Flux de travail protéomique quantitative utilisant la détection basée sur la surveillance des réactions multiples des protéines du tissu cérébral humain

Résumé

Le protocole vise à introduire l’utilisation d’un spectromètre de masse triple quadripolaire pour la surveillance des réactions multiples (MRM) des protéines provenant d’échantillons cliniques. Nous avons fourni un flux de travail systématique allant de la préparation des échantillons à l’analyse des données pour les échantillons cliniques avec toutes les précautions nécessaires à prendre.

Résumé

L’analyse protéomique du tissu cérébral humain au cours de la dernière décennie a grandement amélioré notre compréhension du cerveau. Cependant, les troubles liés au cerveau continuent d’être un contributeur majeur de décès dans le monde, nécessitant la nécessité d’une compréhension encore plus grande de leur pathobiologie. Les techniques traditionnelles à base d’anticorps comme le western blotting ou l’immunohistochimie souffrent d’un faible débit en plus d’être à forte intensité de main-d’œuvre et qualitatives ou semi-quantitatives. Même les approches conventionnelles basées sur la spectrométrie de masse au fusil de chasse ne parviennent pas à fournir des preuves concluantes à l’appui d’une certaine hypothèse. Les approches protéomiques ciblées sont largement fondées sur des hypothèses et diffèrent des approches protéomiques conventionnelles qui ont été utilisées depuis longtemps. La surveillance des réactions multiples est l’une de ces approches ciblées qui nécessite l’utilisation d’un spectromètre de masse spécial appelé spectromètre de masse quadripolaire tandem ou spectromètre de masse triple quadripolaire. Dans la présente étude, nous avons systématiquement mis en évidence les principales étapes impliquées dans la réalisation réussie d’un flux de travail protéomique basé sur la spectrométrie de masse quadripolaire en tandem en utilisant du tissu cérébral humain dans le but d’introduire ce flux de travail dans une communauté de recherche plus large.

Introduction

Au cours de la dernière décennie, les développements rapides de la spectrométrie de masse (SEP) associés à une meilleure compréhension des techniques de chromatographie ont grandement contribué à l’avancement de la protéomique basée sur la SEP. Les techniques basées sur la biologie moléculaire telles que le transfert de Western et l’immunohistochimie souffrent depuis longtemps de problèmes de reproductibilité, de délais d’exécution lents, de variabilité entre observateurs et de leur incapacité à quantifier avec précision les protéines, pour n’en nommer que quelques-unes. À cette fin, la sensibilité supérieure des approches protéomiques à haut débit continue d’offrir a....

Protocole

Cette étude porte sur des échantillons de tissus cérébraux de participants humains, examinés et approuvés par TMH et IITB IEC - (IITB-IEC/2018/019). Les participants ont donné leur consentement éclairé et écrit pour participer à cette étude.

1 Extraction de protéines à partir de tissus cérébraux

1. Peser environ 50 mg de tissu cérébral et laver le tissu avec 300 μL de solution saline tampon phosphate (PBS) à l’aide d’une micropipette.
   REMARQUE: Cette étape est effectuée pour enlever tout sang sur la surface externe du tissu et doit être répétée si nécessaire. Il est conseillé d’éliminer autant de sang que possible des tissus car c....

Résultats

Nous avons effectué une quantification relative de 3 protéines à partir de 10 échantillons, 5 échantillons de chaque groupe de patients présentant des anomalies dans le cerveau. Ces protéines comprenaient l’apolipoprotéine A-I (APOA-I), la vimentine (VIM) et la nicotinamide phosphoribosyltransférase (NAMPT) qui sont connues pour jouer divers rôles dans les cellules du cerveau. L’analyse post-exécution des données a été effectuée à l’aide de Skyline-daily (Ver 20.2.1.286). Au total, 10 peptides correspondant à 3 protéines.......

Discussion

Des techniques telles que l’immunohistochimie et le Western blotting ont été considérées comme les étalons-or pour la validation des cibles protéiques pendant de nombreuses années. Ces méthodes trouvent une utilisation même aujourd’hui avec des modifications mineures dans le protocole et peu de dépendance à la technologie, ce qui les rend très lourdes et fastidieuses. En outre, ils impliquent également l’utilisation d’anticorps coûteux qui ne présentent pas toujours la même spécificité entre les lots et nécessitent une g.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
réactifs
acétonitrile (grade MS)	Fisher Scientific	A/0620/21
Albumine sérique bovine	HiMedia	TC194-25G
Chlorure de calcium	Fischer Scienific	BP510-500
Acide formique (grade MS)	Fisher Scientific	147930250
Iodoacétamide	Sigma	1149-25G
Isopropanol (grade MS)	Fisher Scientific	Q13827
Chlorure de magnésium	Fischer Scienific	BP214-500
Méthanol (grade MS)	Fisher Scientific	A456-4
Eau de grade MS	Pierce	51140
Tampon phosphate Saline	HiMedia	TL1006-500ML
Cocktail inhibiteur de protéase	Roche Diagnostics	11873580001
sodium	Merck	DF6D661300
TCEP	Sigma	646547
Tris Base	Merck	648310
Trypsine (grade MS)	Pierce	90058
Urée	Merck	MB1D691237
Supplies
Hypersil Gold C18 colonne	Thermo	25002-102130
Micropipettes	Gilson	F167380
Pointes de scène	MilliPore	ZTC18M008
Billes de zircone/silice	Produits BioSpec	11079110z
Équipement
Batteur de billes (homogénéisateur)	Bertin Minilys	P000673-MLYS0-A
Lecteur de microplaques (spectrophotomètre)	PH-mètre Thermo	MultiSkan Go
	Eutech	CyberScan pH 510
Sonique	Sonics Materials, Inc	VCX 130
Shaking	Drybath Thermo	88880028
Spectromètre de masse TSQ Altis	Thermo	TSQ02-10002
uHPLC - Vanquish	Thermo	VQF01-20001
Concentrateur	sous vide Thermo	Savant ISS 110

Chlorure de