Article de méthode

Purification de la tubuline avec modifications posttranslationnelles contrôlées et isotypes à partir de sources limitées par des cycles de polymérisation et de dépolymérisation

DOI :

10.3791/61826

⸱

5 novembre 2020

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1PSL Research University, CNRS UMR3348, Institut Curie, 2Université Paris-Saclay, CNRS UMR3348, Université Paris Sud

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit la purification de la tubuline à partir de sources à petite ou moyenne échelle telles que les cellules de culture ou les cerveaux d’une seule souris, à l’aide de cycles de polymérisation et de dpolymérisation. La tubuline purifiée est enrichie en isotypes spécifiques ou a des modifications posttranslationnelles spécifiques et peut être utilisée dans des tests de reconstitution in vitro pour étudier la dynamique et les interactions des microtubules.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un aspect important des études du cytosquelette de microtubule est l’investigation du comportement de microtubule dans les expériences in vitro de reconstitution. Ils permettent l’analyse des propriétés intrinsèques des microtubules, telles que la dynamique, et de leurs interactions avec les protéines associées aux microtubules (MAP). Le « code de la tubuline » est un concept émergent qui indique différents isotypes de la tubuline et diverses modifications posttranslationnelles (MNP) en tant que régulateurs des propriétés et fonctions des microtubules. Pour explorer les mécanismes moléculaires du code de la tubuline, il est crucial d’effectuer des expériences de reconstitution in vitro à l’aide de tubuline purifiée avec des isotypes et des MNP spécifiques.

À ce jour, cela a été techniquement difficile que la tubuline du cerveau, qui est largement utilisé dans les expériences in vitro, abrite de nombreux M PT et a une composition définie isotype. Par conséquent, nous avons développé ce protocole pour purifier la tubuline à partir de différentes sources et avec différentes compositions d’isotypes et ptms contrôlés, en utilisant l’approche classique des cycles de polymérisation et de démlymerisation. Comparée aux méthodes existantes basées sur la purification d’affinité, cette approche produit la tubuline pure et polymérisation-compétente, car la tubuline résistante à la polymérisation ou à la dénolysation est jetée pendant les étapes successives de purification.

Nous décrivons la purification de la tubuline à partir de lignées cellulaires, cultivées soit en suspension, soit en cultures adhérentes, et à partir de cerveaux de souris simples. La méthode décrit d’abord la génération de masse cellulaire dans les paramètres de suspension et d’adhérent, l’étape de la lyse, suivie des étapes successives de purification de la tubuline par des cycles de polymérisation-dérimérisation. Notre méthode produit de la tubuline qui peut être utilisée dans des expériences traitant de l’impact du code de la tubuline sur les propriétés intrinsèques des microtubules et des interactions microtubules avec les protéines associées.

Introduction

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Les microtubules jouent un rôle essentiel dans de nombreux processus cellulaires. Ils donnent aux cellules leur forme, construisent des fuseaux méiotiques et mitotiques pour la ségrégation chromosomique, et servent de pistes pour le transport intracellulaire. Pour remplir ces diverses fonctions, les microtubules s’organisent de différentes manières. L’une des questions intrigantes sur le terrain est de comprendre les mécanismes moléculaires qui permettent aux microtubules structurellement et évolutionnistes de s’adapter à cette pléthore d’organisations et de fonctions. Un mécanisme potentiel est la diversification des microtubules, qui est définie par le concept connu sous le nom de « code tubulin »1,2,3. Le code de la tubuline comprend deux composantes principales : l’incorporation différentielle de produits géniques α et β-tubulin (isotypes tubulaires) dans les microtubules et les modifications posttranslationnelles à la tubuline (MNP).

Depuis les années 1970, les expériences de reconstitution in vitro, combinées à l’évolution des techniques de microscopie légère, ont ouvert la voie à d’importantes découvertes sur les propriétés des microtubules : instabilitédynamique 4 et tapisroulant 5, et leurs autres mécanismeset fonctions 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Presque toutes les expériences in vitro réalisées jusqu’ici ont été basées sur la tubuline purifiée du tissu cérébral utilisant des cycles répétés de polymérisation et de dpolymérisation16,17. Bien que la purification du tissu cérébral confère l’avantage d’obtenir la tubuline de haute qualité en grandes quantités (généralement des quantités de gramme), un inconvénient important est l’hétérogénéité que la tubuline purifiée à partir du tissu cérébral est un mélange de différents isotypes de tubuline et est enrichi avec de nombreux PTMs tubulin. Cette hétérogénéité rend impossible la délimiture du rôle d’un PTM ou d’un isotype de tubuline particulier dans le contrôle des propriétés et des fonctions des microtubules. Ainsi, la production d’une tubuline compétente en assemblage avec des MNP tubulaires contrôlés et une composition homogène d’isotype est essentielle pour traiter les mécanismes moléculaires du code de la tubuline.

Récemment, une approche pour purifier la tubuline par chromatographie d’affinité utilisant le domaine de TOG microtubule-liant (gène tumeur-surexprimé) de levure Stu2p a étédéveloppée 18. Dans cette méthode, la tubuline dans les lysates bruts des cellules ou des tissus est passée à travers une colonne où elle se lie au domaine TOG immobilisé par matrice, ce qui permet l’analyse de l’ensemble du pool de tubulines d’un échantillon donné, voire très petit. Une approche attendue depuis longtemps pour purifier la tubuline recombinante a également été décrite ces dernières années. Il est basé sur le système de baculovirus, dans lequel un vecteur bi-cistronic contenant des gènes de α- et β-tubulin est exprimé dans les cellules d’insecte19. Cependant, cette méthode est très lourde et prend beaucoup de temps et est donc principalement utilisée pour étudier l’impact des mutations de la tubuline20 et des isotypes de la tubuline21,22,23 in vitro.

Dans le protocole actuel, nous décrivons une méthode qui utilise l’approche bien établie et largement utilisée de polymérisation-dépolymérisation comme modèle pour produire la tubuline avec différents niveaux de modification soit des lignes cellulaires ou du tissu cérébral de souris24. Dans cette procédure, la tubuline est pédalée entre la forme soluble (dimère tubuline à 4 °C) et polymère (microtubule à 30 °C en présence de guanosine 5'-triphosphate [GTP]). Chaque forme est séparée par des étapes successives de centrifugation : les dimers de tubuline resteront dans le supernatant après une rotation froide (4 °C), tandis que les microtubules seront granulés à 30 °C. En outre, une étape de polymérisation est effectuée à haute concentration de piperazine-N,N′-bis (acide 2-éthanesulfonique) (PIPES), ce qui permet l’élimination des protéines associées aux microtubules des microtubules et donc, de la tubuline finalement purifiée. La tubuline purifiée à partir des cellules HeLa S3 cultivées sous forme de cultures de suspension ou d’adhérent est pratiquement exempte de n’importe quelle tubuline PTM et a été utilisée dans des expériences récentes de reconstitution in vitro25,26,27,28. Nous avons en outre adapté la méthode pour purifier la tubuline à partir de cerveaux de souris simples, qui peuvent être utilisés pour un grand nombre de modèles de souris avec des changements dans les isotypes de la tubuline et les MNP.

Dans le protocole, nous décrivons d’abord la génération du matériau source (masse cellulaire ou tissu cérébral), sa lyse (figure 1A), suivie des étapes successives de polymérisation et de dénolysation des tubulines pour purifier la tubuline (Figure 1B). Nous décrivons en outre le processus d’évaluation de la pureté (figure 2A,B) et de la quantité (figure 3A,B) de la tubuline purifiée. La méthode peut être adaptée pour produire de la tubuline enrichie d’un PTM sélectionné en surexprimant une enzyme modérable dans les cellules avant la purification de la tubuline (Figure 4B). Alternativement, des enzymes modifiant la tubuline peuvent être ajoutées à la tubuline pendant le processus de purification. Enfin, nous pouvons purifier la tubuline dépourvue d’isotypes spécifiques ou de MNP provenant du cerveau de souris déficientes dans les enzymes correspondantes modificateurs de la tubuline (figure 4B)29.

La méthode que nous décrivons ici présente deux avantages principaux : (i) elle permet la production de quantités suffisamment importantes de tubuline en relativement peu de temps, et (ii) elle génère une tubuline pure de haute qualité, avec une composition spécifique d’isotype de tubuline ou des MNP. Dans la vidéo associée de ce manuscrit, nous soulignons quelques-unes des étapes critiques impliquées dans cette procédure.

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Protocole

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Les soins et l’utilisation des animaux dans le cadre de cette étude ont été effectués conformément aux recommandations de la Communauté européenne (2010/63/UE). Les procédures expérimentales ont été spécifiquement approuvées par le comité d’éthique de l’Institut Curie CEEA-IC #118 (autorisation n° 04395.03 donnée par l’Autorité nationale) conformément aux directives internationales.

1. Préparation des reagents pour la purification de la tubuline

REMARQUE : Tous les tampons utilisés pour la purification de la tubuline doivent contenir des sels de potassium et non des sels de sodium30.

  1. Préparer 1 L de milieu complet : le milieu eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS, 100 mL), 200 mM de L-glutamine (10 mL de 2 M de bouillon) et 1 x pénicilline-streptomycine (10 mL de stock de 100 x). Conserver à 4 °C.
  2. Préparer 10 M d’hydroxyde de potassium (KOH) en dissolvant 140 g de KOH dans l’eau, ajuster le volume final à 250 mL et les conserver à température ambiante.
  3. Préparer 0,5 M d’acide tétracétique éthylènediamine (EDTA), pH 8, en dissolvant 36,5 g d’EDTA dans l’eau, ajuster le pH à 8,0 à l’aide de KOH (sinon EDTA ne se dissoudra pas) et le volume final à 250 mL, filtrer-stériliser, et stocker à température ambiante.
  4. Préparer 5 mM de solution saline tamponnée de phosphate (PBS)-EDTA en ajoutant 5 mL de 0,5 M EDTA à 500 mL de PBS, filtrer-stériliser et conserver à température ambiante.
  5. Préparer 0,5 M K-PIPES, pH 6.8, en dissolvant 75,5 g de PIPES dans l’eau, ajuster au pH 6.8 avec KOH (sinon PIPES ne se dissoudra pas) et le volume final à 500 mL, filtrer-stériliser, et stocker à 4 °C.
  6. Préparer 1 M K-PIPES, pH 6.8, en dissolvant 15,1 g de PIPES dans l’eau, ajuster au pH 6.8 avec KOH et le volume final à 50 mL, filtrer-stériliser, et stocker à 4 °C.
  7. Préparer 0,5 M potassium-éthylène glycol-bis (éther β-aminoethyl)-N,N,N′,N′-acide tétraacétique (K-EGTA, pH 7.7) en dissolvant 47,5 g d’EGTA dans l’eau, ajuster au pH 7,7 avec KOH et le volume final à 250 mL, filtrer-stériliser, et stocker à température ambiante.
  8. Préparer BRB80 (80 mM K-PIPES, pH 6,8; 1 mM K-EGTA; 1 mM chlorure de magnésium [MgCl2])solution en mélangeant 3,2 mL de 0,5 M PIPES, 40 μL de 0,5 M K-EGTA, et 20 μL de 1 M MgCl2 et ajuster le volume final à 20 mL. Conserver à 4 °C.
  9. Préparer 0,1 M de fluorure de phénythéthanesulfonyl (PMSF) en dissolvant 435 mg de PMSF dans l’isopropanol pour obtenir un volume final de 25 mL et conserver à -20 °C.
  10. Préparer le mélange d’inhibiteurs de la protéase (200x) en dissolvant 10 mg d’aprotinine, 10 mg de leupeptine et 10 mg de fluorure de benzénerosulfonyl de 4(2 aminoéthyles) dans l’eau pour obtenir un volume final de 2,5 mL, faire des aliquots de 100 μL et les conserver à -20 °C.
  11. Préparer 10% Triton X-100 en mélangeant 5 mL de Triton X-100 dans 45 mL d’eau, filtrer-stériliser, et stocker à température ambiante.
  12. Préparer le tampon de lyse (BRB80 complété par 1 mM 2-mercaptoéthanol, 1 mM PMSF, 1x inhibiteurs de protéase mélange et, en option pour les cellules HEK-293, 0,2% Triton X-100) le jour de la purification de la tubuline en mélangeant 20 mL de BRB80 avec 1,5 μL de 2-mercaptoéthanol, 200 μL de 0,1 M PMSF, 100 μL du mélange inhibiteurs de la protéase et, en option, pour les cellules HEK-293 , 400 μL de 10% Triton X-100.
    REMARQUE : Le 2-mercaptoéthanol est toxique et doit être utilisé dans le capot de fumée.
  13. Préparer 0,2 M GTP en dissolvant 1 g de GTP dans 9,5 mL d’eau, ajuster le pH à 7,5 à l’aide de KOH, faire des aliquots de 20 μL et les conserver à -20 °C. Évitez les cycles répétés de gel-dégel.
  14. Préparer 1 M tris (hydroxyméthyle) aminométhane-hydrochlorure (Tris-HCl) en dissolvant 60,56 g de Tris dans l’eau, ajuster au pH 6,8 avec HCl, avec un volume final de 500 mL, filtrer-stériliser, et stocker à température ambiante.
  15. Préparer 5x Tampon échantillon Laemmli (450 mM dithiothreitol (TNT); 10% dodecylsulfate de sodium (SDS); 400 μM Tris-HCl, pH 6,8; 50% glycérol; ~0,006% bleu bromophénol) en ajoutant 4 g de SDS à 16 mL de préchauffé 1 M Tris-HCl, pH 6,8, et mélanger la solution doucement. Ajouter 2,6 g de TNT et 20 mL de glycérol à 100 % au mélange et remuer jusqu’à ce que la solution devienne homogène. Ajouter la quantité désirée de bleu bromophénol (2,5 mg) pour atteindre l’intensité de couleur requise. Faire 5 mL aliquots et conserver à -20 °C. Préparer la solution 2x de travail de tampon échantillon Laemmli en diluant le stock 5x dans de l’eau distillée.

2. Amplification et récolte des sources de tubuline

REMARQUE : Dans ce protocole, trois sources de tubuline ont été utilisées : (i) les cellules (HeLa S3 et HEK-293) cultivées en cultures de suspension; (ii) les cellules cultivées en tant que cultures adhérentes (HEK-293, HeLa et U2 OS); et (iii) tissu cérébral de souris. Ce protocole considère le jour de purification de la tubuline comme « jour 0 » et, par conséquent, d’autres étapes ont été décrites par rapport au jour 0.

  1. Amplification des cellules
    1. Cellules cultivées en tant que cultures de suspension
      REMARQUE : Pour purifier avec succès la tubuline des cultures de suspension, utilisez au moins 2 L de culture de suspension.
      1. Pour 2 L de culture de suspension, raviver et cultiver le type de cellule préféré pour obtenir 6 × 107 cellules 10 jours avant le jour de la préparation. Le jour -10, plaques sur six plats de 15 cm de diamètre à 107 cellules par assiette.
      2. Le jour -8, préchauffer la quantité requise de milieu complet à 37 °C. Ajouter 1 L de milieu préchauffé à chaque bouteille de filature dans des conditions stériles. Placez les essoreurs sur une table agitée fixée à 20-25 tours à l’intérieur de l’incubateur de culture cellulaire, ouvrez légèrement les bouchons de filature latérale pour permettre au milieu d’équilibrer à l’atmosphère de l’incubateur.
        REMARQUE : Pour éviter toute contamination, nettoyez soigneusement la surface extérieure des bouteilles multimédias et filatures à l’aide de 70 % d’éthanol.
      3. Le jour -7, trypsinize et recueillir les cellules cultivées à 80-90% confluent (environ 1,8 × 108 cellules). Recueillir les cellules à partir de 3 plats à la fois, tourner vers le bas (200 × g, 5 min, température ambiante), et re-suspendre toutes les cellules dans 10 mL de DMEM.
        REMARQUE : La dissociation complète des cellules à ce stade est très importante pour éviter la formation de plus gros agrégats dans les bouteilles de filature, ce qui affecte la survie cellulaire et entraîne un faible rendement en tubuline.
      4. Ajouter 5 mL de suspension cellulaire à chaque bouteille de spinner contenant 1 L de DMEM, remettre les essoreuses à la table d’agitateur dans l’incubateur de culture cellulaire, et permettre aux cellules de croître pendant une semaine.
    2. Cellules cultivées en tant que cultures adhérentes
      REMARQUE : Pour purifier avec succès la tubuline des cellules adhérentes, utilisez un minimum de 10 plats de 80 à 90 % de confluence.
      1. Raviver et amplifier le type de cellule désiré pour obtenir 1 × 108 cellules trois jours avant le jour de la préparation de la tubuline.
      2. Le jour -3, plaquez ces cellules sur dix plats de 15 cm à 1 × 107cellules par plat et laissez-les pousser 80-90% de confluence.
      3. Le jour -1, si nécessaire, les cellules transfect avec un plasmide pour exprimer une enzyme modifiant la tubuline ou un isotype particulier de la tubuline.
  2. Récolte des cellules et des tissus cérébraux
    1. Cellules cultivées en tant que cultures de suspension
      1. Transférer la suspension cellulaire des essoreuses dans 1 bouteille de centrifugeuse L(table des matériaux)et les cellules à granulés à 250 × g,15 min, température ambiante. Pour commencer immédiatement une autre culture des cellules HeLa S3 dans les bouteilles de filature, laissez 100 mL de suspension cellulaire dans les essoreuses, et ajoutez 1 L de DMEM complet et préchauffé à la bouteille de filature.
        REMARQUE : Vérifiez soigneusement la contamination bactérienne avant de procéder à la purification de la tubuline.
      2. Resuspendez les cellules granulées de chaque bouteille de centrifugeuse dans 10 mL de PBS glacé, et transférez toutes les cellules dans des tubes à bouchon à vis de 50 mL. Pendant la suspension, garder les cellules sur la glace. Pelleter les cellules à 250 × g,15 min, 4 °C.
        REMARQUE : Suivez les recommandations concernant le nettoyage et l’entreposage des bouteilles de filature (voir tableau des matériaux).
      3. Jetez le supernatant et déterminez le volume de la pastille cellulaire. De 2 L de culture de suspension (deux bouteilles de spinner), attendez-vous à une pastille cellulaire de 5-6 mL.
        REMARQUE : Dans le protocole décrit ci-dessous, le volume de granulés cellulaires est supposé être de 10 mL. Ajustez l’expérience en fonction des volumes de granulés.
      4. Ajouter 1 volume (10 mL) de tampon de lyse et suspendre à nouveau la pastille cellulaire.
        REMARQUE : Le rapport entre le volume de granulés cellulaires et le volume tampon de lyse est très important pour la purification réussie de la tubuline. L’ajout de plus de tampon de lyse diminue la concentration de tubuline, qui n’atteint alors pas la concentration critique nécessaire à la polymérisation, réduisant ainsi considérablement le rendement de la tubuline.
        REMARQUE : Les cellules résusées dans le tampon de lyse peuvent être congelées dans de l’azote liquide et stockées à -80 °C pendant deux mois.
    2. Cellules cultivées en tant que cultures adhérentes
      REMARQUE : Les cellules des cultures adhérentes doivent être récoltées très rapidement pour une purification réussie de la tubuline (environ 15 minutes pour la récolte de dix plats de 15 cm). Trois personnes ont participé à cette étape du protocole.
      1. Retirer le milieu de la vaisselle de 15 cm en inclinant la vaisselle, puis laver délicatement les cellules avec 7 mL de PBS-EDTA à température ambiante (personne 1). Ne travaillez qu’avec trois plats de 15 cm à la fois pour éviter de laisser les cellules sans milieu ni tampon.
      2. Ajouter 5 mL de PBS-EDTA aux cellules et les incuber pendant 5 min à température ambiante.
      3. Utilisez un élévateur cellulaire pour détacher doucement les cellules en les pelletant à un bord du plat (personne 2), et recueillir toutes les cellules dans un tube à bouchon à vis de 50 mL (personne 3). Rincer chaque assiette avec 2 mL supplémentaires de PBS-EDTA pour recueillir les cellules restantes de la vaisselle. Au cours de cette étape, gardez le tube de bouchon à vis de 50 mL contenant la suspension cellulaire sur la glace.
      4. Pelleter les cellules à 250 × g,10 min, 4 °C. Jetez le supernatant et déterminez le volume de la pastille cellulaire. Attendez-vous à un volume d’environ 1 mL à partir de dix plats de 15 cm.
        REMARQUE : Dans le protocole décrit ci-dessous, le volume de granulés cellulaires est supposé être de 10 mL. Ajustez les expériences en fonction des volumes de granulés.
      5. Resuspendez les cellules en 1 volume (10 mL) de tampon de lyse.
        REMARQUE : Les cellules réutilisées dans le tampon de lyse peuvent être stockées à -80 °C jusqu’à deux mois.
    3. Tissu cérébral
      REMARQUE : Des souris de tout âge, sexe ou origine génétique peuvent être utilisées. Le choix de la souche transgénique de la souris dépendra de la question scientifique à traiter. Dans ce manuscrit, nous montrons l’exemple de la tubuline purifiée à partir de la ttll1-/- souris, dépourvue d’une enzyme fessier majeure du cerveau, la protéine31de la tyrosine tyrosine de la baignoire 1 (TTLL1).
      1. Sacrifiez la souris par dislocation cervicale, décapitez rapidement et rassemblez le cerveau dans un tube à fond rond. S’il y a excès de sang sur le cerveau, lavez-le rapidement avec un tampon de lyse. Recueillir le cerveau dès que la souris est sacrifiée comme un retard post mortem peut affecter le succès de la purification de la tubuline. Utilisez des tubes à fond rond pour tenir compte de la largeur de la sonde utilisée pour l’homogénéisation.
        REMARQUE : Les cerveaux de souris collectés peuvent être congelés dans de l’azote liquide et stockés à -80 °C jusqu’à 3 ans.
      2. Ajouter 500 μL de tampon de lyse à un seul cerveau extrait d’une souris adulte. Pour le reste du protocole, le volume de tampon de lyse ajouté est supposé être de 10 mL. Ajustez-vous pour votre expérience en fonction du nombre de cerveaux à utiliser.

3. Lyse des cellules ou des tissus cérébraux

  1. Cellules cultivées en tant que cultures de suspension
    1. Pour HEK-293, lyse les cellules sur la glace en pipetting répétitivement de haut en bas à l’aide de pointes pipette de différentes largeurs. Tout d’abord, fixez une pointe p1000 à une pipette de 10 mL, et pipette la suspension cellulaire de haut en bas toutes les 5 minutes, pendant 10 min (trois cycles de pipetage). Deuxièmement, fixez une pointe p200 à une pointe p1000 et une pipette supplémentaire toutes les 5 minutes, pendant 20 min (cinq cycles de pipetage).
    2. Pour HeLa S3, lyse les cellules à l’aide d’Français presse (voir tableau des matériaux pour les paramètres).
    3. Prendre 1/100e de volume du mélange de lyse (L) (200 μL pour 20 mL de L), et ajouter le même volume de tampon Laemmli 2x, faire bouillir pendant 5 min, et conserver à -20 °C pour une analyse plus approfondie.
  2. Cellules cultivées en tant que cultures adhérentes
    1. Transférer les cellules dans un tube à fond rond de 14 mL dont la hauteur a été réduite pour accueillir la sonde sonicator (voir tableau des matériaux pour les réglages). Sonicate les cellules pour ~ 45 impulsions, et de confirmer la lyse cellulaire en échantillonnant une goutte du mélange de lyse sous un microscope.
      REMARQUE : Le nombre d’impulsions peut varier selon le type de cellule utilisé pour la purification de la tubuline. Des cellules sonicantes trop pourraient provoquer une précipitation de la tubuline et affecter négativement le rendement de purification.
    2. Pipette les cellules de haut en bas sur la glace toutes les 5 minutes pendant 20 min (cinq cycles de pipetage), à l’aide d’une pointe p200.
    3. Prendre 1/100e volume de mélange de lyse (L) (200 μL pour 20 mL de L) et ajouter le même volume de tampon Laemmli 2x, faire bouillir pendant 5 minutes et conserver à -20 °C pour une analyse plus approfondie.
  3. Tissu cérébral
    1. Lyse le tissu cérébral à l’aide d’un mélangeur de tissus (voir tableau des matériaux pour les paramètres). Alternativement, lyse le tissu à l’aide d’un pilon microtube ou un équipement équivalent et pipette de haut en bas sur la glace avec une seringue de 1 mL avec une aiguille de 18 G.
    2. Prendre 1/100e volume de mélange de lyse (L) (200 μL pour 20 mL de L), et ajouter le même volume de tampon Laemmli 2x, faire bouillir pendant 5 min, et conserver à -20 °C pour une analyse plus approfondie.

4. Purification de la tubuline

  1. Lysate Clarification
    1. Effacer le lysate (séparation des granulés et fraction soluble du mélange de lyse) par centrifugation à 150 000 × g,4 °C, 30 min. Consultez tableau des matériaux pour plus de détails sur les rotors et les tubes d’ultracentrifugeuses. Pour les extraits cellulaires, une couche flottante blanche est souvent formée après centrifugation. Ne transférez pas cette couche flottante avec le supernatant, car elle interfère avec la polymérisation de la tubuline. Utilisez une seringue de volume approprié attachée à une longue aiguille de 20 G ou 21 G pour enlever délicatement le supernatant sans déranger la couche flottante. Si le supernatant est encore nuageux, centrifugeuse à 5 000 × g,4 °C pendant 10 min.
    2. Transférer le supernatant (SN1) dans un tube d’ultracentrifugeuse et noter son volume. Pour une pastille cellulaire de 10 mL, attendez-vous à un volume d’environ 12 mL pour SN1.
    3. Prenez 1/100e de volume de SN1 (120 μL pour 12 mL de SN1), et ajoutez le même volume de tampon Laemmli 2x, faites bouillir pendant 5 min et conservez-les à -20 °C pour une analyse plus approfondie.
    4. Resuspendez la pastille (P1) dans BRB80 (Tableau des matériaux) en utilisant le même volume que SN1. Prenez 1/100e de volume de P1 (200 μL pour 20 mL de P1), et ajoutez le même volume de tampon Laemmli 2x, faites bouillir pendant 5 min et stockez à -20 °C pour une analyse plus approfondie.
  2. Première polymérisation dans le tampon à faible molarité
    1. Préparer le mélange de polymérisation en combinant 1 volume de SN1 (12 mL), 1/200e volume de 0,2 M GTP (60 μL; concentration finale de 1 mM) et 0,5 volume de glycérol préchauffé (6 mL) dans un tube à bouchon à vis du volume approprié.
      REMARQUE : Le glycérol est utilisé comme agent d’encombrement dans les étapes de polymérisation tout au long du protocole et n’est donc pas pris en compte dans les calculs des concentrations d’autres composants.
    2. Pipette le mélange de haut en bas, en évitant doucement la formation de bulles d’air et de le transférer dans les tubes d’ultracentrifugeuse appropriés.
      REMARQUE : Lors du transfert du mélange sur les tubes, ajustez le poids des tubes (par paires). Cela permet à l’expérimentateur de procéder directement à la sédimentation des microtubules après l’étape de polymérisation. Faites ceci pour toutes les étapes de polymérisation tout au long du protocole.
    3. Couvrir les tubes de parafilm, transférer dans un bain d’eau à 30 °C et incuber pendant 20 min.
    4. Centrifugeuse les tubes à 150 000 × g, 30 °C pendant 30 min. Retirer le supernatant (SN2) et conserver la pastille de microtubules polymérisés (P2).
      REMARQUE : Les granulés de microtubules peuvent être congelés et stockés à -80 °C jusqu’à 1 an.
    5. Prenez 1/200e volume de SN2 (90 μL pour 18 mL SN2) et ajoutez le même volume de tampon Laemmli 2x, faites bouillir pendant 5 min et stockez à -20 °C pour une analyse plus approfondie.
  3. Première dénolysation
    1. Dépolymerize microtubules en ajoutant brb80 glacé à la pastille P2, et laisser sur la glace pendant 5 min: pour la tubuline des cellules, ajouter 1/60e (200 μL), et pour la tubuline du cerveau, ajouter 1/20e (600 μL) du volume de la SN1.
      REMARQUE : Le volume de BRB80 glacé ajouté à la pastille pendant les étapes de dénolysation est toujours par rapport au volume de SN1.
    2. Resuspendez doucement la pastille de microtubule, en évitant les bulles d’air, jusqu’à ce que la solution soit complètement homogène. Utilisez une pointe p1000 pour quelques cycles de pipetage suivis d’une pointe p200 toutes les 5 minutes, pendant 20 min (cinq cycles de pipetage). Il s’agit d’une étape cruciale pour le succès de la purification de la tubuline.
    3. Transférer la solution dans des tubes d’ultracentrifugeuse appropriés et faire tourner à 150 000 × g,4 °C pendant 20 min. Transférer le SN3 dans un nouveau tube d’ultracentrifugeuse de 1,5 mL. La pastille formée après cette étape de centrifugation (P3) contient des protéines précipitées (protéines associées aux microtubules ou MAP) et des microtubules non dépolymérisés. Le supernatant (SN3) contient des composants solubles : des dimers de tubuline dépolymérisés et des MAPs, qui se sont détachés des microtubules dépolymérisés.
    4. Prendre 1-4 μL de SN3, et ajouter 9 volumes de tampon Laemmli 2x, faire bouillir pendant 5 min, et stocker à -20 °C pour d’autres analyses.
    5. Resuspendez le granulé P3 en BRB80 (dans le même volume de SN3), prenez 1-4 μL, et ajoutez 9 volumes de tampon Laemmli 2x, faites bouillir pendant 5 min et stockez à -20 °C.
  4. Deuxième polymérisation (en tampon à haute molarité)
    1. Préparer le mélange de polymérisation en combinant 1 volume de SN3 (200 μL), 1 volume de PIPES préchauffés de 1 M (200 μL, concentration finale 0,5 M), 1/100e volume de 0,2 M GTP (2 μL, concentration finale de 1 mM) et 1 volume de glycérol préchauffé (200 μL) dans un tube du volume approprié.
    2. Pipette le mélange de haut en bas, en évitant la formation de bulles d’air, et le transférer dans des tubes d’ultracentrifugeuse.
    3. Couvrir les tubes de parafilm, les transférer dans un bain d’eau à 30 °C et incuber pendant 20 min.
    4. Centrifugeuse les tubes à 150.000 × g, 30 °C pendant 30 min. Retirer le supernatant (SN4) et conserver la pastille de microtubules polymérisés (P4). La pastille P4 contient les microtubules polymérisés, et le Supernatant SN4 contient de la tubuline non dominumée, des MAP et d’autres protéines solubles.
      REMARQUE : La pastille de microtubule après la deuxième étape de polymérisation peut être congelée et stockée à -80 °C jusqu’à 1 an.
    5. Prendre 1-4 μL et ajouter 9 volumes de tampon Laemmli 2x, faire bouillir pendant 5 min, et stocker à -20 °C pour d’autres analyses.
  5. Deuxième dénolysation
    1. Dépolymerize microtubules en ajoutant brb80 glacé à la pastille P4, et laisser sur la glace pendant 5 min: pour la tubuline des cellules, ajouter 1/100e (120 μL), et pour la tubuline du cerveau, ajouter 1/40e (300 μL) du volume de la SN1.
    2. Pipette de haut en bas avec une pointe p200 toutes les 5 minutes, pendant 20 min (cinq cycles de pipetage).
    3. Transférer la solution dans un tube d’ultracentrifugeuse de 1,5 mL et faire tourner à 150 000 × g,4 °C pendant 20 min. Transférer le SN5 dans un nouveau tube d’ultracentrifugeuse de 1,5 mL. La pastille formée après cette étape de centrifugation (P5) contient des microtubules non dépolymérisés. Le supernatant (SN5) contient la tubuline soluble.
    4. Prendre 1-4 μL et ajouter 9 volumes de tampon Laemmli 2x, faire bouillir pendant 5 min, et stocker à -20 °C pour d’autres analyses.
    5. Resuspendez le granulé P5 en BRB80 (même volume de SN5), prenez 1-4 μL, et ajoutez 9 volumes de tampon 2x Laemmli, faites bouillir pendant 5 min et stockez à -20 °C pour d’autres analyses.
  6. Troisième polymérisation (en tampon à faible molarité)
    1. Préparer le mélange de polymérisation : 1 volume de SN5 (120 μL), 1/200th volume de 0,2 M GTP (0,6 μL, concentration finale est de 1 mM) et 0,5 volume de glycérol préchauffé (60 μL) dans un tube du volume approprié.
    2. Pipette le mélange de haut en bas, en évitant doucement la formation de bulles d’air, et le transférer dans les tubes d’ultracentrifugeuse appropriés.
    3. Couvrir les tubes de parafilm, les transférer dans un bain d’eau à 30 °C et incuber pendant 20 min.
    4. Centrifugeuse les tubes à 150.000 × g, 30 °C pendant 30 min. La pastille (P6) contient des microtubules polymérisés et le supernatant SN6 contient de petites quantités de tubuline non polymérisée.
      REMARQUE : Les granulés de microtubule peuvent être congelés et stockés à -80 °C jusqu’à 1 an.
    5. Prendre 1-4 μL et ajouter 9 volumes de tampon Laemmli 2x, faire bouillir pendant 5 min, et stocker à -20 °C pour d’autres analyses.
  7. Troisième dénolysation
    1. Dépolymerize microtubules en ajoutant brb80 glacé à la pastille P6, et laisser sur la glace pendant 5 min: pour la tubuline des cellules, ajouter 1/100e (120 μL), et pour la tubuline du cerveau, ajouter 1/40e (300 μL) du volume de la SN1.
    2. Pipette de haut en bas avec une pointe p200 toutes les 5 minutes, pendant 20 min (cinq cycles de pipetage).
    3. Transférer la solution dans les tubes d’ultracentrifugeuses appropriés et faire tourner à 150 000 × g,4 °C pendant 20 min. Transférer le SN7 dans un nouveau tube d’ultracentrifugeuse de 1,5 mL. La pastille (P7) contient de petites quantités de microtubules non dénolysés. Le supernatant (SN7) contient exclusivement des microtubules dépolymérisés (tubuline soluble).
    4. Prendre 1-4 μL et ajouter 9 volumes de tampon Laemmli 2x, faire bouillir pendant 5 min, et stocker à -20 °C pour d’autres analyses.
    5. Resuspendez le granulé P7 dans BRB80 (même volume de SN7), prenez 1-4 μL, et ajoutez 9 volumes de tampon 2x Laemmli, faites bouillir pendant 5 min, et stockez à -20 °C pour d’autres analyses.
    6. Quantifier la quantité de tubuline (voir Résultats représentatifs)et aliquot SN7 en petits volumes, casser-congeler, et stocker à -80 °C.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’objectif principal de cette méthode est de produire une tubuline de haute qualité et compétente en assemblage en quantités suffisantes pour effectuer des expériences in vitro répétées avec les composants purifiés. Les microtubules assemblés à partir de cette tubuline peuvent être utilisés dans des essais de reconstitution basés sur la technique de microscopie de fluorescence de réflexion interne totale (TIRF) avec des microtubules dynamiques ou stables, dans des expériences testant la dynamique des microtubules, les in...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La méthode décrite ici fournit une plate-forme pour générer rapidement des tubulines de haute qualité et compétentes en assemblage en quantités moyennes-grandes à partir de lignées cellulaires et de cerveaux de souris simples. Il est basé sur le protocole d’étalon-or de purification de la tubuline à partir de cerveaux bovins utilisés sur le terraindepuis de nombreuses années 16,17. Un avantage particulier de l’approche est l’utilisation de cultures de suspension ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ces travaux ont été soutenus par l’ANR-10-IDEX-0001-02, le LabEx Cell’n’Scale ANR-11-LBX-0038 et l’Institut de convergence Q-life ANR-17-CONV-0005. CJ est soutenu par l’Institut Curie, l’Agence nationale de la recherche du Français (ANR) décerne l’ANR-12-BSV2-0007 et l’ANR-17-CE13-0021, la subvention de l’Institut national du cancer (INCA) 2014-PL BIO-11-ICR-1, et la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM) accorde à DEQ20170336756. MMM est soutenu par la Subvention Fondation Vaincre Alzheimer FR-16055p, et par la Subvention France Alzheimer AAP SM 2019 n°2023. Jas a été soutenu par le programme horizon 2020 de recherche et d’innovation de l’Union européenne dans le cadre de l’accord de subvention Marie Skłodowska-Curie n° 675737, et la subvention FDT201904008210. SB a été soutenu par la subvention frm FDT201805005465.

Nous remercions tous les membres du laboratoire Janke, en particulier J. Souphron, ainsi que G. Lakisic (Institut MICALIS, AgroParisTech) et A. Gautreau (Ecole Polytechnique) pour leur aide lors de l’établissement du protocole. Nous tenons à remercier l’établissement animalier de l’Institut Curie pour son aide à l’élevage et aux soins de la souris.

L’anticorps 12G10, développé par J. Frankel et M. Nelson, a été obtenu de la Developmental Studies Hybridoma Bank développée sous les auspices du NICHD et maintenue par l’Université de l’Iowa.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1  ; M MgCl2  ;Sigma#M1028
récipients de culture cellulaire de 1 LTechne F7610  ;Utilisé pour les cultures à cuiller. Ne remuez jamais les bouteilles d’essorage vides. Lorsque les flacons tournants se trouvent dans l’incubateur de culture cellulaire, gardez toujours les valves latérales des flacons rotatifs légèrement ouvertes pour faciliter l’équilibre des milieux avec l’incubateur. . Après utilisation, remplissez immédiatement les flacons essoreurs avec de l’eau du robinet pour éviter le dessèchement des cellules restantes sur les parois de la bouteille. Lavez les bouteilles avec de l’eau déminéralisée, ajoutez environ 200 ml d’eau déminéralisée et autoclave. Sous une hotte de culture cellulaire stérile, retirez l’eau et laissez les bouteilles sécher complètement, toujours sous la hotte, pendant plusieurs heures. N’utilisez jamais de détergents pour nettoyer les bouteilles essoreuses, car toute trace de détergent peut être nocive pour les cellules.
de 1,5 et 2 ml
Tubes
Boîtes
Tubes
2-mercaptoéthanol  ;Sigma  ;#M31482-mercaptoéthanol est toxique et doit être utilisé sous le capot.
fluorure de 4-(2-aminoéthyl)-benzènesulfonyle  ;Sigma  ;
40 % d’acrylamide  ;Bio-Rad  ;#161-0140
5-, 10- Seringues de 20 ml
stériles
bouchon
persulfate d’ammonium (APS)Sigma#A3678
Anticorps anti-alpha-tubuline, 12G10  ;Développé par J. Frankel et M. Nelson, obtenu de la Developmental Studies Hybridoma Bank, développé sous les auspices du NICHD et maintenu par l’Université de l’Iowadilution : 1/500
Anticorps anti-tubuline glutamylée, GT335  ;AdipoGen  ;#AG-20B-0020dilution : 1/20 000
d’aprotinine  ;Sigma  ;
Balance (0,1 &ndash ; 10 g)
Beckman Bouteilles en polypropylène de 1 l  ;Pour la collecte des cultures à cônes
Centrifugeuse Beckman Avanti J-26 XPPour la collecte des cultures à cônes
Agitateur biologique  ;Techne MCS-104L  ;Installé dans l’incubateur de culture cellulaire (pour les cultures à centrifuger), 25 tr/min pour les cellules Hela S3 et HEK 293
Bis N,N'-Methylene-Bis-Acrylamide  ;Bio-Rad  ;#161-0201
Mélangeur IKA Ultra-Turrax® ;   ;Pour lyser le tissu cérébral, utilisez une sonde de 5 mm, avec l’appareil réglé à la puissance 6 ou 7. Mélangez le tissu cérébral 2 à 3 fois pendant 15 secondes sur de la glace.
Albumine sérique bovine (BSA)Sigma  ;
Bleu de bromophénolSigma  ;#1.08122
Carboxypeptidase A (CPA)Sigma#C9268Concentration : 1.7  ; U/µ ; l
Hotte
Incubateur de culture cellulaire réglé à 37° ; C, 5 % de dioxyde de CO2
(DMSO)  ; Sigma  ;#D8418DMSO peut améliorer la perméabilité cellulaire et cutanée d’autres composés. Évitez tout contact et utilisez une protection de la peau et des yeux.
DMEM moyen  ;Technologies de la vie  ;#41965062
TNT, DL-Dithiothreitol  ;Sigma  ;
EDTAEuromedex#EU0007-C
EGTASigma  ;
Éthanol absoluFisher Chemical  ;#E/0650DF/15
Sérum fœtal bovin (FBS)Sigma  ;
presse à cellule de pression française.Thermo electron corporation#FA-078Aavec une pile #FA-032, pour lyser de grandes quantités de cellules. Réglé sur un rapport moyen et la pression manométrique de 1 000 psi (correspond à 3 000 psi à l’intérieur de la chambre de perturbation).
Glycérol  ; VWR Chemicals  ;#24388.295
GlycineSigma#G8898
GTP  ;Sigma  ;
Bloc chauffantStuart ;
cellules Hela  ;ATCC® ; CCL-2&Commerce ;
Cellules Hela S3  ;ATCCATCC® ; CCL-2.2 et le commerce ;
Acide chlorhydrique (HCl) )VWR#20252.290
Microscope inversé  ;Avec fluorescence si la transfection cellulaire doit être vérifiée
Isopropanol  ;VWR  ;#20842.298
jetPEIPolyplus  ;#101
Rotor JLA-8.1000  ;Pour la collecte des cultures à cônes
KOH  ;Sigma  ;#P1767KOH est corrosif et provoque des brûlures ; utilisez une protection oculaire et cutanée.
L-Glutamine  ;Technologies de la vie  ;#25030123
Centrifugeuse de laboratoire pour tubes de 50 mlSigma4-16 K  ;
Leupeptine  ;Sigma#L2884
Azote liquide  ;
Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 et p1000 et pointes
correspondantes MicropilonsEppendorf#0030 120.973
Tissu cérébral de souris  ;Les soins et l’utilisation des animaux pour cette étude ont été effectués conformément aux recommandations de la Communauté européenne (2010/63/UE). Les procédures expérimentales ont été spécifiquement approuvées par le comité d’éthique de l’Institut Curie CEEA-IC #118 (autorisation n° 04395.03 donnée par l’Autorité Nationale) dans le respect des directives internationales.
Aiguilles 18G x 1 & frac12 ; ” (1,2 x 38 millimètreTerumo#18G
aiguilles 20g x 1 ½ ; ” (0,9 x 38 millimètreTerumo#20G
aiguilles 21G x 4 ¾ ; ” (0,8 X 120 millimètreB.Braun#466 5643
Parafilm
PBS  ;Technologies de la vie  ;#14190169
Pénicilline-Streptomycine  ;Technologies de la vie  ;#15140130
pH-mètre
Fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF)Sigma  ;#P7626poudre PMSF est dangereuse. Utilisez une protection de la peau et des yeux lors de la préparation des solutions PMSF.
PASSE-POILS  ;Sigma  ;
Pipette-boy
RotorsBeckman 70.1 Ti ; TLA-100.3 ; et l’équipement d’électrophorèse TLA 55
SDS-PAGE  ;Bio-Rad  ;
FDS, Dodécylsulfate de sodium  ;VWR  ;#442444HPour la préparation du tampon Laemmeli  ;
FDS, Dodécylsulfate de sodium  ;Sigma  ;#L5750Pour la préparation des gels SDS-PAGE 'TUB'
Sonicator  ;Branson#101-148-070Utilisé pour lyser des cellules cultivées en cultures adhérentes. Utilisez une sonde de 6,5 mm de diamètre, réglez le sonicateur sur " Contrôle de sortie" 1, « Cycle de service" 10 % et le temps selon le type de cellule utilisé.
Centrifugeuse de table pour tubes de 1,5 mlEppendorf5417R  ;
TEMED, N, N, N&prime ;, N&prime ;-Tétraméthyléthylènediamine  ;Sigma#9281
Trichostatine A (TSA)Sigma#T8552
Triton X-100  ;Sigma  ;
Base Trizma (Tris)Sigma  ;
Trypsine  ;Life Technologies#15090046
Rotors d’ultracentrifugeuses  ;Rotors TLA-55, TLA-100.3 et 70.1 Ti réglésà 4° ; C ou 30° ; C en fonction de la nécessité de l’expérience.
Tubes d’ultracentrifugation  ;Beckman#357448  ;pour une utilisation avec le rotor TLA-55
Tubes d’ultracentrifugation  ;Beckman#349622rotor TLA-100.3
.Beckman#355631  ;à utiliser avec un rotor de 70,1 Ti
UltracentrifugeusesBeckmanOptima L80-XP (ou équivalent) et Optima MAX-XP (ou équivalent)Réglé à 4° ; C ou 30° ; C en fonction de la nécessité de l’expérience.
Mélangeur
Bain-marie équipé de flotteurs ou de porte-tubesréglé à 30° ; C  ;
Tubes à fond rond de 14 mlde culture stériles de 15 cm de diamètreà bouchon à vis de 15 ml#A8456 5 ml, 10 ml, 25 ml pipettes tubes à à vis de 50 ml#A1153#A7906de culture cellulaire#D9779#E3889#F7524#G8877#SBH130D#P6757#1658001FC#T9284#T1503 pour une utilisation avec les tubes ultracentrifuges à vortex

Références

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Purification de la tubulineIsotypes de tubulineCultures de lign es cellulairesLyse du cerveau de sourisAnalyse par SDS PAGEAnalyse par immunotransfertProt ines associ es aux microtubulesReconstitution in vitro

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