Article de méthode

Une méthode de nettoyage des tissus hydrophobes pour le tissu cérébral de rat

DOI :

10.3791/61821

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23 décembre 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons ici une méthode de nettoyage des tissus hydrophobes qui permet de visualiser les molécules cibles dans le cadre de structures cérébrales intactes. Cette technique a maintenant été validée pour les rats transgéniques F344/N et le VIH-1 des deux sexes.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les méthodes de nettoyage des tissus hydrophobes sont des procédures facilement ajustables, rapides et peu coûteuses qui permettent l’étude d’une molécule d’intérêt dans des échantillons de tissus non inaltérables. Les procédures traditionnelles d’immunomarquage nécessitent de couper l’échantillon en sections minces, ce qui limite la capacité d’étiqueter et d’examiner les structures intactes. Cependant, si le tissu cérébral peut rester intact pendant le traitement, les structures et les circuits peuvent rester intacts pour l’analyse. Les méthodes de nettoyage précédemment établies prennent beaucoup de temps pour nettoyer complètement le tissu, et les produits chimiques agressifs peuvent souvent endommager les anticorps sensibles. La méthode iDISCO élimine rapidement et complètement les tissus, est compatible avec de nombreux anticorps et ne nécessite aucun équipement de laboratoire spécial. Cette technique a été initialement validée pour l’utilisation dans les tissus de souris, mais le protocole actuel adapte cette méthode à l’imagerie des hémisphères de contrôle et des cerveaux de rats transgéniques. En plus de cela, le protocole actuel apporte également plusieurs ajustements au protocole préexistant pour fournir des images plus claires avec moins de taches d’arrière-plan. Les anticorps dirigés contre l’Iba-1 et la tyrosine hydroxylase ont été validés chez le rat transgénique VIH-1 et chez les rats témoins F344/N en utilisant la méthode actuelle de nettoyage des tissus hydrophobes. Le cerveau est un réseau entrelacé, où les structures travaillent ensemble plus souvent que séparément les unes des autres. L’analyse du cerveau en tant que système entier par opposition à une combinaison de pièces individuelles est le plus grand avantage de cette méthode d’éclaircissement du cerveau entier.

Introduction

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Plusieurs techniques de nettoyage des tissus ont été validées pour une utilisation dans le cerveau : hydrogel, hydrophile et hydrophobe. Ces techniques visent à rendre un tissu transparent par délipidation, décoloration et décalcification via l’administration de solvants. Une fois que l’indice de réfraction de l’échantillon de tissu correspond à l’indice de réfraction du milieu d’imagerie choisi, une image claire de l’échantillon peut être obtenue. Les techniques à base d’hydrogel, telles que CLARITY, sécurisent les biomolécules dans les tissus en les reliant à des hydrogels à base d’acryl, ce qui empêche les dommages structurels et la perte de protéines1. Cependant, les techniques d’hydrogel utilisent des produits chimiques agressifs qui ont le potentiel d’endommager des tissus plus fragiles, et des échantillons de tissus plus denses peuvent ne pas être compatibles avec le protocole d’hydrogel. Certaines techniques d’hydrogel peuvent nécessiter un équipement coûteux ou entraîner une expansion des tissus. Les techniques hydrophiles, comme CUBIC, préservent la structure 3D par la formation de liaisons hydrogène dans le tissu2. L’expansion tissulaire peut également se produire dans certains protocoles hydrophiles. La capacité de nettoyage des techniques hydrophiles ne correspond souvent pas à la capacité des techniques hydrophobes, ce qui est important pour les tissus plus denses et plus épais3.

Les techniques hydrophobes sont généralement rapides, ne nécessitent pas d’équipement spécial et produisent un échantillon facile à manipuler et à stocker. iDISCO est une technique hydrophobe qui élimine le retrait qui peut se produire dans d’autres protocoles hydrophobes. À l’origine, la technique de nettoyage des tissus iDISCO a été décrite par Renier et al.4 pour les embryons et les organes adultes denses de souris. Cette technique élimine l’eau du tissu lors de l’étape initiale de déshydratation, réduisant ainsi la diffusion de la lumière. Le tissu est perméabilisé pendant le prétraitement pour permettre une pénétration profonde des anticorps. Les colorants Alexa Fluor dans le spectre rouge lointain sont utilisés pour l’immunomarquage afin d’éviter l’autofluorescence du tissu à des longueurs d’onde inférieures5. Les tissus qui ont subi des protocoles de nettoyage hydrophobes peuvent être manipulés facilement et peuvent être imagés plusieurs fois en raison de la longévité des colorants Alexa Fluor. S’ils sont correctement stockés, les tissus peuvent fournir des images pendant des mois à un an après le traitement initial.

Dans le présent protocole, l’anticorps tyrosine hydroxylase (TH), l’anticorps Iba1 et la sous-unité B de la toxine cholérique (CTB) ont été utilisés sur les cerveaux de rats témoins masculins et féminins et transgéniques (Tg) du VIH-1. Le rat HIV-1 Tg possède sept des neuf gènes qui composent le génome viral du VIH-1, ce qui conduit à un modèle non infectieux d’exposition à long terme à la protéine VIH-16,7,8. Des altérations dopaminergiques ont déjà été démontrées chez le rat Tg VIH-1, et le VIH-1 lui-même est une maladie inflammatoire, de sorte que le choix de l’anticorps était pertinent pour le plan expérimental9,10,11,12. CTB est un traceur qui se fixe aux neurones via la liaison ganglioside et peut être utilisé pour tracer les projections afférentes dans le cerveau. CTB a déjà été utilisé pour étudier les projections du noyau accumbens à la zone substantia nigra, deux zones du cerveau fortement impliquées dans les voies dopaminergiques13,14,15.

Dans ce protocole, TH servira de marqueur pour la production de dopamine, et Iba1 marquera la microglie activée. L’anticorps TH utilisé marque sélectivement une seule bande à environ 62 kDa qui correspond à la tyrosine hydroxylase. L’anticorps Iba1 correspond à la séquence carboxy-terminale Iba1. Les deux anticorps ont été élevés chez le lapin et étaient polyclonaux. Le CTB sera utilisé pour le traçage rétrograde des neurones de la zone du noyau accumbens à la zone de la substantia nigra. Le protocole actuel offre également une ligne directrice pour l’ajustement du protocole iDISCO original de deux manières distinctes: 1) réduction globale de la coloration de fond en modifiant les réactifs sériques dans les étapes de blocage, et 2) mise à l’échelle du temps d’incubation pour convenir à des échantillons de tissus plus importants. Dans l’ensemble, le présent protocole fournit des preuves continues que les techniques de clairage hydrophobe sont réalisables dans les tissus cérébraux du rat, n’ont aucune interaction néfaste perceptible avec les protéines virales du VIH-1 et sont compatibles avec les anticorps TH, les anticorps Iba1 et le CTB.

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Protocole

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Tous les protocoles animaux ont été examinés et approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Caroline du Sud.

1. Préparation de la solution d’élevage

  1. Solution 1 (1 L) : À 900 mL de H2O désionisé, ajouter 100 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et 2 mL de Triton X-100.
  2. Solution 2 (1 L) : À 900 mL de H2O désionisé, ajouter 100 mL de 10x PBS, 2mL de Tween-20 et 1 mL de solution mère d’héparine de 10 mg/mL.
  3. Solution 3 (500 mL) : À 400 mL de la solution 1, ajouter 11,5 g de glycine et 100 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO).
  4. Solution 4 (50 mL) : À 42 mL de la Solution 1, ajouter 3 mL de sérum correspondant et 5 mL de DMSO.
  5. Solution d’anticorps primaires (50 mL) : À 46 mL de la solution 2, ajouter 2,5 mL de DMSO et 1,5 mL de sérum correspondant.
  6. Solution d’anticorps secondaires (50 mL) : À 48,5 mL de la solution 2, ajouter 1,5 mL de sérum correspondant.
    REMARQUE : Pour la solution 4, la solution primaire et la solution secondaire, utilisez un sérum qui correspond à l’anticorps secondaire (p. ex. chèvre, cheval, bovin).

2. Préparation de l’échantillon

REMARQUE: Effectuer les étapes 2.1 à 2.7 dans une hotte de fumée afin de limiter l’exposition aux PFA.

  1. Anesthésier profondément les jeunes rats (3-6 semaines) à l’aide de sévoflurane; passer à 2.2 lorsque le rat ne réagit pas et ne répond pas au pincement des orteils et de la queue.
  2. Posez le rat en position couchée et faites une incision à travers la paroi abdominale à l’aide d’une paire de ciseaux Iris.
  3. Coupez à travers le fond de la cage thoracique jusqu’à la clavicule des deux côtés de la cage thoracique à l’aide de ciseaux Mayo.
  4. Apposez le sternum et les côtes loin du cœur et des poumons avec un hémostat.
  5. Percer le ventricule gauche avec une aiguille de 23 G attachée à une pompe de perfusion et couper l’oreillette droite avec des ciseaux à iris.
  6. Effectuer une perfusion transcardique avec environ 75 mL de 100 mM (1x) PBS.
  7. Poursuivre la perfusion transcardique avec environ 100 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % tamponné dans 1x PBS.
  8. Retirez le cerveau du crâne à l’aide d’une pince.
  9. Placez le cerveau en position sagittale et coupez-le en 4 sections égales (environ 3 mm de largeur) à l’aide d’une lame de rasoir et d’une matrice cérébrale de rat.
  10. Fixez chaque section dans 4% de PFA dans 1x PBS dans un tube en plastique scellé de 5 ml pendant la nuit à 4 ° C sur un agitateur.
  11. Continuer à fixer 4% PFA dans 1x PBS à température ambiante (RT) sur un agitateur pendant 1 h.
  12. Lavez chaque section avec 1x PBS à RT pendant 30 min, 3 fois.

3. Déshydratation et dépigmentation

  1. Incuber l’échantillon dans une solution à 20 % de méthanol/80 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.
  2. Incuber l’échantillon dans une solution à 40 % de méthanol/60 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.
  3. Incuber l’échantillon dans une solution à 60 % de méthanol/40 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.
  4. Incuber l’échantillon dans une solution à 80 % de méthanol/20 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.
  5. Incuber l’échantillon dans du méthanol à 100 % pendant 1 h à RT. Répéter avec plus de 100 % de méthanol, en incubant pendant 1 h à RT.
  6. Refroidir l’échantillon dans du méthanol à 100 % à 4°C pendant environ 10 min.
  7. Préparer une solution de dichlorométhane (DCM) à 66 % / méthanol à 33 %.
  8. Incuber l’échantillon pendant la nuit dans la solution de DCM/méthanol à TA, en agitant.
  9. Laver au méthanol à RT pendant 30 min, 2 fois.
  10. Refroidir l’échantillon dans du méthanol à 100 % à 4°C pendant environ 10 min.
  11. Eau de Javel dans du peroxyde d’hydrogène réfrigéré et fraîchement préparé à 5 % dans du méthanol pendant la nuit à 4 ° C.
  12. Incuber l’échantillon dans une solution à 80 % de méthanol/20 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.
  13. Incuber l’échantillon dans une solution à 60 % de méthanol/40 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.
  14. Incuber l’échantillon dans une solution à 40 % de méthanol/60 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.
  15. Incuber l’échantillon dans une solution à 20 % de méthanol/80 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.
  16. Incuber l’échantillon dans 1x PBS pendant 1 h à RT.
  17. Laver dans la solution 1 pendant 1 h à TA, 2 fois.

4. Étiquetage de la sous-unité B de la toxine cholérique

  1. Insérer l’extrémité de l’aiguille d’une seringue de 1 mL dans le site du noyau accumbens.
  2. Injecter lentement 2,5 μL de 1 % de biotine-CTB sur 20 s.
  3. Laissez la pointe de l’aiguille en place pendant 1 min et retirez-la lentement pendant 10 s pour éviter les fuites.

5. Application d’anticorps

  1. Incuber l’échantillon dans la Solution 3 pendant 2 jours à 37 °C au bain-marie.
  2. Incuber l’échantillon dans la Solution 4 pendant 2 jours à 37 °C au bain-marie.
  3. Incuber avec un anticorps primaire pendant 7 jours à 37 °C au bain-marie.
  4. Laver dans la solution 2 pendant 5 fois, incubation 1 h par lavage. Conserver dans la Solution 2 à RT pendant la nuit.
  5. Incuber avec un anticorps secondaire pendant 7 jours à 37 °C au bain-marie.
  6. Laver dans la solution 2 pendant 5 fois, incubation 1 h par lavage; stocker dans la Solution 2 à RT pendant la nuit.
    REMARQUE: Toutes les étapes à partir de la version 5.6, y compris le stockage final, doivent se produire en basse lumière. Les tubes d’échantillonnage peuvent être protégés avec du papier d’aluminium. Les concentrations utilisées pour les anticorps dans ce protocole étaient: TH à 1:100, Iba1 à 1:200 et l’anticorps secondaire à 1:100. Ajoutez la solution 2 supplémentaire aux étapes 5.1 à 5.6 pour vous assurer que les tubes sont complètement remplis.

6. Nettoyage des tissus

  1. Incuber l’échantillon dans une solution à 20 % de méthanol/80 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.
  2. Incuber l’échantillon dans une solution à 40 % de méthanol/60 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.
  3. Incuber l’échantillon dans une solution à 60 % de méthanol/40 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.
  4. Incuber l’échantillon dans une solution à 80 % de méthanol/20 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.
  5. Incuber l’échantillon dans du méthanol à 100% pendant 1 h à TA.
  6. Incuber dans du méthanol frais 100% pendant la nuit à RT.
  7. Incuber dans 66% de DCM/33% de méthanol pendant 3 h, avec agitation, à température ambiante.
  8. Incuber dans de l’éther dibenzylique (DBE) sans agitation. Laissez l’échantillon dans DBE jusqu’à ce qu’il soit clair et conservez-le dans DBE jusqu’à l’imagerie.

7. Montage

  1. Procurez-vous une chambre imprimée en 3D en résine Visijet M3 Crystal (modèles disponibles sur le site idisco.info).
  2. Fixez la chambre à une lame de microscope à l’aide d’un époxy.
  3. Placez l’échantillon dans l’espace carré au milieu de la chambre.
  4. Remplissez complètement la chambre avec DBE.
  5. Placez un couvercle de 0,17 mm d’épaisseur sur la chambre et appliquez une pression jusqu’à ce que le couvercle ait un contact complet avec les parois de la chambre.
  6. Scellez les bords du couvercle à la chambre à l’aide de l’époxy.
  7. Faites pivoter la chambre pour permettre aux bulles d’air de s’échapper de l’entrée de remplissage.
  8. Remplissez la chambre avec du DBE supplémentaire.
  9. Sceller l’entrée de remplissage avec de l’époxy et laisser durcir.
    REMARQUE: L’excès de DBE se répandra pendant le montage.

8. Imagerie

  1. Utilisez un système de microscope confocal pour effectuer un z-scan à un grossissement 4x (voir la vidéo 3Dci-jointe).
  2. Obtenir une excitation fluorescente de l’échantillon à l’aide d’un laser réglé pour émettre à une longueur d’onde similaire à la longueur d’onde spécifiée par l’anticorps secondaire. L’excitation TH a été réalisée à l’aide d’un laser HeNe réglé pour émettre à 632 nm.
  3. Réglez le détecteur sur une longueur d’onde proche de l’émission laser. Pour le protocole actuel, le détecteur pour TH a été réglé à 650 nm.
  4. Augmentez le gain du détecteur jusqu’à ce qu’il y ait un signal visible. Le gain de 650LP pour les images a été réglé sur 7,50 B.
  5. À l’aide de l’option Scan du logiciel d’imagerie confocale, déplacez l’étage du microscope jusqu’à ce que l’échantillon soit mis au point.
  6. Naviguez autour du tissu dans toutes les plaines et obtenez des images uniques ou des images z-stack à l’aide du logiciel d’imagerie confocale.
  7. Une fois l’imagerie terminée, retirez l’échantillon de la chambre. Replacez-le dans un tube complètement rempli de DBE et conservez-le à RT dans un endroit sombre, de préférence recouvert de papier d’aluminium.
    REMARQUE: Les échantillons peuvent être remontés et imagés tant que le signal de floraison est encore fort.

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Résultats

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L’élimination complète de grandes sections de tissu cérébral de rat F344/N et VIH-1 a été réalisée à l’aide de ce protocole modifié de nettoyage des tissus hydrophobes. La figure 1 montre une image confocale typique de TH dans la région de substantia nigra. La figure 1A représente une coloration dense et positive. Les zones denses comme celles-ci peuvent être analysées en se concentrant à travers le plan « Z » pour confirmer une coloration positive et une morpho...

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Discussion

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L’élimination des tissus offre une solution aux limites du protocole IHC traditionnel. Un échantillon transparent minimise la diffusion et l’absorption de la lumière, ce qui fournit un accès optique au niveau cellulaire aux tissus intacts18,19. Les techniques de nettoyage des tissus transforment un tissu transparent par délipidation, décoloration et décalcification avec l’administration de solvants. Une fois que l’indice de réfraction de l’échantillon de tissu co...

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Déclarations de divulgation

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Aucun des auteurs n’a de conflits d’intérêts à déclarer.

Remerciements

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Ce travail a été financé par des subventions des NIH: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 et par T32 Training Grant 5T32GM081740

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Toxine cholérique Sous-unité B (recombinante), Alexa Fluor 488InvitrogenC34775
DBESigma-Aldrich108014-1KG
DCMSigma-Aldrich270997-100mL
DMSOSigma-Aldrich472301-1L
GlycineFisher ChemicalG46-500
Chèvre anti-lapin Alexa Fluor Plus 647InvitrogenA32733
Sérum de chèvreSigma Life ScienceG9023-10mL
HéparineAcros Organics41121-0010
Anticorps primaire Iba1FUJIFILM Wako019-19741
Kwik-sil epoxyVWR70730-062
MéthanolSigma-Aldrich34860-1L-R
PBSFisher BioreagentsBP2944-100
Machine de perfusionVWR70730-062mini pompe à débit variable
PFASigma-Aldrich158127-3KG
TH Anticorps primaireMillipore SigmaAB152
TritonX-100Fisher BioreagentsBP151-500
Tween-20Fisher BioreagentsRéf. BP337-500

Références

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