Article de méthode

Mutagénèse par PCR, clonage, expression, protocoles de purification rapide des protéines et cristallisation du type sauvage et des formes mutantes de la tryptophane synthase

DOI :

10.3791/61839

⸱

26 septembre 2020

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of California-Riverside, 2Department of Biochemistry, University of California-Riverside

Dans cet article

Résumé

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Cet article présente une série de méthodes consécutives pour l’expression et la purification de Salmonella typhimurium tryptophan synthase comp ce protocole un système rapide pour purifier le complexe protéique en une journée. Les méthodes couvertes sont la mutagénèse dirigée par site, l’expression des protéines chez Escherichia coli,la chromatographie d’affinité, la chromatographie par filtration sur gel et la cristallisation.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Des études structurales avec le complexe bienzymatique de tryptophane synthase (TS) (α2β2 TS) de Salmonella typhimurium ont été réalisées pour mieux comprendre son mécanisme catalytique, son comportement allostérique et les détails de la transformation enzymatique du substrat en produit dans les enzymes dépendantes du PLP. Dans ce travail, un nouveau système d’expression pour produire la sous-unité α et isolée β isolée a permis la purification de grandes quantités de sous-unités pures et α complexe2β2StTS des sous-unités isolées en 2 jours. La purification a été réalisée par chromatographie d’affinité suivie d’un clivage de l’étiquette d’affinité, d’une précipitation de sulfate d’ammonium et d’une chromatographie d’exclusion de taille (SEC). Pour mieux comprendre le rôle des résidus clés au niveau de l’enzyme β site, une mutagénèse directe par site a été réalisée dans des études structurelles antérieures. Un autre protocole a été créé pour purifier le type sauvage et mutant αcomplexes 2β2StTS. Un protocole simple, rapide et efficace utilisant le fractionnement du sulfate d’ammonium et la SEC a permis de purifier α complexe2β2StTS en une seule journée. Les deux protocoles de purification décrits dans ce travail présentent des avantages considérables par rapport aux protocoles précédents pour purifier le même complexe en utilisant PEG 8000 et la spermine pour cristalliser le complexe α2β2StTS le long du protocole de purification. La cristallisation de type sauvage et de certaines formes mutantes se produit dans des conditions légèrement différentes, ce qui nuit à la purification de certains mutants à l’aide de PEG 8000 et de spermine. Pour préparer des cristaux adaptés aux études cristallographiques aux rayons X, plusieurs efforts ont été déployés pour optimiser la cristallisation, la qualité des cristaux et lacryoprotection. Les méthodes présentées ici devraient être généralement applicables pour la purification des sous-unités de tryptophane synthase et des complexes de type sauvage et mutant α2β2StTS.

Introduction

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Le complexe bienzyme tryptophane synthase (TS) (α2β2)est une enzyme allostérique, catalysant les deux dernières étapes de la biosynthèse de l’acide aminé L-tryptophane chez les bactéries, les plantes et les champignons1,2,3. Bacterium Salmonella enterica serovar typhimurium (St) provoque une infection gastro-intestinale grave chez les humains et d’autres animaux. Étant donné que les humains et les animaux supérieurs n’ont pas de TS (EC 4.2.1.20), l’inhibition de S. typhimurium α complexeTS2 β2 (α2β2StTS) a été explorée comme cible médicamenteuse potentielle pour le traitement de la cryptosporidiose et de la tuberculose4, les infections génitales et oculaires5, et pour l’utilisation potentielle d’herbicides dans l’agriculture6. La sous-unité α catalyse le clivage aldolytique de l’indole-3-glycérol-phosphate (IGP) en glycéraldéhyde-3-phosphate (GAP) et indole, par la formation d’un intermédiaire tautomère d’indolénine et par la suite d’un clivage de liaison carbone-carbone pour produire du GAP et de l’indole3,6. Le site β-catalytique contient une molécule de cofacteur pyridoxal 5′-phosphate (PLP) liée à β-Lys87 via une base de Schiff, qui fonctionne comme un puits d’électrons au cours des réactions à l’enzyme β-sous-unité3,7. Le β-site catalyse le remplacement de l’hydroxyle à chaîne latérale L-Sérine par l’indole pour donner du L-Tryptophane et une molécule d’eau dans une réaction dépendante du PLP. Rue St TS sert de modèle de longue date pour l’étude de la canalisation du substrat et de la communication allostérique dans les complexes multi-enzymatiques2,3. Une communication allostérique bidirectionnelle entre les sous-unités α et β du TS est nécessaire pour synchroniser les étapes catalytiques et empêcher la libération d’indole lors de la synthèse du L-tryptophane3. Pour étendre cet effort, nous avons préparé plusieurs mutants (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr et β-Ser377Ala) par mutation ponctuelle à utiliser dans d’autres explorations de la relation entre la structure, le mécanisme et la fonction enzymatiques sur le site catalytique de la sous-unité β StTS.

Des recherches détaillées sur le mécanisme catalytique de α2β2StTS ont été initiées par le groupe de recherche d’Edith W. Miles. Les premières études avec le complexe natif Escherichia coli α2β2 TS se sont concentrées sur la purification et la caractérisation de la sous-unité α isolée8,9, isolée β-sous-unité10,11 et la reconstitution du complexe TS α2β2 à partir des sous-unités isolées12. La purification a été réalisée par précipitation de sulfate d’ammonium, dialyse d’échantillons, chromatographie DEAE-Sephadex, dialyse, et un deuxième tour chromatographique sur une colonne DEAE-Sephadex12. Dans un autre protocole, la purification du même complexe a été améliorée en chargeant le lysate cellulaire clarifié sur une colonne DEAE-Sephadex suivie d’une étape chromatographique sur une colonne Sepharose 4B, d’une précipitation de sulfate d’ammonium et d’une dialyse13. Les deux protocoles de purification durent 4-5 jours. Escherichia coli α2β2 TS complexes cristallisés, mais les cristaux ne convenaient pas à la diffraction des rayons X à cette époque.

Dans une nouvelle étude, des formes recombinantes et de type sauvage de S. typhimurium α2β2 TS ont été purifiées et cristallisées14,15. Le complexe recombinant α2β2StTS a été surexprimé dans la souche CB149 d’E. coli portant le vecteur d’expression pEBA-10. La collecte et l’analyse initiales des données de cristallisation et de diffraction des rayons X du complexe TSα2 β2Stont été rapportées14. Cependant, des aiguilles longues et minces comme αcristaux de 2β2StTS ont altéré les études structurelles. Dans une tentative de recueillir de meilleures données de diffraction des rayons X, un autre protocole de purification a été décrit pour purifier le type sauvage et les formes mutantes du complexe α2β2StTS15. La purification a été effectuée avec une précipitation initiale à l’aide de spermine et de PEG 8 000 dans le lysate cellulaire clarifié et un grand précipité volumineux a été éliminé par centrifugation. La fraction surnageante contenant de grandes quantités de α2β complexe2StTS a été stockée pendant 16 à 48 h à 4 °C jusqu’à ce que les cristaux jaunes précipitent. Les cristaux ont été lavés et largement dialysés contre différents tampons. Le complexe protéique a été recristallisé dans un tampon contenant du sulfate d’ammonium et dialysé15. Bien que la cristallisation des protéines dépende des concentrations de protéines et de précipitants en solution, il est difficile de surveiller, de prédire et de reproduire la purification pour d’autres formes mutantes de α complexe2β2StTS en solution. Ce protocole a l’avantage de ne pas utiliser de méthodes chromatographiques; cependant, les inconvénients sont le long temps de purification nécessaire pour cristalliser, dialyser et recristalliser, nécessitant généralement 5 à 7 jours. Pour obtenir des cristaux adaptés à la collecte de données aux rayons X, plus de 600 conditions de cristallisation ont été évaluées à l’aide d’une combinaison et d’une variation de la concentration en protéines, de la température, des précipités (PEG 4 000, 6 000 et 8 000) et des additifs (CaCl2,MnCl 2, ZnCl2,cadavérine, putrescine, spermine ou spermidine)15. Les cristaux avaient une meilleure forme cristalline et se développaient plus rapidement dans des conditions contenant 12% de PEG 8 000 et 2 mM de spermine. La cristallisation était plus favorable à 25 °C plutôt qu’à 4, 30 ou 42 °C et a atteint les dimensions maximales en 3 jours15. Plusieurs structurescristallinesα 2 β2StTS ont été rapportées à ce moment-là (1996-1999)16,17,18,19,20,21 et de nombreuses autres structures ont été publiées à ce jour.

Ici, l’objectif principal est de présenter des protocoles alternatifs pour purifier la tryptophane synthase et optimiser la cristallisation des protéines. Les présents travaux montrent des améliorations significatives pour purifier le type sauvage isolé α-sous-unité (αStTS), isolé β-sous-unité (βStTS), reconstitué α complexe2β2StTS à partir des sous-unités isolées, et le type sauvage et les formes mutantes du complexe α2β2StTS. Les avantages par rapport aux protocoles précédents sont considérables puisque le temps de purification a été considérablement réduit et que la cristallisation et la cryoprotection ont été optimisées. Les formes mutantes du complexe α2β2StTS conçues dans ce travail se sont cristallisées près de la même condition utilisée pour la forme de type sauvage. Cependant, une optimisation de la cristallisation fine était nécessaire pour obtenir de gros monocrissaux de qualité suffisante pour la détermination de la structure à une résolution proche de l’atome. À ce jour, 134 structures cristallines de tryptophane synthase sont déposées dans la banque de données sur les protéines (PDB), représentant respectivement 101, 31 et 2 structures cristallines pour les bactéries, les archées et les eucaryotes. Joliment, 73 structures appartiennent au typhimurium sérovar de S. enterica et 5 structures cristallines du complexe α2β2StTS ont des limites de résolution supérieures à 1,50 Angstroms. Sans surprise, 4 sur 5 ont été préparés dans notre groupe de recherche (PDB IDs:5CGQ à 1,18 Å, 4HT3 à 1,30 Å, 4HPJ à 1,45 Å, 6DZ4 à 1,45 Å résolution). Les structures cristallines raffinées de la forme mutante du complexe α2β2StTS devraient fournir de nouvelles informations sur le mécanisme et les rôles joués par les résidus d’acides aminés essentiels impliqués dans la synthèse du L-tryptophane.

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Protocole

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1. Protocole rapide pour purifier la sous-unité α et β et le complexe TS α recombiné2β2St

  1. Sous-clonage de l’ADN en vecteur d’expression pETSUMO
    1. Obtenir le gène de couplage translationnelle (trpA et trpB) codant pour les sous-unités α- et β- de la tryptophane synthase de la bactérie Salmonella enterica serovar typhimurium clonée dans le vecteur d’expression pEBA-1022. Utilisez le vecteur pEBA-10 comme modèle d’ADN.
      REMARQUE: Alternativement, les amorces énumérées ci-dessous peuvent être utilisées pour amplifier les deux gènes du génome du sérovar typhimurium de Salmonella enterica. Toutes les étapes de la biologie moléculaire ont été suivies comme décrit dans Molecular Cloning: A Laboratory Manual23.
    2. Utilisez la réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour amplifier individuellement la séquence de polynucléotides pleine longueur de la sous-unité α(αStTS) avec des amorces αStTS-FW-Bam et αStTS-Rev-Eco et la séquence pleine longueur de β-sous-unité (βStTS) avec des amorces βStTS-FW-Bam et βStTS-Rev-Hind. Utilisez une température de fusion d’environ 55 °C et un temps d’extension de la polymérase de 2 min.
      1. Utilisez l’ADN polymérase haute fidélité (p. ex., Phusion) et le protocole du fabricant pour amplifier les séquences d’ADN. Pour une réaction PCR de 50 μL, ajouter 34 μL d’eau sans nucléase, 10 μL de tampon de réaction 5x, 1 μL de dNTP de 10 mM, 1 μL d’amorce avant de 10 μM, 1 μL d’amorce inverse de 10 μM, 1 μL d’ADN modèle (200 ng), 1,5 μL de DMSO, 0,5 μL d’ADN polymérase phusion.
      2. Pour le programme PCR, utilisez un démarrage à chaud (180 secondes à 98 °C) suivi de 30 cycles d’amplification (30 secondes à 98 °C, 30 secondes à 55 °C et 120 secondes à 72 °C) et d’une extension finale (300 secondes à 72 °C).
        REMARQUE: Les séquences en italique correspondent aux sites de restriction BamHI, EcoRI, BamHI et HindIII, respectivement. L’efficacité du clivage enzymatique proche des termini des fragments de PCR a été améliorée par l’ajout de bases supplémentaires (séquences minuscules).
        αStTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGGAACGCTACGAAAA-3′
        αStTS-Rev-Eco: 5′-ccgGAATTCTTATGCGCGGCTGGC-3′
        βStTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGACAACACTTCTCAAC-3′
        βStTS-Rev-Hind: 5′-cccAAGCTTTCAGATTTCCCCTC-3′
    3. Chargez le produit PCR sur du gel d’agarose à 0,8% dans 1x tampon TAE (40 mM Tris, 20 mM d’acide acétique et 1 mM EDTA) à 6 V / cm, extrayez le gel de la bande d’ADN d’intérêt et purifiez le fragment de PCR à l’aide d’un kit de billes de silice en suivant les instructions du fabricant.
      1. Digérer au moins 200 ng de chaque fragment d’ADN avec les enzymes de restriction appropriées et les conditions recommandées par le fabricant pendant 2 heures à 37 °C.
      2. Pour mettre en place une réaction de digestion de restriction de 50 μL, ajoutez 34 μL d’eau sans nucléase, 10 μL d’ADN (200 ng), 5 μL de tampon de réaction 10x, 0,5 μL d’enzyme de restriction 1 et 0,5 μL d’enzyme de restriction 2.
      3. Chargez le produit de digestion sur du gel d’agarose à 0,8% sur 1x TAE à 6 V / cm, extrait de gel, et purifiez le fragment digéré à l’aide d’un kit commercial.
    4. Sous-onlone individuellement chaque fragment dans le vecteur modifié d’expression d’E. coli pET SUMO, préalablement digéré avec des enzymes appropriées et purifié en gel.
      REMARQUE: Ce vecteur est une version modifiée du pET SUMO commercial. Ce vecteur a été optimisé pour le clonage enzymatique de restriction. Le site de clonage multiple (MCS) du vecteur pET28b(BamHI, EcoRI, SacI, SalI, HindIII, NotI et XhoI) a été inséré dans le site de clonage pET SUMO. Ce vecteur contient une balise N-terminale 6x-Histidine dans le cadre avec la protéine SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier protein) et plusieurs sites de clonage.
    5. Ligaturez 100 ng de pET SUMO modifié et 50 ng de fragment de PCR avec de l’ADN ligase T4 pendant 2 heures à 25 °C.
    6. Transformer le plasmide construit en cellules compétentes de cellules de la souche DH10B d’E. coli α cellules. Cellules de plaques sur plaques de gélose LB contenant 35 μg/mL de kanamycine. Incuber la plaque inversée pendant la nuit à 37 °C.
    7. Sélectionnez une seule colonie de chaque transformation, préparez de l’ADN plasmidique ultra-pur et effectuez un séquençage de l’ADN pour vérifier que αStTS ou βStTS ont été clonés dans le cadre avec la balise N-terminal His6-SUMO.
      REMARQUE: Préparer des stocks de glycérol de culture cellulaire (retourner la suspension cellulaire à 16% de concentration finale de glycérol stérile) et les stocker à long terme à -80 ° C.
    8. Transformer le plasmide d’expression SUMO-αStTS ou SUMO-βStTS individuellement en cellules compétentes de la souche d’expression D’E. coli Rosetta (DE3) pLysS avec un système basé sur le promoteur T7. Plaquer les cellules recombinantes sur des plaques de gélose Luria Bertani (LB) contenant 35 μg/mL de kanamycine et de chloramphénicol. Incuber la plaque inversée pendant la nuit à 37 °C.
    9. Après la formation réussie de colonies, choisissez une seule colonie (sans colonies satellites) et dispersez-la dans 5 mL de milieu LB avec les deux antibiotiques. Cellules de culture pendant la nuit avec agitation à 200 tr / min à 37 ° C.
      REMARQUE: Préparer des stocks de glycérol de culture cellulaire, stocker à long terme à -80 ° C ou utiliser immédiatement pour l’expression des protéines recombinantes.
  2. Expression dessous-unitésSUMO- αStTS et SUMO-βStTS
    1. Inoculer la souche fraîche d’E. coli Rosetta (DE3) pLysS contenant des cellules SUMO-αStTS ou SUMO-βStTS construit ou gratte une partie du stock de glycérol congelé dans une culture de 50 mL de LB contenant 35 μg/mL de kanamycine et de chloramphénicol. Cultiver des cellules pendant la nuit en agitant à 200 tr/min à 37 °C.
    2. Le lendemain matin, inoculer 5 mL de la culture cellulaire de nuit dans un 2x 1000 mL frais et stérile de LB contenant 2% de glycérol plus kanamycine et chloramphénicol (fiole de Fernbach de 2,8 L). Cultiver la culture cellulaire en agitant à 200 tr/min à 37 °C.
      REMARQUE: L’expression de SUMO-αStTS ou SUMO-βStTS dans le bouillon LB donne 125-150 mg de protéines marquées par litre. Envisagez de mettre à l’échelle le protocole vers le haut ou vers le bas pour répondre à des demandes spécifiques.
    3. Induire l’expression des protéines recombinantes lorsque l’OD600 atteint 0,6-0,8 par addition d’isopropyle β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) à une concentration finale de 0,4 mM suivie d’une incubation à 30 °C pendant la nuit avec agitation à 200 tr/min.
    4. Récolter les cellules par centrifugation à 4 000 x g à 4 °C pendant 20 min. Retirer le surnageant et suspendre à nouveau les pastilles cellulaires avec un tampon de lyse à froid 1 (50 mM de Tris-Cl, pH 8,0, contenant 500 mM de NaCl, 5 % de glycérol, 10 mM de 2-mercaptoéthanol et 40 mM d’imidazole-Cl) jusqu’à un volume final de 60 mL.
      REMARQUE: Les cellules peuvent être stockées à long terme à -80 ° C ou utilisées immédiatement pour la purification des protéines. Pour stocker les cellules, divisez la suspension cellulaire en 2 tubes coniques de centrifugeuse jetables de 50 mL et maintenez les granulés cellulaires à -80 °C jusqu’à l’étape de purification des protéines.
  3. Purification de l' α- et β-sous-unités de tryptophane synthase
    REMARQUE: Toutes les procédures doivent être effectuées à 4 °C, sauf indication contraire. Pour réduire le temps de purification, équilibrez les colonnes d’affinité chargées de nickel d’agarose Ni-NTA et la colonne d’exclusion de taille dans le tampon avant la purification des protéines ou pendant l’expression des protéines recombinantes.
    1. Perturber la pastille cellulaire par sonication à l’aide d’un sonificateur numérique avec sonde Horn 1/2 » (ou un équipement similaire). Effectuez 20 cycles à un rapport cyclique d’amplitude de 80 % au bain-marie en utilisant 10 s d’impulsion et 20 s de repos ou jusqu’à perturbation complète de la cellule.
    2. Centrifuger le lysate de la cellule à 30 000 x g pendant 30 min. Aspirer le surnageant, en veillant à ce que la pastille ne se déloge pas du tube. Filtrer le surnageant avec une unité de filtration de 0,45 μm sur de la glace et le faire circuler à travers une colonne d’affinité chargée de nickel d’agarose de 15 mL de Ni-NTA prééquilibrée dans un tampon de lyse 1.
      REMARQUE: Chaque colonne d’agarose Ni-NTA sera utilisée pour purifier la protéine recombinante SUMO-αStTS ou SUMO-βStTS. La purification peut être effectuée dans une colonne Ni-NiTA de 2 x 5 mL attachée à un système de chromatographie liquide protéique rapide. Purifiez une protéine à la fois.
    3. Laver la colonne d’agarose Ni-NTA dans 100 mL de tampon de lyse 1.
    4. Procéder à une élution en une étape de 80 mL avec tampon E1 (tampon Tris-Cl de 25 mM, pH 7,8, contenant 200 mM de NaCl, 5 % de glycérol et 400 mM d’imidazole-Cl).
      REMARQUE: SUMO-protéase tolère jusqu’à 300 mM d’imidazole et la membrane des dispositifs de filtration centrifuge tolère jusqu’à 100 mM d’imidazole. Nous recommandons d’effectuer une précipitation de sulfate d’ammonium pour éliminer de grandes quantités d’imidazole et diminuer le temps de purification au lieu de diluer l’échantillon de protéines et de perdre du temps avec la concentration en protéines.
    5. Évaluer le volume initial de la fraction surnageante. Ajouter lentement de petites quantités de sulfate d’ammonium à la fois, jusqu’à ce qu’une saturation de 60 % (39,48 g/ 100 mL) à 25 °C soit atteinte. Remuez doucement la solution pendant 30 min et évitez les bulles. Centrifuger à 10 000 x g pendant 15 min.
    6. Aspirer et jeter soigneusement la fraction surnageante. Resuspendez la fraction de granulés dans 20 mL de tampon d’échantillon (20 mM de Tris-Cl, pH 8,0, 300 mM de NaCl et 5 % de glycérol).
    7. Pour le clivage His-SUMO-tag avec SUMO-protéase, ajouter le fragment recombinant de protéase 1 spécifique d’Ubl de Saccharomyces cerevisiae dans un rapport de 1:1000 et incuber le mélange pendant 2 heures à 4 °C.
    8. Centrifuger le produit de digestion à 10 000 x g à 25 °C pendant 20 min pour éliminer les agrégats de protéines avant de charger l’échantillon à travers une colonne de chromatographie d’affinité.
    9. Supprimer les traces de la balise His6-SUMO passant l’échantillon mis enssussé de 20 mL sur une colonne d’agarose Ni-NTA de 15 mL, préalablement équilibrée dans le tampon de lyse 1.
    10. Prélever l’échantillon intermédiaire contenant le αStTS non étiqueté ou βStTS.
    11. Lavez la colonne Ni-NTA dans 20 mL de tampon 1 pour collecter les restes de αStTS ou βStTS non étiquetés.
    12. Concentrer chaque sous-unité séparément avec un filtre centrifuge à coupure de 15 mL 10 kDa en filant à 3 000 x g à 4 °C. Transférer la protéine concentrée dans un tube frais de 2,0 mL et une microcentrifugeuse (10 000 x g, 10 min, 4 °C) pour éliminer les agrégats. Déterminer la concentration en protéines24, préparer 1 mL d’aliquotes à 20-25 mg mL-1, étiqueter, congeler dans de l’azote liquide et les stocker à -80 °C.
      REMARQUE: Les échantillons de protéines pré-purifiées peuvent être stockés à long terme à -80 ° C ou utilisés immédiatement pour la purification des protéines sur une colonne de chromatographie d’exclusion de taille (SEC).
    13. Prendre une aliquote de protéines (20 mg) et une microcentrifugeuse à 10 000 x g pendant 10 min pour éliminer les agrégats avant sec.
    14. Charger l’échantillon sur une colonne de chromatographie d’exclusion de taille (p. ex., HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR) attachée à une chromatographie liquide protéique rapide à un débit de 0,5 mLmin-1, préalablement équilibré dans un tampon SEC (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 100 mM NaCl, 5 % de glycérol, 0,1 mM de phosphate de pyridoxal).
      REMARQUE: Pour purifier des quantités plus élevées de αisolées StTS ou β sous-unitéStTS et diminuer le nombre de tours SEC, chargez un échantillon de 5 mL à 20-25 mg mL-1 sur une colonne de chromatographie d’exclusion de taille à un débit de 1,5 mL min-1.
    15. Évaluer la qualité de αStTS ou βStTS dans la fraction de crête en utilisant une électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium à 12% ou 15% (SDS-PAGE), respectivement, colorée avec une tache bleu brillant de Coomassie25.
    16. Concentrez les protéines avec des unités de filtration centrifuge fraîches de 15 mL 10 kDa, déterminez la concentration en protéines24,préparez des aliquotes de 0,5 mL à 20-25 mg mL-1,étiquetez, congelez-les dans de l’azote liquide et conservez-les à -80 °C.
  4. Purification du complexe TS α 2β2Stdes sous-unités α et β
    REMARQUE: Équilibrer la colonne de chromatographie d’exclusion de taille (Sephadex S-200 HR ou Superdex 200 pg) dans un tampon SEC (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 100 mM NaCl, 5% glycérol, 0,1 mM de phosphate pyridoxal).
    1. Pour purifier le complexe α2β2StTS de type sauvage des sous-unités α et β, décongeler des échantillons concentrés de αsous-unitésStTS et βStTS à 4 °C.
    2. Mélanger les aliquotes (1,2 αStTS : 1,0 β rapport molaireStTS) et incuber à 4 °C pendant 1 h.
      REMARQUE: Un excès d’αStTS est nécessaire pour s’assurer que la plupart de βStTS seront incorporés dans le complexe α2β2StTS.
    3. Éliminer les agrégats de protéines par microcentrifugation (10 000 x g, 10 min, 4 °C).
    4. Chargez le surnageant clarifié sur la colonne d’exclusion de taille.
    5. Évaluer la qualité de αStTS ou βStTS dans la fraction de crête en utilisant une électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium à 12% ou 15% (SDS-PAGE), respectivement, colorée avec une tache bleu brillant de Coomassie25.
    6. Déterminer la concentration en protéines24,préparer des aliquotes de 250-1000 μL à 15-20 mgmL-1,congeler dans de l’azote liquide et les conserver à -80 °C.

2. Purification du type sauvage ou de la forme mutante du complexe α2β2StTS

  1. Mutagénèse dirigée par le site pour préparer le mutant βStTS
    1. Utilisez le vecteur d’expression pEBA-1022 comme modèle d’ADN pendant les deux étapes de la réaction en chaîne de la polymérase pour introduire des mutations ponctuelles spécifiques dans la séquence de polynucléotides TS à chaîne β.
      REMARQUE: Ce protocole peut être utilisé pour introduire une mutation ponctuelle unique dans la sous-unité α ou β de Salmonella typhimurium tryptophane synthase. En outre, de nouveaux amorces d’oligonucléotides contenant la mutation souhaitable doivent être conçues de manière appropriée. Dans ce travail, les mutations βQ114A, βK167T βS377A sont répertoriées.
    2. Effectuer des réactions PCR à l’aide de paires d’amorces nucléotidiques TS-FW-NcoI/Q114A-Rev, TS-FW-NcoI/K167T-Rev et TS-FW-NcoI/S377A-Rev pour générer des fragments A1, B1 et C1, respectivement.
      NOTE: Oligonucléotide TS-NcoI-FW et TS-SacI-Rev, respectivement, recuits en amont et en aval de la séquence de polynucléotides αβ StTS clonée dans le vecteur pEBA-10.
      1. Utilisez l’ADN polymérase haute fidélité (p. ex., Phusion) et le protocole du fabricant pour amplifier les séquences d’ADN. Pour une réaction pcR de 50 μL, ajouter 34 μL d’eau sans nucléase, 10 μL de tampon de réaction 5x, 1 μL de dNTP de 10 mM, 1 μL d’amorce avant de 10 μM, 1 μL d’amorce inverse de 10 μM, 1 μL d’ADN modèle (200 ng), 1,5 μL de DMSO, 0,5 μL d’ADN polymérase.
      2. Pour le programme PCR, utilisez un démarrage à chaud (180 secondes à 98 °C) suivi de 30 cycles d’amplification (30 secondes à 98 °C, 30 secondes à 55 °C et 120 secondes à 72 °C) et d’une extension finale (300 secondes à 72 °C).
        REMARQUE : Toutes les étapes de la biologie moléculaire ont été suivies comme décrit dans Clonage moléculaire : manuel de laboratoire23. Alors qu’une séquence minuscule correspond à un site de restriction, une séquence en gras et en italique correspond à une mutation.
        TS-FW-NcoI: 5'-CAA TTT CAC ACA GGA AAC AGA cca tgg-3'
        Q114A-Rev: 5'-C AGA GGC GAC GCC GTG CGC ACC GGC GCC GGT TTC-3'
        K167T-Rev: 5'-CTC GTT ACA GGC ATC TGT TAG CGT AGC GGA GCC-3'
        S377A-Rev: 5'-C TTT ATC TCC GCG GCC AGC GAG ATT GAC CAC CAG-3'
    3. Effectuer des réactions PCR à l’aide de paires d’amorces nucléotidiques TS-Rev-SacI/Q114A-FF, TS-Rev-SacI/K167T-FF et TS-Rev-SacI/S377A-FF pour générer des fragments A2, B2 et C2, respectivement.
      TS-Rev-SacI (5'-TTA tgc gcg GCT GGC GGC TTT CAT GGC TGA G-3'
      Q114A-FF 5'-GAA ACC GGC GCC GGT GCGAC GGC GTC GCC TCT G-3'
      K167T-FF 5'-GGC TCC GCT ACG CTA ACA GAT GCC TGT AAC GAG-3'
      S377A-FF 5'-CTG GTG GTC AAT CTC GCT GGC CGC GGA GAT AAA G-3'
    4. Utilisez la réaction en chaîne par polymérase pour amplifier individuellement les fragments partiels. Utilisez une température de fusion de 55 °C et un temps d’extension de la polymérase de 2 min.
    5. Pour effectuer la deuxième série de réactions de PCR, chargez le produit PCR ci-dessus sur du gel d’agarose à 0,8% sur 1x TAE à 6 V / cm et l’extrait de gel et le gel purifient les fragments d’intérêt.
      1. Mélanger les fragments A1/A2, B1/B2 et C1/C2 séparément en quantités équinmolaires, dénaturer le mélange à la chaleur pendant 10 min à 96 °C et recuit à 25 °C. Étendre les brins recombinants avec une polymérase haute fidélité et des désoxyribonucléotides selon le protocole du fabricant.
    6. Pour générer un nombre élevé de copies du fragment d’ADN mutant sur toute la longueur, ajoutez les amorces oligo TS-FW-NcoI et TS-Rev-SacI pour effectuer une deuxième PCR.
    7. Charger le produit PCR sur 0,8% d’agarose dans 1x tampon TAE à 6 V / cm, extraire le gel de la bande d’ADN d’intérêt, gel purifier le fragment PCR et procéder à une digestion de restriction appropriée pendant 2 heures à 37 ° C en suivant le tampon approprié et les conditions recommandées par le fabricant.
      1. Digérer au moins 200 ng de chaque fragment d’ADN avec les enzymes de restriction appropriées et les conditions recommandées par le fabricant pendant 2 heures à 37 °C. Pour mettre en place une réaction de digestion de restriction de 50 μL, ajoutez 34 μL d’eau sans nucléase, 10 μL d’ADN (200 ng), 5 μL de tampon de réaction 10x, 0,5 μL d’enzyme de restriction 1 et 0,5 μL d’enzyme de restriction 2. Charger le produit de digestion sur 0,8% d’agarose dans 1x tampon TAE à 6 V/cm et purifier le fragment de PCR digéré.
    8. Digest 200 ng de pEBA-10 construire avec les enzymes de restriction NcoI et SacI en suivant la recommandation du fabricant. Charger le produit de digestion sur du gel d’agarose à 0,8% dans 1x tampon TAE à 6 V/cm, exciser la bande correspondant au vecteur et purifier le vecteur digéré.
    9. Ligaturer 100 ng de vecteur avec 50 ng de fragment pcromique, préalablement digéré et purifié, avec de l’ADN ligase T4 pendant 2 heures à 25 °C. Transformer le plasmide construit en cellules compétentes E. coli souche DH10B. Cellules de plaque sur plaques de gélose LB contenant 50 μg/mL d’ampicilline. Incuber la plaque inversée pendant la nuit à 37 °C.
    10. Choisissez une seule colonie (sans colonies satellites) de chaque transformation cellulaire et dispersez-la dans 5 mL de milieu LB contenant de l’ampicilline. Cultiver des cellules pendant la nuit en agitant à 200 tr/min à 37 °C. Préparez 10 μg d’ADN plasmidique ultra-pur à partir de chaque construction modifiée. Préparer des stocks de glycérol de culture cellulaire (tourner la suspension cellulaire dans une concentration finale de 16% de glycérol stérile) et stocker à long terme à -80 ° C.
    11. Effectuer le séquençage de l’ADN pour confirmer la séquence complète codant les sous-unités α et β de la tryptophane synthase. Confirmez chaque mutation individuelle et écartez toute construction plasmidique contenant une mutation aléatoire indésirable. Les amorces d’oligonucléotides utilisées dans cette étude sont énumérées ci-dessous.
      TS-1F: 5'-ATGACAACACTTCTCAAC-3'
      TS-1R: 5'-GAAATGCCAGAACATTAC-3'
      TS-2F: 5'-CAGTCGCCGAACGTC-3'
      TS-3F: 5'-GATGATGCAAACAGC-3'
      TS-4F: 5'-CTGGCATTGAACAGTC-3'
      TS-5F: 5'-CGTTGCATCATCTCATTG-3'
      REMARQUE: Amorces d’oligonucléotides TS-1F, TS-1R, TS-2F et TS-3F recuit sur la séquence de polynucléotides de la sous-unité β (code d’accession GenBank: CP051286.1). Amorces TS-4F et TS-5F recuit sur la séquence de polynucléotides de la sous-unité α (code d’accession GenBank : CP053865.1).
    12. Utilisez 200 ng de chaque construction plasmidique (pEBA-10-βQ114A, pEBA-10-βK167T et pEBA-10-βS377A) pour transformer les cellules compétentes de la souche d’expression d’E. coli CB149, dépourvue de l’opéron26du trp. Après la formation réussie de colonies, choisissez une seule colonie et cultivez les cellules dans 5 mL de milieu LB contenant 50 μg / mL d’ampicilline. Culture dans l’incubateur bactérien à 37 °C pendant la nuit. Préparer des stocks de glycérol de culture cellulaire, stocker à long terme à -80 ° C ou utiliser immédiatement pour l’expression de protéines recombinantes.
      REMARQUE: Une seule mutation ponctuelle dans la sous-unité α ou β de Salmonella typhimurium tryptophane synthase peut altérer la fonction enzymatique ou réduire la synthèse du L-tryptophane dans la souche CB149 d’E. coli. Veuillez envisager d’utiliser la souche BL21(DE)pLys-S ou Rosetta (DE3)pLys-S d’E. coli si aucune expression ou des quantités plus faibles de complexe recombinant α2β2StTS sont détectées dans un gel SDS-PAGE.
  2. Expression du type sauvage et de la forme mutante du complexe α2β2StTS chez E. coli
    1. Cultiver la souche d’expression d’E. coli abritant la construction souhaitable dans un milieu frais et stérile de 50 mL de LB contenant 50 μg/mL d’ampicilline. Cultiver des cellules pendant la nuit en agitant à 200 tr/min à 37 °C.
    2. Ajouter 5 mL de la culture cellulaire pendant la nuit dans une 2x 1000 mL fraîche et stérile de LB contenant 2% de glycérol plus ampicilline (fiole de Fernbach de 2,8 L). Cultiver la culture cellulaire en agitant à 200 tr/min à 37 °C.
    3. Induire l’expression de protéines recombinantes lorsque l’OD600 atteint 0,6-0,8 par addition d’IPTG à une concentration finale de 0,4 mM suivie d’une incubation à 30 °C pendant la nuit avec agitation à 200 tr/min.
    4. Récoltez les cellules par centrifugation à 4 000 x g à 4 °C pendant 20 min. Retirer le surnageant et ressaisir les pastilles cellulaires avec un tampon de lyse à froid 2 (50 mM de Tris-Cl, pH 7,80, contenant 100 mM de NaCl, 5 mM de dithiothréitol, 1 mM d’EDTA et 1 mM de PMSF) jusqu’à un volume final de tampon de 50 mL.
      REMARQUE: Les cellules peuvent être stockées à long terme à -80 ° C ou utilisées immédiatement pour la purification des protéines. Pour stocker les cellules, divisez la suspension cellulaire en 2 tubes coniques de centrifugeuse jetables de 50 mL et maintenez les granulés cellulaires à -80 °C jusqu’à l’étape de purification des protéines. L’expression de la forme mutante et de type sauvage du complexe α2β2StTS dans le bouillon LB donne 125-150 mg de protéines par litre. Envisagez de mettre à l’échelle le protocole vers le haut ou vers le bas pour répondre à des demandes spécifiques.
  3. Purification de type sauvage ou de forme mutante du complexe α2β2StTS
    REMARQUE: Le protocole suivant vise à purifier le type sauvage recombinant non marqué ou la forme mutante du α2β2StComplexe TS en 1 jour, en fonction des compétences et des efforts. Pour réduire le temps de purification, équilibrez la colonne d’exclusion de taille dans le tampon avant la purification/expression des protéines. Purification de α de type sauvage ou mutant2β2StLe complexe TS est réalisé par une purification en deux étapes comprenant un fractionnement du sulfate d’ammonium et une chromatographie d’exclusion granulométrique. Ce protocole donne 60-100 mg de complexe pur à partir de 1 L de milieu LB.
    1. Perturber la pastille cellulaire par sonication à l’aide d’un sonificateur numérique avec sonde Horn 1/2 » (ou un équipement similaire). Effectuez 20 cycles à un rapport cyclique d’amplitude de 80 % au bain-marie en utilisant 10 s d’impulsion et 20 s de repos ou jusqu’à perturbation complète de la cellule.
    2. Centrifuger le lysate de la cellule à 30 000 x g pendant 30 min à 25 °C. Aspirer le surnageant, en veillant à ce que la pastille ne se déloge pas du tube. Filtrer la fraction surnageante clarifiée avec un filtre de 0,45 μm à température ambiante.
    3. Évaluer le volume initial de la fraction surnageante clarifiée. Ajouter lentement de petites quantités de sulfate d’ammonium à la fois, jusqu’à ce qu’une saturation de 20% soit atteinte (11,51 g / 100 mL). Effectuer le fractionnement du sulfate d’ammonium à 25 °C. Remuez doucement la solution pendant 10 min et évitez les bulles.
    4. Centrifuger à 30 000 x g pendant 10 min à 25 °C. Transférer la fraction surnageante de 20 % dans une fiole propre. Remettez en compte doucement 20 % de fraction de granulés dans 20 mL de tampon d’échantillon 2 (50 mM de Tris-Cl, pH 7,80, contenant 100 mM de NaCl, 1 mM d’EDTA et 2 mM de dithiothréitol) et préparez un échantillon pour faire fonctionner le gel SDS-PAGE. Jetez la fraction de granulés de 20%.
    5. Évaluer le volume initial de la fraction surnageante de 20 %. Ajouter le sulfate d’ammonium à 30% de saturation est atteint (5,94 g / 100 mL), remuer la solution, éviter les bulles et centrifuger comme avant. Transférer la fraction surnageante de 30 % dans une fiole propre. Remettez en compte doucement une fraction de granulés de 30 % dans 20 mL de tampon d’échantillon 2 et préparez un échantillon pour faire fonctionner le gel SDS-PAGE. Jetez la fraction de granulés à 30%.
    6. Évaluer le volume initial de la fraction surnageante de 30 %. Ajouter le sulfate d’ammonium à une saturation de 40% est atteinte (6,14 g / 100 mL), remuer la solution, éviter les bulles et centrifuger comme avant. Transférer la fraction surnageante de 40 % dans une fiole propre. Remettez en compte doucement une fraction de granulés de 40 % dans 10 mL de tampon d’échantillon 2 et préparez un échantillon pour faire fonctionner le gel SDS-PAGE. Jetez la fraction surnageante de 40%.
      REMARQUE: Évaluer la qualité du complexe αβStTS à l’aide d’échantillons des fractions de surnageant et de granulés de 30% et 40% dans un gel SDS-PAGE à 12%25. Si vous vérifiez que tout autre complexe mutant αβStTS se trouve dans la fraction surnageante à 40%, procédez à une saturation de 60% de sulfate d’ammonium (13,0 g / 100 mL). Les aliquotes protéiques pré-purifiées du complexe pré-purifié α2β2 StTS peuvent être stockées à long terme à -80 °C ou utilisées immédiatement pour la purification des protéines sur une colonne de chromatographie d’exclusion de taille (SEC).
    7. Microcentrifuger l’échantillon de protéine à 10 000 x g,20 min, 4 °C et charger la fraction surnageante sur une colonne HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR attachée à une chromatographie liquide protéique rapide à un débit de 0,5 mL min-1, préalablement équilibrée dans un tampon SEC (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 100 mM NaCl, 5% glycérol, 0,1 mM de phosphate de pyridoxal).
      REMARQUE: Pour purifier de grandes quantités de complexe, chargez un échantillon de 5 mL à 20-25 mg mL-1 sur une colonne HiLoad 26/600 Superdex 200 pg à un débit de 1,5 mL min-1.
    8. Évaluer les échantillons prélevés le long du fractionnement du sulfate d’ammonium et des fractions maximales de la colonne SEC sur un gel SDS-PAGE à 12% coloré avec une tache bleu brillant Coomassie25.
    9. Concentrer le type sauvage ou mutant α complexe2β2StTS avec une unité de filtration centrifuge à coupure de 15 mL 100 kDa en filant à 3 000 x g à 4 °C. Transférer la protéine concentrée dans un tube frais de 2,0 mL et une microcentrifugeuse (10 000 x g, 10 min, 4 °C) pour éliminer les agrégats.
    10. Déterminer la concentration en protéines24, préparer 0,5 mL d’aliquotes à 20-25 mg mL-1, étiqueter, congeler dans de l’azote liquide et les conserver à -80 °C.

3. Cristallisation optimisée pour le type sauvage et la forme mutante du complexe α2β2StTS

REMARQUE: La condition de cristallisation initiale pour le complexe α2β2StTS a déjà été rapportée dans des conditions contenant 12% de PEG 8 000 et 2 mM de spermine22.

  1. Préparer des solutions d’élevage avant les essais de cristallisation pour obtenir une meilleure reproductibilité de cristallisation. Pour effectuer des études structurales avec TS, cristalliser la protéine avec l’ion Na+ ou Cs+ au site de coordination métallique du complexe bienzyme.
    1. Préparer 5 mL de solution mère de 200 mM de spermine dans de l’eau et conserver 500 μL d’aliquotes à -20 °C.
    2. Préparer 50 mL de solution sous forme de PEG 8000 à 30 mL (p/v) dans l’eau et conserver 25 mL d’aliquotes dans des flacons coniques de centrifugeuse jetable de 50 mL à 25 °C.
    3. Préparer une solution sous forme de 25 mL de 1 M CsCl dans l’eau et conserver à 25 °C.
    4. Préparer 25 mL de solution stock de 1 M de NaCl dans l’eau et conserver à 25 °C.
    5. Préparer 3x 50 mL de solution sur stock de 1 M de bicine et titrer avec du CsOH ou du NaOH pour obtenir des solutions tamponnées à des pH de 7,6, 7,8 et 8,0. Conserver 25 mL d’aliquotes à 4 °C.
  2. Décongeler un échantillon de αcomplexe 2β2StTS (20-25 mgmL-1)sur un bain de glace.
  3. Échantillon de microcentrifugeuse à 10 000 x g pendant 10 min à 25 °C pour éliminer les agrégats de protéines.
  4. Transférer la fraction surnageante dégagée dans un tube de microcentrifugation propre.
  5. Concentration protéique estimée24 et aliquotes protéiques diluées (150-200 μL) à 15 mgmL-1 avec 50 mM de bicine-CsOH ou -NaOH, pH 7,8 contenant 50 mM de CsCl ou NaCl. Conserver l’échantillon de protéines à 25 °C.
  6. Préparez les solutions de réservoir de 500 μL pour 3 plaques de chute de 24 puits dans des tubes de microcentrifugation stériles marqués de 1,5 mL. La solution réservoir contient 50 mM de bicine-CsOH ou -NaOH, 50 mM de CsCl ou NaCl et du PEG 8000. Variez la concentration de PEG 8000 (6-11%) sur les colonnes de plaque et la concentration de spermine (2-8 mM) sur les rangées de plaques. Modifiez le pH tampon (pH 7,6, 7,8 et 8,0) pour chaque ensemble.
  7. Coiffez vigoureusement les tubes et vortexez au moins 10 secondes. Tubes centrifuges à 10 000 x g pendant 10 min à 25 °C pour éliminer lesbulles. Distribuer une solution tamponnée de 500 μL dans chaque réservoir étiqueté.
  8. Utilisez une micropipette P-10 et distribuez 5 μL de solution protéique à 15 mg mL-1 par goutte assise. Évitez les bulles. Ajouter 5 μL de chaque solution de réservoir correspondante à la goutte de protéines. Évitez les bulles pendant le mélange et ne pipetez pas de haut en bas pour homogénéiser le mélange.
  9. Collez la plaque avec un ruban adhésif transparent et stockez la plaque à 25 °C. Les cristaux apparaissent en 2 à 5 jours et atteignent leurs pleines dimensions en deux semaines.

4. Collecte de données de diffraction des rayons X et α solution de structure complexe2β2StTS

REMARQUE: Avant la collecte des données de diffraction des rayons X, préparez à l’avance une solution cryoprotectrice pour chaque cristal. Utiliser la solution réservoir spécifique pour préparer 3 aliquotes contenant des concentrations croissantes dedulfoxyde de d’iméthyle en solution (10, 20 et 30 % v/v) et de ligand(s) spécifique(s). Le sulfoxyde de diméthyle s’est avéré être un meilleur cryoprotecteur que le glycérol, l’éthylène glycol et le PEG 200-300.

  1. Récoltez un gros monocrisal à l’aide d’un cryoloop au microscope stéréoscopique.
  2. Pipette 2 μL de chaque solution cryoprotectrice contenant la solution de précipitation plus des concentrations plus élevées dedulfoxyde de d’iméthyle et de ligand(s) sur une nouvelle lame de couverture.
  3. Séquentiellement, faire tremper le métaldans chaque goutte et laisser le cristal s’équilibrer pendant 30 s dans la solution cryoprotectrice.
  4. Refroidissement éclair du cristal cryoprotégé à l’aide d’un flux d’azote gazeux à -173 °C (100 K) ou immersion dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme dans des rondelles.
    REMARQUE: Remplissez une mousse Dewar avec de l’azote liquide, pré-refroidissez une rondelle en cristal, stockez les cristaux dans le stockage cryogénique Dewar et expédiez les cristaux au synchrotron à l’aide d’un expéditeur sec.
  5. Procéder à la collecte de données de diffraction des rayons X à -173°C. Enregistrez les données de diffraction des rayons X en utilisant un temps d’exposition de 0,5 à 4,0 s et des oscillations de 0,5 °. Faites pivoter le cristal de 180 à 360 °.
  6. Traitez les images de diffraction des rayons X avec iMosflm27 pour générer un fichier de réflexion dans le groupe d’espace approprié. Généralement, αcristaux 2β2StTS appartiennent au groupe spatial C 121 (C2).
  7. Mettez à l’échelle ensemble plusieurs observations de réflexions avec Scala28, implémenté dans le paquet CCP429.
  8. Résoudre la structure du complexe haute résolution α2β2StTS par remplacement moléculaire à l’aide de MolRep30 et d’un modèle de recherche approprié. Inspectez le modèle et la carte de densité d’électrons dans Coot31 après une solution de structure réussie.
    REMARQUE: Il existe de nombreuses structures de cristaux TS déposées dans la banque de données sur les protéines avec différents ligands (s). Pour une meilleure étape de remplacement moléculaire et une réduction du temps d’ajustement de la nouvelle structure cristalline, utilisez le meilleur modèle de recherche contenant le(s) ligand(s) d’intérêt. Procéder au raffinement de la structure cristalline dans CCP429,30 ou Phenix31.
  9. Effectuez des ajustements manuels sur le modèle à l’aide de Coot32, suivis d’un raffinement automatique avec Refmac29,33 ou phenix.refine31,34. Créez et affinez le modèle final en exécutant des cycles itératifs de construction de modèles dans Coot32 et en les affinant automatiquement.
  10. Procéder au dépôt des facteurs de coordonnées et de structure sur le site Web de la Banque de données sur les protéines.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Purification des sous-unités α-et β- dela tryptophane synthase
La sous-unité α(αStTS) et la sous-unité β (βStTS) de la tryptophane synthase Salmonella typhimurium ont été sous-clonées dans le vecteur pET SUMO modifié. La figure 1A montre les résultats SDS-PAGE représentatifs de deux bandes fortes correspondant à la protéine de fusion His6-SUMO-αSt<...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous avons conçu avec succès la forme mutante α2β2 βQ114A, α2β2 βK167T et α 2 complexes βS377A StTSβ 2 pour les études de corrélation structure-fonction. Initialement, nous avons essayé de purifier les mutants en utilisant un protocole de purification précédent22, qui nécessite α cristallisation complexe2β2StTS avec PEG 8000 et spermine pendant la purification. Bien que le taux de cristallisat...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer et ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par le National Institute of Health des États-Unis (GM097569).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Filtre 15 mL 10 kDade filtration centrifugeMilliporeSigmaUFC901024
15 mL Filtre 100 kDa Unitéfiltration centrifugeMilliporeSigmaUFC910024
2 mL flacons cryogéniquesCorningCLS430489Tubes cryogéniques
Fisher Scientific05-408-141Tubes à centrifuger
24 puits Cryschem PlateHampton ResearchHR3-158Plaques de descente 24 puits
2-mercaptoéthanolFisher ScientificO3446I-100Chemical
50 mL centrifugeuse tubes coniquesThermo Scientific12-565-270centrifugeuse tubes coniques
AB15 ACCUMET BasicFisher Scientific13-636-AB15pH-mètre
AgaroseFisher ScientificBP1356-100Gel d’agarose
Sulfate d’ammoniumFisher ScientificA702-500
AmpicillineFisher ScientificBP1760-5Antibiotique
Incubateur bactérienFisher ScientificIncubateur S35836.
BamHINew England BiolabsR0136SRestriction enzyme
bicineFisher ScientificBP2646100Chemical
Branson 450 Sonifier Digital BrasonB450Disrupteur cellulaire
Chlorure de césiumFisher ScientificBP210-100
Chimique Hydroxyde de césiumAcros OrganicsAC213601000Chemical
ChloramphénicolFisher ScientificBP904-100Antibiotique
diméthylsulfoxydeFisherScientific D1391
DithiothréitolFisher ScientificBP172-5ADN
chimique polyméraseThermo ScientificF530SHF polymérase
dNTP SetInvitrogen10-297-018dNTPs set
EcoRINew England BiolabsR0101SEnzyme de restriction
Acide éthylènediaminetétraacétiqueFisherScientific S311-100Chimique
Excella E25R Agitateur orbitalEppendorfNouveau-Brunswick M1353-0004Incubateur orbital
GE AKTA Prime PlusGE Healthcare8149-30-0004
Kit d’extraction de gelInvitrogenK210012Kit de purification de l’ADN
GlycérolFisher ScientificG33-500Chimique
HindIIINew England BiolabsR0104SEnzyme de restriction
Colonnes His-TrapGE HealthcareGE17-5255-015 mL Colonne Histrap
imidazoleFisher ScientificO3196-500Chimique
IPTGThermo Fisher ScientificR0392Inducteur
KanamycinFisher ScientificBP906-5Antibiotique
Kelvinator Series-100KelvinatordiscontinuéLB à congélateur ultra bas Fisher
ScientificBP1426-500Bouillon liquide
Luria Bertani agarFisher ScientificBP1425-2Bouillon solide
NaClFisher ScientificS271-500Chemical
NcoINew England BiolabsR0193SEnzyme de restriction
Perles d’affinité Ni-NTAThermo Fisher ScientificR90115Perles d’agarose Ni-NTA
PEG 8000Fisher ScientificBP233-100Produit chimique
fluorure de phénylméthylsulfonyleFisher Scientific44-865-0Chimique
pyridoxal phosphateAcros OrganicsAC228170010Chimique
S-200 HRCytiva45-000-196Colonne d’exclusion stérique
SacINew England BiolabsR0156SEnzyme de restriction
Hydroxyde de sodiumFisherScientific S318-100Chimique
Sorvall RC-5B centrifugeuseSorvall8327-30-1004Floor cetrifuge
SpermineAcros OrganicsAC132750010Chemical
Superdex 200 prep gradeCytiva45-002-491Colonne d’exclusion de taille
T4 ADN ligaseNew England BiolabsM0202SDNA liagse
TrisFisher ScientificBP152-500
Chimique Protéase spécifique à Ubl 1Thermo Scientific12588018SUMO Protéase
Unité de chimique chimique FPLC Bouillon

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miles, E. W. Tryptophan synthase: a multienzyme complex with an intramolecular tunnel. Chemical Record. 1 (2), 140-151 (2001).
  2. Raboni, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. Tryptophan synthase: a mine for enzymologists. Cellular and Molecular Life. 66 (14), 2391-2403 (2009).
  3. Dunn, M. F. Allosteric regulation of substrate channeling and catalysis in the tryptophan synthase bienzyme complex. Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 154-166 (2012).
  4. Chaudhary, K., Roos, D. S. Protozoan genomics for drug discovery. Nature Biotechnology. 23 (9), 1089-1091 (2005).
  5. Caldwell, H. D., et al. Polymorphisms in Chlamydia trachomatis tryptophan synthase genes differentiate between genital and ocular isolates. Journal of Clinical Investigation. 111 (11), 1757-1769 (2003).
  6. Kulik, V., et al. On the structural basis of the catalytic mechanism and the regulation of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium and BX1 from maize, two evolutionarily related enzymes. Journal of Molecular Biology. 352 (3), 608-620 (2005).
  7. Barends, T. R., et al. Structure and mechanistic implications of a tryptophan synthase quinonoid intermediate. Chembiochem. 9 (7), 1024-1028 (2008).
  8. Hatanaka, M., White, E. A., Horibata, K., Crawford, I. P. A study of the catalytic properties of Escherichia coli tryptophan synthetase, a two-component enzyme. Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 596-606 (1962).
  9. Henning, U., Helinski, D. R., Chao, F. C., Yanofsky, C. The A protein of the tryptophan synthetase of Escherichia coli. Purification, crystallization, and composition studies. Journal of Biological Chemistry. 237, 1523-1530 (1962).
  10. Wilson, D. A., Crawford, I. P. Purification and properties of the B component of Escherichia coli tryptophan synthetase. Journal of Biological Chemistry. 240 (12), 4801-4808 (1965).
  11. Adachi, O., Miles, E. W. A rapid method for preparing crystalline beta 2 subunit of tryptophan synthetase of Escherichia coli in high yield. Journal of Biological Chemistry. 249 (17), 5430-5434 (1974).
  12. Adachi, O., Kohn, L. D., Miles, E. W. Crystalline alpha2 beta2 complexes of tryptophan synthetase of Escherichia coli. A comparison between the native complex and the reconstituted complex. Journal of Biological Chemistry. 249 (24), 7756-7763 (1974).
  13. Higgins, W., Fairwell, T., Miles, E. W. An active proteolytic derivative of the alpha subunit of tryptophan synthase. Identification of the site of cleavage and characterization of the fragments. Biochemistry. 18 (22), 4827-4835 (1979).
  14. Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. Crystallization and preliminary X-ray crystallographic data of the tryptophan synthase alpha 2 beta 2 complex from Salmonella typhimurium. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3716-3718 (1985).
  15. Miles, E. W., et al. The beta subunit of tryptophan synthase. Clarification of the roles of histidine 86, lysine 87, arginine 148, cysteine 170, and cysteine 230. Journal of Biological Chemistry. 264 (11), 6280-6287 (1989).
  16. Rhee, S., Parris, K. D., Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. Exchange of K+ or Cs+ for Na+ induces local and long-range changes in the three-dimensional structure of the tryptophan synthase alpha2beta2 complex. Biochemistry. 35 (13), 4211-4221 (1996).
  17. Rhee, S., et al. Crystal structures of a mutant (betaK87T) tryptophan synthase alpha2beta2 complex with ligands bound to the active sites of the alpha- and beta-subunits reveal ligand-induced conformational changes. Biochemistry. 36 (25), 7664-7680 (1997).
  18. Schneider, T. R., et al. Loop closure and intersubunit communication in tryptophan synthase. Biochemistry. 37 (16), 5394-5406 (1998).
  19. Rhee, S., Miles, E. W., Davies, D. R. Cryo-crystallography of a true substrate, indole-3-glycerol phosphate, bound to a mutant (alphaD60N) tryptophan synthase alpha2beta2 complex reveals the correct orientation of active site alphaGlu49. Journal of Biological Chemistry. 273 (15), 8553-8555 (1998).
  20. Weyand, M., Schlichting, I. Crystal structure of wild-type tryptophan synthase complexed with the natural substrate indole-3-glycerol phosphate. Biochemistry. 38 (50), 16469-16480 (1999).
  21. Sachpatzidis, A., et al. Crystallographic studies of phosphonate-based alpha-reaction transition-state analogues complexed to tryptophan synthase. Biochemistry. 38 (39), 12665-12674 (1999).
  22. Yang, L. H., Ahmed, S. A., Miles, E. W. PCR mutagenesis and overexpression of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium: On the roles of beta (2) subunit Lys-382. Protein Expression and Purification. 8 (2), 126-136 (1996).
  23. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).
  24. Lowry, O. H., et al. Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent. Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).
  25. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  26. Kawasaki, H., Bauerle, R., Zon, G., Ahmed, S. A., Miles, E. W. Site-specific mutagenesis of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium. Changing arginine 179 to leucine alters the reciprocal transmission of substrate-induced conformational changes between the alpha and beta 2 subunits. Journal of Biological Chemistry. 262 (22), 10678-10683 (1987).
  27. Battye, T. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 67, Pt 4 271-281 (2011).
  28. Evans, P. Scaling and Assessment of Data Quality. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, Pt 1 72-82 (2006).
  29. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 67, 235-242 (2011).
  30. Vagin, A., Teplyakov, A. Molecular replacement with MOLREP. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 1 22-25 (2010).
  31. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 2 213-221 (2010).
  32. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 4 486-501 (2010).
  33. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 53, Pt 3 240-255 (1997).
  34. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 68, Pt 4 352-367 (2012).
  35. Matthews, B. W. Solvent content of protein crystals. Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).
  36. Kantardjieff, K. A., Matthews Rupp, B. coefficient probabilities: Improved estimates for unit cell contents of proteins, DNA, and protein-nucleic acid complex crystals. Protein Science. 12 (9), 1865-1871 (2003).

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