Method Article

Évaluation de la reprogrammation cardiaque à l’aide de l’analyse d’imagerie à haut contenu

DOI:

10.3791/61859

⸱

October 26th, 2020

 , 
1Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University, 3Vanderbilt Center for Stem Cell Biology, Vanderbilt University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons un protocole pour quantifier in vitro des cellules induites de type cardiomyocytes (iCM) directement reprogrammées en utilisant l’analyse d’imagerie à haut contenu. Cette méthode nous permet de quantifier l’efficacité de la reprogrammation cardiaque de manière automatisée et de visualiser directement les iCM.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’objectif de ce protocole est de décrire une méthode de quantification des cellules induites de type cardiomyocytes (iCM), qui sont directement reprogrammées in vitro par une technique de reprogrammation. La reprogrammation cardiaque fournit une stratégie pour générer de nouveaux cardiomyocytes. En introduisant des facteurs de transcription cardiogéniques de base dans les fibroblastes ; Les fibroblastes peuvent être convertis en iCM sans transition à travers l’état de cellule souche pluripotente. Cependant, le taux de conversion des fibroblastes en iCM reste encore faible. En conséquence, il existe de nombreuses approches supplémentaires pour améliorer l’efficacité de la reprogrammation cardiaque. La plupart de ces études ont évalué l’efficacité de la reprogrammation cardiaque à l’aide de la cytométrie en flux, tout en effectuant de l’immunocytochimie pour visualiser les iCM. Ainsi, au moins deux séries distinctes d’expériences de reprogrammation sont nécessaires pour démontrer le succès de la reprogrammation iCM. En revanche, l’analyse automatisée d’imagerie à haut contenu fournira à la fois la quantification et la qualification de la reprogrammation iCM avec un nombre relativement faible de cellules. Avec cette méthode, il est possible d’évaluer directement la quantité et la qualité des iCM avec une seule expérience de reprogrammation. Cette approche sera en mesure de faciliter les futures études de reprogrammation cardiaque qui nécessitent des expériences de reprogrammation à grande échelle, telles que le criblage de facteurs génétiques ou pharmacologiques pour améliorer l’efficacité de la reprogrammation. De plus, l’application du protocole d’analyse d’imagerie à haut contenu ne se limite pas à la reprogrammation cardiaque. Il peut être appliqué à la reprogrammation d’autres lignées cellulaires ainsi qu’à toute expérience d’immunomarquage nécessitant à la fois la quantification et la visualisation de cellules immunomarquées.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La reprogrammation cardiaque a été développée comme une approche alternative aux approches médiées par les cellules souches pour générer de nouveaux cardiomyocytes. Étant donné qu’il ne passe pas par l’état de cellules souches, il a un fort potentiel de contournement de certaines limitations héréditaires dans les approches médiées par les cellules souches. Il a été démontré qu’une infection virale d’au moins trois ou quatre facteurs de transcription cardiogéniques dans les fibroblastes peut convertir les fibroblastes vers un destin cardiaque en éliminant les programmes géniques des fibroblastes et en reconstruisant les réseaux transcriptionnels cardiogéniques dans les fibroblastes 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14,15,16,17.

Depuis la première étude marquante démontrant la reprogrammation cardiaque in vitro1, le protocole de reprogrammation cardiaque a été optimisé par de nombreuses études 3,5,6,7,9,11,12,13,14,15,16,18 . Les approches techniques courantes pour évaluer les phénotypes cardiaques dans les fibroblastes après une reprogrammation cardiaque ont été l’analyse par cytométrie en flux pour quantifier les cellules exprimant des marqueurs cardiomyocytaires spécifiques et l’immunocytochimie pour visualiser ces cellules à un seul niveau cellulaire. Bien que les deux expériences (c’est-à-dire la cytométrie en flux et l’immunocytochimie) doivent démontrer l’expression de marqueurs cardiomyocytaires à l’aide des mêmes anticorps, elles doivent être réalisées séparément. De plus, la cytométrie en flux nécessite un nombre relativement plus important de cellules, ce qui augmente la quantité de réactifs nécessaires à l’expérience. Alternativement, les cellules positives pour les marqueurs cardiomyocytaires peuvent être quantifiées par comptage manuel après immunocytochimie. Cependant, il demande beaucoup de main-d’œuvre et a tendance à être moins précis.

L’objectif de ce protocole est de décrire la méthode qui permet de quantifier et de visualiser les iCM par une seule expérience d’immunomarquage à l’aide d’une analyse automatisée d’imagerie à haut contenu. Il nécessite un nombre relativement faible de cellules de départ car ce protocole est effectué dans un puits de plaque à 24 puits. Jusqu’à trois marqueurs différents peuvent être utilisés en même temps. Les cellules positives simples, doubles et triples peuvent être quantifiées automatiquement. En plus de la quantification des cellules immunomarquées, l’analyse d’imagerie à haut contenu fournit des images objectives 2-100x de haute qualité. Si nécessaire, les mêmes cellules immunomarquées utilisées dans l’analyse d’imagerie à haut contenu peuvent être réutilisées pour d’autres études d’imagerie, telles que la microscopie confocale. Le principal avantage de ce protocole est qu’il fournit non seulement une quantification non biaisée des iCM avec un nombre beaucoup plus petit de cellules, mais également une visualisation des iCM. De plus, ce protocole peut être utilisé pour évaluer la reprogrammation de la lignée non cardiaque (par exemple, la reprogrammation des iPSC, des neurones et des hépatocytes).

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les procédures sur les animaux ont été effectuées avec l’approbation du comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du centre médical de l’Université Vanderbilt.

1. Génération de rétrovirus et reprogrammation cardiaque in vitro

  1. Cultivez des cellules E de platine dans du DMEM avec 10 % de FBS, 1 % de pénicilline/streptomycine, 1 μg/mL de puromycine et 10 μg/mL de blasticidine jusqu’à ce que la confluence des cellules de platine E atteigne 70 % à 80 %.
  2. Le jour 1, ensemencer ~0,55 x 106 cellules (premier puits) et ~0,18 x 106 cellules (deuxième puits) dans deux puits distincts de plaque à 12 puits avec 1 mL de DMEM complété par 10 % de FBS et 1 % de pénicilline/streptomycine un jour avant la première transfection.
    REMARQUE : Différentes tailles de boîtes de culture peuvent être utilisées en fonction de la quantité de milieux viraux nécessaires pour les expériences. Voir le tableau 1 pour d’autres échelles d’expériences.
  3. Au jour 2, transfectez la construction rétrovirale quadri-cistronique M-G-T-H codant pour Mef2c, Gata4, Tbx5 et Hand2 décrits dans l’étude précédente9 ou le vecteur vide dans les cellules de platine E du premier puits. Ajouter 3 μL de réactif de transfection à 30 μL de milieu sérique réduit. Cinq minutes plus tard, ajoutez 1 μg de construction rétrovirale ou le vecteur vide dans le mélange de réactif de transfection et de milieu sérique réduit. Après 20 min d’incubation à température ambiante, ajoutez le mélange aux cellules E de platine.
  4. Le jour 3, 16 à 20 h après la transfection, retirer le milieu et faire le plein de DMEM frais complété par 10 % de FBS et 1 % de pénicilline/streptomycine.
  5. Le jour 3, 24 h après la première transfection, effectuez la deuxième transfection dans le deuxième puits dans lequel les cellules de platine E ont été plaquées le jour 1, comme décrit à l’étape 1.3).
  6. Le jour 3, ensemencez ~5 x 104 fibroblastes embryonnaires de souris congelés (MEF) isolés de souris rapporteures Titin-GFP knock-in19 dans un puits de plaque de 24 puits. Au total, deux puits de plaque de 24 puits sont nécessaires (c.-à-d. témoin non infecté et infection M-G-T-H).
    REMARQUE : Le nombre de MEF plaqués peut devoir être ajusté, car le taux de récupération des MEF congelés peut varier en fonction des conditions de congélation de la cellule. Une confluence d’environ 10 % par jour après l’ensemencement des cellules est suffisante pour la reprogrammation. L’efficacité de la reprogrammation pourrait être améliorée à l’aide de MEF frais et non congelés.
  7. Le jour 4, 16 à 20 h après la deuxième transfection, retirer le milieu et faire le plein de DMEM frais complété par 10 % de FBS et 1 % de pénicilline/streptomycine.
  8. Le jour 4, 48 h après la première transfection, prélever le milieu viral dans le premier puits des cellules de platine E à l’aide d’une seringue de 5 mL et les filtrer à travers un filtre à membrane en polyéthersulfone (PES) de 0,45 μm. Retirer le milieu de croissance des fibroblastes sur les MEF et les remplacer par le milieu viral complété par du polybrène à 6 μg/mL (première infection).
  9. Le jour 5, 48 h après la deuxième transfection, effectuer la deuxième infection à l’aide du milieu viral du deuxième puits comme décrit à l’étape 1.8).
  10. Le jour 6, 24 h après la deuxième infection, les milieux viraux sont remplacés par des milieux d’induction cardiaque composés de DMEM/199 (4:1), 10 % de FBS, 5 % de sérum de cheval, 1 % de pénicilline/streptomycine, 1 % d’acides aminés non essentiels, 1 % d’acides aminés essentiels, 1 % de B-27, 1 % d’insuline-sélénium-transferrine, 1 % de mélange de vitamines et 1 % de pyruvate de sodium, 1 μM SB431542 et 0,5 μm A83-01. Changez de milieu d’induction cardiaque tous les trois jours jusqu’à ce que les cellules soient récoltées.

2. Immunomarquage

  1. 14 à 15 jours après l’infection, fixez les cellules sur une plaque à 24 puits avec 2 % de paraformaldéhyde pendant 15 min.
  2. Perméabiliser les cellules fixes avec un tampon de perméabilisation (0,05 % de Triton-X dans le PBS) en lavant les cellules trois fois avec un tampon de perméabilisation toutes les 5 min.
  3. Incuber les cellules avec un tampon de blocage universel pendant 45 min.
  4. Incuber les cellules avec de la α-actinine de souris (dilution 1:400) et des anticorps GFP de poulet (dilution 1:400) pendant 1,5 h à température ambiante.
    REMARQUE : Environ 150 μL de solution d’anticorps peuvent couvrir toute la surface d’un puits ou d’une plaque à 24 puits.
  5. Lavez les cellules avec un tampon de perméabilisation pendant 5 minutes trois fois.
  6. Incuber les cellules avec des anticorps secondaires anti-souris Alexa-555 et anti-poulet Alexa-488 (dilution 1:400) pendant 1 h à température ambiante
  7. Lavez les cellules avec un tampon de perméabilisation pendant 5 minutes trois fois.
  8. Ajouter 2,5 μL de solution DAPI dans 250 μL de tampon de perméabilisation.

3. Imagerie à haut contenu

  1. Mettez le système d’imagerie sous tension.
  2. Ouvrez le logiciel associé.
  3. Connectez-vous au système.
  4. Dans la barre des tâches, sélectionnez Exécuter une plaque.
  5. Cliquez sur Ouvrir la plaque d’éjection de la porte pour ouvrir la porte de la machine et y mettre la plaque. Assurez-vous que la plaque est dans la bonne direction. Cliquez sur Fermer la plaque de charge de porte pour fermer la porte.
  6. Cliquez sur Paramètres de la plaque de charge. Sélectionnez un modèle de protocole, puis cliquez sur Charger à partir de la base de données.
  7. Cliquez sur Configuration de l’acquisition.
  8. Dans la boîte de dialogue Configuration de l’acquisition de plaques , cliquez sur Configurer.
  9. Dans l’onglet Objectif et caméra , sélectionnez Objectif 10x.
  10. Dans l’onglet Plaque , sélectionnez une plaque à 24 puits.
  11. Dans l’onglet Sites à visiter des options de site, choisissez « Nombre fixe de sites » pour déterminer le nombre de sites d’imagerie en choisissant le nombre dans les colonnes et les lignes. Au total, 36 sites d’imagerie sont utilisés en sélectionnant 6 en colonnes et 6 en lignes. Sélectionnez l’espacement entre chaque site d’imagerie (c’est-à-dire 500 μm).
  12. Dans l’onglet Acquisition , définissez le nombre de longueurs d’onde sur 3.
  13. Dans l’onglet Longueurs d’onde d’Illumination, sélectionnez DAPI, FITC ou Texas Red pour chaque longueur d’onde séparément.
  14. Cliquez sur l’onglet Exécuter , puis configurez le « Nom du dossier » et le « Nom de la plaque » pour la plaque.  Cliquez sur les puits sur le diagramme de plaque pour l’imagerie, puis sur Calculer pour configurer le décalage de mise au point pour chaque longueur d’onde. Configurez d’abord le décalage foucs pour DAPI. Cliquez sur Exposition automatique pour configurer automatiquement le temps d’exposition pour chaque longueur d’onde. Ensuite, cliquez sur Acquérir la plaque pour commencer à imager les sites sélectionnés.

4. Analyse de l’imagerie à haut contenu

  1. Une fois l’imagerie à haut contenu terminée, cliquez sur le menu Criblage et sélectionnez Examiner les données de la plaque pour sélectionner une plaque à analyser.
  2. Cliquez sur Sélectionner une plaque. Dans la boîte de dialogue Sélectionner la plaque pour la révision , ouvrez le dossier et sélectionnez la plaque enregistrée dans la base de données, puis cliquez sur Sélectionner.
    REMARQUE : Pour afficher les images, sélectionnez DAPI, FITC et Texas Red dans le champ Longueurs d’onde . Dans le champ Sites , sélectionnez Tous les sites. Cliquez sur un site parmi les 36 sites sélectionnés pour l’afficher dans chaque fenêtre d’image de longueur d’onde, puis cliquez sur Tableau de recherche pour sélectionner une couleur pour la longueur d’onde. Utilisez la touche Impr écran du clavier et collez l’image dans un logiciel de retouche photo (par exemple, Paint et Photoshop) pour l’enregistrer.
  3. Cliquez sur Exécuter l’analyse et sélectionnez un paramètre de modèle.
  4. Cliquez sur Configurer les paramètres puis sur Nombre de longueurs d’onde. Sélectionnez trois longueurs d’onde (c’est-à-dire DAPI pour la coloration des noyaux, Teaxs Red pour la α-actinine et FITC pour Titin-GFP).
  5. À l’aide de l’outil Ligne de la barre d’outils, mesurez la largeur sur l’axe court d’une cellule. En fonction de la largeur mesurée des cellules, définissez les options « Largeur minimale approximative » et « Largeur maximale approximative » pour inclure la plupart des cellules du site d’imagerie sélectionné.
  6. Cliquez sur Aperçu pour vérifier si presque tous les noyaux sont sélectionnés. Les noyaux sélectionnés présentent une couleur blanche, tandis que les noyaux non sélectionnés restent bleus (colorés au DAPI). Si nécessaire, ajustez les options « Largeur minimale approximative » et « Largeur maximale approximative ».
  7. Pour définir l’intensité au-dessus de l’arrière-plan local, placez le curseur de la souris à l’intérieur et à l’extérieur d’une cellule. La valeur d’intensité s’affiche en bas de la fenêtre. Réduisez légèrement l’intensité d’une cellule sombre pour afficher uniformément l’intensité sur toute la surface de chaque cellule. Définissez cette valeur d’intensité comme Valeur d’intensité supérieure à la valeur d’arrière-plan local . Cette valeur doit être définie séparément pour chaque canal.
  8. Cliquez sur le menu Tramage et sélectionnez Utilitaires de données de plaque. Dans la boîte de dialogue Utilitaires de données de plaque , cliquez sur Exécuter l’analyse pour sélectionner la plaque.
  9. Dans le champ Paramètres , sélectionnez le paramètre enregistré pour l’analyse. sélectionnez Ajouter à la liste d’exécution automatique, puis cliquez sur OK pour exécuter l’analyse.
  10. Une fois l’analyse terminée, cliquez sur le menu Criblage et sélectionnez Utilitaires de données de plaque. Ensuite, dans la boîte de dialogue Utilitaires de données de plaque , cliquez sur Exporter les mesures pour exporter les résultats de l’analyse.
  11. Cliquez sur Mesures de cellules et d’images, puis sur OK.
  12. Sur la page Assistant d’exportation des mesures - Étape 1 , sélectionnez la plaque et cliquez sur Suivant.
  13. Sur la page Assistant d’exportation des mesures - Étape 2 , cliquez sur Terminer.
  14. Sur la page Configurer l’exportation de données, sélectionnez les types de données (c’est-à-dire le nom du puits, le nombre total de cellules, le numéro de sous-total de la cellule pour DAPI+, le sous-total du numéro de cellule pour Texas Red+, le sous-total du numéro de cellule pour DAPI+Texas Red+, le sous-total du numéro de cellule pour DAPI+FITC+, le pourcentage de cellules DAPI+, le pourcentage de cellules DAPI+, pourcentage de cellules DAPI+Texas Red+, pourcentage de cellules DAPI+FITC+ et pourcentage de cellules DAPI+Texas Red+FITC+) puis cliquez sur OK.
  15. Sur la page Exporter sous forme de fichier texte, sélectionnez la destination d’enregistrement du fichier et cliquez sur OK.
  16. Ouvrez le fichier dans Microsoft Excel. Les résultats seront présentés par chaque site (tableau 2). Il y a 36 sites par puits. À l’aide de l’outil d’analyse, tableau croisé dynamique, résumez les données des 36 sites (c.-à-d. la somme des numéros de cellules et les moyennes du pourcentage de cellules indiqué dans l’ensemble des 36 sites) (tableau 3).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Suite à des expériences de reprogrammation, nous avons quantifié les iCM à l’aide de l’analyse d’imagerie à haut contenu comme décrit ci-dessus. La figure 1 présente des images composites de 36 sites d’imagerie utilisés pour l’analyse d’imagerie à haut contenu. Les iCM sont définis comme des cellules doublement positives (α-actinine+Titin-eGFP+) dans ces expériences. L’analyse d’imagerie à haut contenu montre que ~26 % des cellules présentaient les deux marqueurs cardia...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les études de reprogrammation précédentes ont évalué l’efficacité de la reprogrammation à l’aide de la cytométrie en flux et ont démontré la qualité structurelle des iCM à l’aide de l’immunocytochimie dans deux expériences distinctes. L’analyse par cytométrie en flux nécessite un nombre beaucoup plus important de cellules de départ, ce qui augmente l’échelle des expériences. En revanche, l’analyse d’imagerie à haut contenu peut évaluer à la fois la qualité et la quantité de reprogrammati...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’analyse d’imagerie à haut contenu a été réalisée dans la plateforme de criblage à haut débit (HTS) de Vanderbilt avec l’aide de David Westover et Joshua Bauer. Le HTS Core reçoit le soutien du Vanderbilt Institute of Chemical Biology et du Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485). Ce travail a été soutenu par le prix AHA Innovative Project Award 18IPA34110341 et NIH R01 HL146524 (Y-.J. N.), et le prix de bourse postdoctorale AHA 20POST35210170 (Z.Z).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
A83-01Tocris2939
anti-poulet Alexa 488ThermofisherA11039
anticorps anti-GFPInvitrogenA10262
anti-souris Alexa 555ThermofisherA21422
anticorps anti-alpha ;-actinineSigmaA7811
Solution DAPILaboratoires vectorielsH1200
Fugene 6PromegaE2691
Insuline-Transferrin-SeleniumG supplementInvitrogen41400-045
Medium 199Invitrogen11150059
MEM vitamin solutionInvitrogen11120-052
Logiciel MetaXpressDispositif
Micro XL système automatisé d’imagerie cellulaireDispositif
Solution minimale d’acides aminés essentielsSigmaM7145
Opti-MEMGibco31905-070
Filtre PES (0,45 µ ; m)Thomas scientific1159T84
Cellules P PCell BiolabsRV-101
PolybreneSigmaH9268
SB431542SigmaS4317
Tampon de blocage universelBiogeneXHK083-50K
moléculairemoléculaire

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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