Ce protocole décrit la purification de la tubuline à partir de sources à petite ou moyenne échelle telles que les cellules de culture ou les cerveaux d’une seule souris, à l’aide de cycles de polymérisation et de dpolymérisation. La tubuline purifiée est enrichie en isotypes spécifiques ou a des modifications posttranslationnelles spécifiques et peut être utilisée dans des tests de reconstitution in vitro pour étudier la dynamique et les interactions des microtubules.
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Article de méthode
Purification de la tubuline avec modifications posttranslationnelles contrôlées et isotypes à partir de sources limitées par des cycles de polymérisation et de dépolymérisation
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Un aspect important des études du cytosquelette de microtubule est l’investigation du comportement de microtubule dans les expériences in vitro de reconstitution. Ils permettent l’analyse des propriétés intrinsèques des microtubules, telles que la dynamique, et de leurs interactions avec les protéines associées aux microtubules (MAP). Le « code de la tubuline » est un concept émergent qui indique différents isotypes de la tubuline et diverses modifications posttranslationnelles (MNP) en tant que régulateurs des propriétés et fonctions des microtubules. Pour explorer les mécanismes moléculaires du code de la tubuline, il est crucial d’effectuer des expériences de reconstitution in vitro à l’aide de tubuline purifiée avec des isotypes et des MNP spécifiques.
À ce jour, cela a été techniquement difficile que la tubuline du cerveau, qui est largement utilisé dans les expériences in vitro, abrite de nombreux M PT et a une composition définie isotype. Par conséquent, nous avons développé ce protocole pour purifier la tubuline à partir de différentes sources et avec différentes compositions d’isotypes et ptms contrôlés, en utilisant l’approche classique des cycles de polymérisation et de démlymerisation. Comparée aux méthodes existantes basées sur la purification d’affinité, cette approche produit la tubuline pure et polymérisation-compétente, car la tubuline résistante à la polymérisation ou à la dénolysation est jetée pendant les étapes successives de purification.
Nous décrivons la purification de la tubuline à partir de lignées cellulaires, cultivées soit en suspension, soit en cultures adhérentes, et à partir de cerveaux de souris simples. La méthode décrit d’abord la génération de masse cellulaire dans les paramètres de suspension et d’adhérent, l’étape de la lyse, suivie des étapes successives de purification de la tubuline par des cycles de polymérisation-dérimérisation. Notre méthode produit de la tubuline qui peut être utilisée dans des expériences traitant de l’impact du code de la tubuline sur les propriétés intrinsèques des microtubules et des interactions microtubules avec les protéines associées.
Introduction
Les microtubules jouent un rôle essentiel dans de nombreux processus cellulaires. Ils donnent aux cellules leur forme, construisent des fuseaux méiotiques et mitotiques pour la ségrégation chromosomique, et servent de pistes pour le transport intracellulaire. Pour remplir ces diverses fonctions, les microtubules s’organisent de différentes manières. L’une des questions intrigantes sur le terrain est de comprendre les mécanismes moléculaires qui permettent aux microtubules structurellement et évolutionnistes de s’adapter à cette pléthore d’organisations et de fonctions. Un mécanisme potentiel est la diversification des microtubules, qui est définie par le concept connu....
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Protocole
Les soins et l’utilisation des animaux dans le cadre de cette étude ont été effectués conformément aux recommandations de la Communauté européenne (2010/63/UE). Les procédures expérimentales ont été spécifiquement approuvées par le comité d’éthique de l’Institut Curie CEEA-IC #118 (autorisation n° 04395.03 donnée par l’Autorité nationale) conformément aux directives internationales.
1. Préparation des reagents pour la purification de la tubuline
REMARQUE : Tous les tampons utilisés pour la purification de la tubuline doivent contenir des sels de potassium et non des sels de sodium30.
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Résultats
L’objectif principal de cette méthode est de produire une tubuline de haute qualité et compétente en assemblage en quantités suffisantes pour effectuer des expériences in vitro répétées avec les composants purifiés. Les microtubules assemblés à partir de cette tubuline peuvent être utilisés dans des essais de reconstitution basés sur la technique de microscopie de fluorescence de réflexion interne totale (TIRF) avec des microtubules dynamiques ou stables, dans des expériences testant la dynamique des microtubules, les in.......
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Discussion
La méthode décrite ici fournit une plate-forme pour générer rapidement des tubulines de haute qualité et compétentes en assemblage en quantités moyennes-grandes à partir de lignées cellulaires et de cerveaux de souris simples. Il est basé sur le protocole d’étalon-or de purification de la tubuline à partir de cerveaux bovins utilisés sur le terraindepuis de nombreuses années 16,17. Un avantage particulier de l’approche est l’utilisation de cultures de suspension .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ces travaux ont été soutenus par l’ANR-10-IDEX-0001-02, le LabEx Cell’n’Scale ANR-11-LBX-0038 et l’Institut de convergence Q-life ANR-17-CONV-0005. CJ est soutenu par l’Institut Curie, l’Agence nationale de la recherche du Français (ANR) décerne l’ANR-12-BSV2-0007 et l’ANR-17-CE13-0021, la subvention de l’Institut national du cancer (INCA) 2014-PL BIO-11-ICR-1, et la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM) accorde à DEQ20170336756. MMM est soutenu par la Subvention Fondation Vaincre Alzheimer FR-16055p, et par la Subvention France Alzheimer AAP SM 2019 n°2023. Jas a été soutenu par le programme horizon 2020 de recherche et d’innovation de l’Union européenne dans le....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1 ; M MgCl2 ; | Sigma | #M1028 | |
| récipients de culture cellulaire de 1 L | Techne F7610 ; | Utilisé pour les cultures à cuiller. Ne remuez jamais les bouteilles d’essorage vides. Lorsque les flacons tournants se trouvent dans l’incubateur de culture cellulaire, gardez toujours les valves latérales des flacons rotatifs légèrement ouvertes pour faciliter l’équilibre des milieux avec l’incubateur. . Après utilisation, remplissez immédiatement les flacons essoreurs avec de l’eau du robinet pour éviter le dessèchement des cellules restantes sur les parois de la bouteille. Lavez les bouteilles avec de l’eau déminéralisée, ajoutez environ 200 ml d’eau déminéralisée et autoclave. Sous une hotte de culture cellulaire stérile, retirez l’eau et laissez les bouteilles sécher complètement, toujours sous la hotte, pendant plusieurs heures. N’utilisez jamais de détergents pour nettoyer les bouteilles essoreuses, car toute trace de détergent peut être nocive pour les cellules. | |
| de 1,5 et 2 ml | |||
| Tubes | |||
| Boîtes | |||
| Tubes | |||
| 2-mercaptoéthanol ; | Sigma ; | #M3148 | 2-mercaptoéthanol est toxique et doit être utilisé sous le capot. |
| fluorure de 4-(2-aminoéthyl)-benzènesulfonyle ; | Sigma ; | ||
| 40 % d’acrylamide ; | Bio-Rad ; | #161-0140 | |
| 5-, 10- Seringues de 20 ml | |||
| stériles | |||
| bouchon | |||
| persulfate d’ammonium (APS) | Sigma | #A3678 | |
| Anticorps anti-alpha-tubuline, 12G10 ; | Développé par J. Frankel et M. Nelson, obtenu de la Developmental Studies Hybridoma Bank, développé sous les auspices du NICHD et maintenu par l’Université de l’Iowa | dilution : 1/500 | |
| Anticorps anti-tubuline glutamylée, GT335 ; | AdipoGen ; | #AG-20B-0020 | dilution : 1/20 000 |
| d’aprotinine ; | Sigma ; | ||
| Balance (0,1 &ndash ; 10 g) | |||
| Beckman Bouteilles en polypropylène de 1 l ; | Pour la collecte des cultures à cônes | ||
| Centrifugeuse Beckman Avanti J-26 XP | Pour la collecte des cultures à cônes | ||
| Agitateur biologique ; | Techne MCS-104L ; | Installé dans l’incubateur de culture cellulaire (pour les cultures à centrifuger), 25 tr/min pour les cellules Hela S3 et HEK 293 | |
| Bis N,N'-Methylene-Bis-Acrylamide ; | Bio-Rad ; | #161-0201 | |
| Mélangeur IKA Ultra-Turrax® ; ; | Pour lyser le tissu cérébral, utilisez une sonde de 5 mm, avec l’appareil réglé à la puissance 6 ou 7. Mélangez le tissu cérébral 2 à 3 fois pendant 15 secondes sur de la glace. | ||
| Albumine sérique bovine (BSA) | Sigma ; | ||
| Bleu de bromophénol | Sigma ; | #1.08122 | |
| Carboxypeptidase A (CPA) | Sigma | #C9268 | Concentration : 1.7 ; U/µ ; l |
| Hotte | |||
| Incubateur de culture cellulaire réglé à 37° ; C, 5 % de dioxyde de CO2 | |||
| (DMSO) | ; Sigma ; | #D8418 | DMSO peut améliorer la perméabilité cellulaire et cutanée d’autres composés. Évitez tout contact et utilisez une protection de la peau et des yeux. |
| DMEM moyen ; | Technologies de la vie ; | #41965062 | |
| TNT, DL-Dithiothreitol ; | Sigma ; | ||
| EDTA | Euromedex | #EU0007-C | |
| EGTA | Sigma ; | ||
| Éthanol absolu | Fisher Chemical ; | #E/0650DF/15 | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Sigma ; | ||
| presse à cellule de pression française. | Thermo electron corporation | #FA-078A | avec une pile #FA-032, pour lyser de grandes quantités de cellules. Réglé sur un rapport moyen et la pression manométrique de 1 000 psi (correspond à 3 000 psi à l’intérieur de la chambre de perturbation). |
| Glycérol | ; VWR Chemicals ; | #24388.295 | |
| Glycine | Sigma | #G8898 | |
| GTP ; | Sigma ; | ||
| Bloc chauffant | Stuart ; | ||
| cellules Hela ; | ATCC® ; CCL-2&Commerce ; | ||
| Cellules Hela S3 ; | ATCC | ATCC® ; CCL-2.2 et le commerce ; | |
| Acide chlorhydrique (HCl) ) | VWR | #20252.290 | |
| Microscope inversé ; | Avec fluorescence si la transfection cellulaire doit être vérifiée | ||
| Isopropanol ; | VWR ; | #20842.298 | |
| jetPEI | Polyplus ; | #101 | |
| Rotor JLA-8.1000 ; | Pour la collecte des cultures à cônes | ||
| KOH ; | Sigma ; | #P1767 | KOH est corrosif et provoque des brûlures ; utilisez une protection oculaire et cutanée. |
| L-Glutamine ; | Technologies de la vie ; | #25030123 | |
| Centrifugeuse de laboratoire pour tubes de 50 ml | Sigma | 4-16 K ; | |
| Leupeptine ; | Sigma | #L2884 | |
| Azote liquide ; | |||
| Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 et p1000 et pointes | |||
| correspondantes Micropilons | Eppendorf | #0030 120.973 | |
| Tissu cérébral de souris ; | Les soins et l’utilisation des animaux pour cette étude ont été effectués conformément aux recommandations de la Communauté européenne (2010/63/UE). Les procédures expérimentales ont été spécifiquement approuvées par le comité d’éthique de l’Institut Curie CEEA-IC #118 (autorisation n° 04395.03 donnée par l’Autorité Nationale) dans le respect des directives internationales. | ||
| Aiguilles 18G x 1 & frac12 ; ” (1,2 x 38 millimètre | Terumo | #18G | |
| aiguilles 20g x 1 ½ ; ” (0,9 x 38 millimètre | Terumo | #20G | |
| aiguilles 21G x 4 ¾ ; ” (0,8 X 120 millimètre | B.Braun | #466 5643 | |
| Parafilm | |||
| PBS ; | Technologies de la vie ; | #14190169 | |
| Pénicilline-Streptomycine ; | Technologies de la vie ; | #15140130 | |
| pH-mètre | |||
| Fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF) | Sigma ; | #P7626 | poudre PMSF est dangereuse. Utilisez une protection de la peau et des yeux lors de la préparation des solutions PMSF. |
| PASSE-POILS ; | Sigma ; | ||
| Pipette-boy | |||
| Rotors | Beckman 70.1 Ti ; TLA-100.3 ; et l’équipement d’électrophorèse TLA 55 | ||
| SDS-PAGE ; | Bio-Rad ; | ||
| FDS, Dodécylsulfate de sodium ; | VWR ; | #442444H | Pour la préparation du tampon Laemmeli ; |
| FDS, Dodécylsulfate de sodium ; | Sigma ; | #L5750 | Pour la préparation des gels SDS-PAGE 'TUB' |
| Sonicator ; | Branson | #101-148-070 | Utilisé pour lyser des cellules cultivées en cultures adhérentes. Utilisez une sonde de 6,5 mm de diamètre, réglez le sonicateur sur " Contrôle de sortie" 1, « Cycle de service" 10 % et le temps selon le type de cellule utilisé. |
| Centrifugeuse de table pour tubes de 1,5 ml | Eppendorf | 5417R ; | |
| TEMED, N, N, N&prime ;, N&prime ;-Tétraméthyléthylènediamine ; | Sigma | #9281 | |
| Trichostatine A (TSA) | Sigma | #T8552 | |
| Triton X-100 ; | Sigma ; | ||
| Base Trizma (Tris) | Sigma ; | ||
| Trypsine ; | Life Technologies | #15090046 | |
| Rotors d’ultracentrifugeuses ; | Rotors TLA-55, TLA-100.3 et 70.1 Ti réglés | à 4° ; C ou 30° ; C en fonction de la nécessité de l’expérience. | |
| Tubes d’ultracentrifugation ; | Beckman | #357448 ; | pour une utilisation avec le rotor TLA-55 |
| Tubes d’ultracentrifugation ; | Beckman | #349622 | rotor TLA-100.3 |
| . | Beckman | #355631 ; | à utiliser avec un rotor de 70,1 Ti |
| Ultracentrifugeuses | Beckman | Optima L80-XP (ou équivalent) et Optima MAX-XP (ou équivalent) | Réglé à 4° ; C ou 30° ; C en fonction de la nécessité de l’expérience. |
| Mélangeur | |||
| Bain-marie équipé de flotteurs ou de porte-tubes | réglé à 30° ; C ; |
Références
- Verhey, K. J., Gaertig, J. The tubulin code. Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).
- Janke, C. The tubulin code: Molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
- Janke, C., Magiera, M. M.
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Réimpressions et autorisations
