Mutagénèse par PCR, clonage, expression, protocoles de purification rapide des protéines et cristallisation du type sauvage et des formes mutantes de la tryptophane synthase

Résumé

Cet article présente une série de méthodes consécutives pour l’expression et la purification de Salmonella typhimurium tryptophan synthase comp ce protocole un système rapide pour purifier le complexe protéique en une journée. Les méthodes couvertes sont la mutagénèse dirigée par site, l’expression des protéines chez Escherichia coli,la chromatographie d’affinité, la chromatographie par filtration sur gel et la cristallisation.

Résumé

Des études structurales avec le complexe bienzymatique de tryptophane synthase (TS) (α₂β₂ TS) de Salmonella typhimurium ont été réalisées pour mieux comprendre son mécanisme catalytique, son comportement allostérique et les détails de la transformation enzymatique du substrat en produit dans les enzymes dépendantes du PLP. Dans ce travail, un nouveau système d’expression pour produire la sous-unité α et isolée β isolée a permis la purification de grandes quantités de sous-unités pures et α complexe₂β₂StTS des sous-unités isolées en 2 jours. La purification a été réalisée par chromatographie d’affinité suivie d’un clivage de l’étiquette d’affinité, d’une précipitation de sulfate d’ammonium et d’une chromatographie d’exclusion de taille (SEC). Pour mieux comprendre le rôle des résidus clés au niveau de l’enzyme β site, une mutagénèse directe par site a été réalisée dans des études structurelles antérieures. Un autre protocole a été créé pour purifier le type sauvage et mutant α_{complexes 2}β₂StTS. Un protocole simple, rapide et efficace utilisant le fractionnement du sulfate d’ammonium et la SEC a permis de purifier α complexe₂β₂StTS en une seule journée. Les deux protocoles de purification décrits dans ce travail présentent des avantages considérables par rapport aux protocoles précédents pour purifier le même complexe en utilisant PEG 8000 et la spermine pour cristalliser le complexe α₂β₂StTS le long du protocole de purification. La cristallisation de type sauvage et de certaines formes mutantes se produit dans des conditions légèrement différentes, ce qui nuit à la purification de certains mutants à l’aide de PEG 8000 et de spermine. Pour préparer des cristaux adaptés aux études cristallographiques aux rayons X, plusieurs efforts ont été déployés pour optimiser la cristallisation, la qualité des cristaux et lacryoprotection. Les méthodes présentées ici devraient être généralement applicables pour la purification des sous-unités de tryptophane synthase et des complexes de type sauvage et mutant α₂β₂StTS.

Introduction

Le complexe bienzyme tryptophane synthase (TS) (α₂β₂₎est une enzyme allostérique, catalysant les deux dernières étapes de la biosynthèse de l’acide aminé L-tryptophane chez les bactéries, les plantes et les champignons^1,2,3. Bacterium Salmonella enterica serovar typhimurium (St) provoque une infection gastro-intestinale grave chez les humains et d’autres animaux. Étant donné que les humains et les animaux supérieurs n’ont pas de TS (EC 4.2.1.20), l’inhibition de S. typhimurium α complexe_TS2 β₂ (α<....

Protocole

1. Protocole rapide pour purifier la sous-unité α et β et le complexe TS α recombiné₂β₂St

1. Sous-clonage de l’ADN en vecteur d’expression pETSUMO
   1. Obtenir le gène de couplage translationnelle (trpA et trpB) codant pour les sous-unités α- et β- de la tryptophane synthase de la bactérie Salmonella enterica serovar typhimurium clonée dans le vecteur d’expression pEBA-10²². Utilisez le vecteur pEBA-10 comme modèle d’ADN.
      REMARQUE: Alternativement, les amorces énumérées ci-dessous peuvent être utilisées pour amplifier les deux gènes du génome du sérovar typhimuri....

Résultats

Purification des sous-unités α-et β- dela tryptophane synthase
La sous-unité α(αStTS) et la sous-unité β (βStTS) de la tryptophane synthase Salmonella typhimurium ont été sous-clonées dans le vecteur pET SUMO modifié. La figure 1A montre les résultats SDS-PAGE représentatifs de deux bandes fortes correspondant à la protéine de fusion His6-SUMO-αSt<.......

Discussion

Nous avons conçu avec succès la forme mutante α₂β₂ βQ114A, α₂β₂ βK167T et α 2 complexes βS377A StTS_{β 2} pour les études de corrélation structure-fonction. Initialement, nous avons essayé de purifier les mutants en utilisant un protocole de purification précédent²², qui nécessite α cristallisation complexe₂β₂StTS avec PEG 8000 et spermine pendant la purification. Bien que le taux de cristallisat.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Filtre 15 mL 10 kDa	de filtration centrifuge	MilliporeSigma	UFC901024
15 mL Filtre 100 kDa Unité	filtration centrifuge	MilliporeSigma	UFC910024
2 mL flacons cryogéniques	Corning	CLS430489	Tubes cryogéniques
	Fisher Scientific	05-408-141	Tubes à centrifuger
24 puits Cryschem Plate	Hampton Research	HR3-158	Plaques de descente 24 puits
2-mercaptoéthanol	Fisher Scientific	O3446I-100	Chemical
50 mL centrifugeuse tubes coniques	Thermo Scientific	12-565-270	centrifugeuse tubes coniques
AB15 ACCUMET Basic	Fisher Scientific	13-636-AB15	pH-mètre
Agarose	Fisher Scientific	BP1356-100	Gel d’agarose
Sulfate d’ammonium	Fisher Scientific	A702-500
Ampicilline	Fisher Scientific	BP1760-5	Antibiotique
Incubateur bactérien	Fisher Scientific	Incubateur S35836	.
BamHI	New England Biolabs	R0136S	Restriction enzyme
bicine	Fisher Scientific	BP2646100	Chemical
Branson 450 Sonifier Digital Brason		B450	Disrupteur cellulaire
Chlorure de césium	Fisher Scientific	BP210-100
Chimique Hydroxyde de césium	Acros Organics	AC213601000	Chemical
Chloramphénicol	Fisher Scientific	BP904-100	Antibiotique
diméthylsulfoxyde	Fisher	Scientific D1391
Dithiothréitol	Fisher Scientific	BP172-5	ADN
chimique polymérase	Thermo Scientific	F530S	HF polymérase
dNTP Set	Invitrogen	10-297-018	dNTPs set
EcoRI	New England Biolabs	R0101S	Enzyme de restriction
Acide éthylènediaminetétraacétique	Fisher	Scientific S311-100	Chimique
Excella E25R Agitateur orbital	Eppendorf	Nouveau-Brunswick M1353-0004	Incubateur orbital
GE AKTA Prime Plus	GE Healthcare	8149-30-0004
Kit d’extraction de gel	Invitrogen	K210012	Kit de purification de l’ADN
Glycérol	Fisher Scientific	G33-500	Chimique
HindIII	New England Biolabs	R0104S	Enzyme de restriction
Colonnes His-Trap	GE Healthcare	GE17-5255-01	5 mL Colonne Histrap
imidazole	Fisher Scientific	O3196-500	Chimique
IPTG	Thermo Fisher Scientific	R0392	Inducteur
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906-5	Antibiotique
Kelvinator Series-100	Kelvinator	discontinué	LB à congélateur ultra bas Fisher
	Scientific	BP1426-500	Bouillon liquide
Luria Bertani agar	Fisher Scientific	BP1425-2	Bouillon solide
NaCl	Fisher Scientific	S271-500	Chemical
NcoI	New England Biolabs	R0193S	Enzyme de restriction
Perles d’affinité Ni-NTA	Thermo Fisher Scientific	R90115	Perles d’agarose Ni-NTA
PEG 8000	Fisher Scientific	BP233-100	Produit chimique
fluorure de phénylméthylsulfonyle	Fisher Scientific	44-865-0	Chimique
pyridoxal phosphate	Acros Organics	AC228170010	Chimique
S-200 HR	Cytiva	45-000-196	Colonne d’exclusion stérique
SacI	New England Biolabs	R0156S	Enzyme de restriction
Hydroxyde de sodium	Fisher	Scientific S318-100	Chimique
Sorvall RC-5B centrifugeuse	Sorvall	8327-30-1004	Floor cetrifuge
Spermine	Acros Organics	AC132750010	Chemical
Superdex 200 prep grade	Cytiva	45-002-491	Colonne d’exclusion de taille
T4 ADN ligase	New England Biolabs	M0202S	DNA liagse
Tris	Fisher Scientific	BP152-500
Chimique Protéase spécifique à Ubl 1	Thermo Scientific	12588018	SUMO Protéase