin marqué par Alexa Fluor 488 à une dilution de 1:300 dans le PBS. Ajouter 1,5 mL d’anticorps secondaires dilués dans le puits et l’incuber avec les cellules pendant 1 h à température ambiante.
  9. Enlever l’anticorps secondaire dilué et laver les cellules deux fois avec du PBS.
  10. Diluer DRAQ5 à une dilution de 1:1000 dans le PBS. Ajouter 1,5 mL de DRAQ5 dilué dans le puits et l’incuber avec les cellules pendant 15 min à température ambiante pour tacher les noyaux cellulaires.
  11. Retirez le DRAQ5 dilué et lavez trois fois avec du PBS.
  12. Effectuez un balayage de tuiles du bord au centre du puits avec un microscope confocal.

6. Quantification de l’indice de forme et du nombre de cellules

  1. Post-traiter les images à l’aide de MATLAB R2016a.
  2. Lisez le fichier LIF du microscope confocal dans MATLAB et convertissez le balayage de tuiles fusionné en une image binaire, puis seuilz l’image par zone et intensité pour distinguer les noyaux de l’arrière-plan.
  3. Subdiviser le balayage de tuile binaire en segments radiaux de 1 mm.
  4. Ajustez une ellipse à chaque noyau individuel.
  5. Comptez le nombre d’ellipses dans chaque segment radial pour donner un numéro de cellule.
  6. Définissez l’indice de forme = comme SI = 4π x Surface / Périmètre2. Calculez l’indice de forme pour chaque ellipse18.

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Résultats

L’adhérence de HUVECs aux régions du plat de puits non revêtues de fibronectin a été abrogée par passivation pluronique F-127 ; La croissance a été confinée à la région recouverte de fibronectine même après 72 h de culture, avec et sans application de contrainte de cisaillement(figure 4A, figure 4C). Sans la passivation pluronique F-127, les HUVECs se sont fixés à la surface sans fibronectine et avaient proliféré davantage de 72 ...

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Discussion

La méthode des puits tourbillonnants est capable de générer des profils d’écoulement complexes dans un seul puits - flux multidirectionnel de faible magnitude (LMMF) au centre et écoulement uniaxial de haute magnitude (HMUF) au bord du puits. Cependant, les sécrétions médiées par le stress de cisaillement du médiateur soluble seront mélangées dans le milieu tourbillonnant et affecteront les cellules de l’ensemble du puits, masquant potentiellement le véritable effet d’un profil de stress de cisaillement particulier sur l...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient chaleureusement une subvention de projet de la British Heart Foundation (à PDW), une subvention TAAP et DYNAMO du National Medical Research Council Singapore (à XW, NMRC/OFLCG/004/2018, NMRC/OFLCG/001/2017), une bourse d’études supérieures A*STAR (à KTP) et une bourse d’études du British Heart Foundation Center of Research Excellence (à MA).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Cell and Media
Endothelial Growth Medium (EGM-2)Lonzacc-3162
Cellules endothéliales de la veine ombilicale humaineNANA Isoléesà partir de cordons obtenus de donneurs dont le travail n’a pas été compliqué à l’hôpital Hammersmith
Réactifs et matériaux
Alexa Fuor 488-labellisé chèvre anti-lapin IgGThermofisher ScientificA11008
Sérum bovin AlbumineSigma-AldrichA9418-50G
Falcon 6 Bien Clair Fond Plat Non Traité  ;Fournitures de laboratoire scientifique Ltd.
Fibronectine du plasma bovinSigma-AldrichF1141-5MG
ParaformaldéhydeSigma-Aldrich158127-500G
Saline tamponnée au phosphateSigma-AldrichD8537-6X500ML
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443
TNF humain recombinantPeprotech300-01A
RS PRO 2,85 mm Filament d’imprimante 3D PLA noir, 1 kgRS832-0264
Acier inoxydable 316Metal SupermarketNA
Sylgard184 Kit d’élastomère de siliconeFarnell101697
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100ML
Solution trypsine-EDTASigma-AldrichT4049-100ML
Anticorps Zonula Occludens-1 (ZO-1)Technologie de signalisation cellulaire13663
DRAQ5 (5mM)Bio StatusDR50200
Equipments
Grant Orbital Shaker PSU-10iScientific Laboratory Supplies Ltd  ;
Microscope confocal Leica TCS SP5LeicaNA
MisumiRTWP32-58
Bagues de retenue/Interne/Type CMisumiRTWS35
Imprimante Ultimaker 2+3DUltimakerNA
strong>Softwares
Cura 2.6.2UltimakerNA
MATLABThe MathWorksNA
Solidworks 2016Dassault SystemesNA
351146SHA7930 Pince à anneau de retenue <

Références

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