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Article de méthode

Coculture de neurones rétiniens axotomisés de ganglion de rat avec glia ensheathing olfactif, comme modèle in vitro de régénération axonale adulte

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DOI :

10.3791/61863

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2 novembre 2020

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1Facultad de CC Experimentales, Universidad Francisco de Vitoria, 2Dept. Biomedical and Biotechnological Sciences, Section of Physiology, University of Catania, 3Dept. Anatomía, Histología y Neurociencia, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un modèle in vitro pour évaluer la capacité neurorégénérative olfactive d’ensheathing de glia (OEG), après dommages neuronaux. Il est basé sur une coculture de neurones ganglionnaires rétiniens adultes axotomisés (RGN) sur les monocouches OEG et l’étude subséquente de la régénération axonale, en analysant les marqueurs axonals et somatodendritiques RGN.

Résumé

Les cellules olfactives d’ensheathing glia (OEG) sont localisées tout le chemin de la muqueuse olfactive à et dans la couche olfactive de nerf (ONL) de l’ampoule olfactive. Tout au long de la vie adulte, ils sont essentiels à la croissance axonale des neurones olfactifs nouvellement générés, de la propria lamina à l’ONL. En raison de leurs propriétés pro-régénératives, ces cellules ont été utilisées pour favoriser la régénération axonale dans les modèles de lésions de la moelle épinière ou du nerf optique.

Nous présentons un modèle in vitro pour apaiser et mesurer la capacité neurorégénérative d’OEG après des dommages neuronaux. Dans ce modèle, l’OEG humain réversiblement immortalisé (ihOEG) est cultivé comme monocouche, les rétines sont extraites des rats adultes et les neurones rétiniens de ganglion (RGN) sont coculturels sur le monocouche d’OEG. Après 96 h, les marqueurs axonals et somatodendritiques dans les RGN sont analysés par immunofluorescence et le nombre de RGNs avec l’axone et la longueur/neurone axonal moyen sont quantifiés.

Ce protocole a l’avantage sur d’autres analyses in vitro qui reposent sur des neurones embryonnaires ou postnatals, qu’il évalue les propriétés neurorégénératives oeg dans les tissus adultes. En outre, il est non seulement utile pour évaluer le potentiel neurorégénératif de l’ihOEG, mais peut être étendu à différentes sources d’OEG ou d’autres cellules gliales.

Introduction

Les neurones du système nerveux central adulte (SNC) ont une capacité de régénération limitée après une blessure ou une maladie. Une stratégie commune pour favoriser la régénération de CNS est la transplantation, au site de blessure, des types de cellules qui induisent la croissance axonale telle que des cellules souches, des cellules de Schwann, des astrocytes ou des cellules olfactives d’ensheathing glia (OEG)1,2,3,4,5.

OEG dérive de la crêteneurale 6 et se trouve dans la muqueuse olfactive et dans le bulbe olfactif. Chez l’adulte, les neurones sensoriels olfactifs meurent régulièrement à la suite de l’exposition à l’environnement et ils sont remplacés par des neurones nouvellement différenciés. OEG entoure et guide ces nouveaux axones olfactifs pour entrer dans l’ampoule olfactive et établir de nouvelles synapses avec leurs cibles dans le CNS7. En raison de ces attributs physiologiques, OEG a été employé dans des modèles des dommages de CNS tels que la moelle épinière ou la lésion de nerf optique et ses propriétés neuroregénératives et neuroprotective deviennentprouvées 8,9,10,11. Plusieurs facteurs ont été identifiés comme responsables des caractéristiques pro-régénératrices de ces cellules, y compris la production extracellulaire de protéases de matrice ou la sécrétion des facteurs neurotrophiques et axonalsde croissance 12,13,14.

Compte tenu des limitations techniques pour étendre les cellules OEG primaires, nous avons précédemment établi et caractérisé réversible immortalisé oeg humain (ihOEG) lignes clonales, qui fournissent un approvisionnement illimité d’OEG homogène. Ces cellules ihOEG proviennent de cultures primaires, préparées à partir d’ampoules olfactives obtenues lors d’autopsies. Ils ont été immortalisés par transduction de la sous-unité catalytique de télomérase (TERT) et de l’oncogène Bmi-1 et modifiés avec le virus SV40 grand antigène T15,16,17,18. Deux de ces lignées cellulaires ihOEG sont Ts14, qui maintient la capacité régénératrice des cultures originales et Ts12, une ligne régénérative faible qui est utilisée comme un faible contrôle de régénération dans ces expériences18.

Pour évaluer la capacité d’OEG à favoriser la régénération axonale après des dommages neuronaux, plusieurs modèles in vitro ont été mis en œuvre. Dans ces modèles, l’OEG est appliqué aux cultures d’origine neuronale différente et la formation et l’allongement de neurite- en réponse à la coculture gliale- sont assayed. Des exemples de telles sources neuronales sont les neurones corticals néonatals de rat19,les blessures d’éraflure exécutées sur les neurones embryonnaires de rat du tissu cortical20,les explants rétiniens de rat21,les neurones postnatals hypothalamiques ou hippocampal de rat22,23, neurones postnatals de ganglion de racine dorsale de rat24,neurones corticospinal postnatals de région de souris25,neurones humains de NT226,ou neurones corticals cérébraux postnatals sur les cultures réactives de cicatrice d’astrocyte27.

Dans ces modèles, cependant, l’analyse de régénération repose sur des neurones embryonnaires ou postnatals, qui ont une plasticité intrinsèque qui est absente dans les neurones adultes blessés. Pour surmonter cet inconvénient, nous présentons un modèle de régénération axonale adulte dans les cocultures de lignées OEG avec des neurones ganglionaux rétiniens adultes (RRG), basé sur celui développé à l’origine par Wigley et coll.28,29,30,31 et modifié et utilisé par notre groupe12,13,14,15,16,17,18,32,33. En bref, le tissu rétinien est extrait de rats adultes et digéré avec de la papaïne. La suspension cellulaire rétinienne est ensuite plaquée sur des couvre-plaques traités à la polylysine ou sur des monocouches Ts14 et Ts12. Les cultures sont maintenues pendant 96 h avant d’être fixées, puis l’immunofluorescence pour les protéines axonales (protéines MAP1B et NF-H)34 et les marqueurs somatodendritiques (MAP2A et B)35 sont effectués. La régénération axonale est quantifiée en pourcentage des neurones avec l’axone, en ce qui concerne la population totale de RRG et l’indice de régénération axonale est calculée comme la longueur axonale moyenne par neurone. Ce protocole est non seulement utile pour évaluer le potentiel neurorégénératif de l’ihOEG, mais peut être étendu à différentes sources d’OEG ou d’autres cellules gliales.

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Protocole

REMARQUE : L’expérimentation animale a été approuvée par les comités nationaux et institutionnels de bioéthique.

1. culture ihOEG (Ts12 et Ts14)

REMARQUE : Cette procédure se fait dans des conditions stériles dans une armoire de biosécurité de culture tissulaire.

  1. Préparez 50 mL me10 milieu de culture OEG tel que fourni dans le tableau 1.
  2. Préparer 5 mL de DMEM/F12-FBS, tel que prévu dans le tableau 1,dans un tube conique de 15 mL.
  3. Réchauffer les deux supports à 37 °C dans un bain d’eau propre, pendant 15 min.
  4. Décongeler les flacons des cellules Ts12 et Ts14 à 37 °C dans un bain d’eau propre.
  5. Resuspendez et ajoutez des cellules au milieu de culture DMEM/F12-FBS préparé à l’étape 2.
  6. Centrifugeuse pendant 5 min à 200 x g.
  7. Aspirez au surnatant.
  8. Ajouter 500 μL de ME10 moyen et réutiliser la pastille.
  9. Préparer un plat de culture cellulaire p60 avec 3 mL de ME10 et ajouter la suspension cellulaire, dropwise.
  10. Déplacez-vous pour répartir les cellules uniformément sur la plaque.
  11. Cellules de culture à 37 °C dans 5% DE CO2.
    REMARQUE : Après avoir atteint la confluence, au moins un autre passage doit être fait pour optimiser les cellules pour la coculture. 90% de confluence est nécessaire avant de les ensemencer sur les coverslips pour la coculture. Un confluent p-60 a un nombre moyen de cellules de 7 x 105 pour Ts14 et 2,5 x 106 pour les lignées cellulaires Ts12. Les lignées cellulaires Ts12 et Ts14 doivent être passages tous les 2 à 3 jours.

2. Préparation de l’ihOEG (Ts12 et Ts14) pour l’essai

REMARQUE : Cette étape doit être effectuée 24 h avant la dissection et la coculture du RGN.

  1. Traiter les couvre-lips Ø de 12 mm avec 10 μg/mL poly-L-lysine (PLL) pendant 1 h.
    REMARQUE : Les coverslips peuvent être laissés pendant la nuit dans la solution PLL.
  2. Lavez les coverslips avec 1x phosphate tampon salin (PBS), trois fois.
  3. Détachez les cellules Ts12 et Ts14 ihOEG du plat de culture cellulaire p60.
    1. Ajouter 4 mL de milieu de culture DMEM/F12-FBS(tableau 1)à un tube conique de 15 mL. Chaud à 37 °C dans un bain d’eau propre.
    2. Retirer le milieu des assiettes et laver les cellules avec 1 mL de 1x PBS-EDTA, une fois.
    3. Ajouter 1 mL de trypsine-EDTA aux cellules OEG et incuber pendant 3-5 min à 37 °C, 5 % de CO2.
    4. Recueillir les cellules avec une pipette p1000 et les transférer à moyen préparé à l’étape 3.1.
    5. Centrifugeuse pendant 5 min à 200 x g.
    6. Aspirez au surnatant.
    7. Ajouter 1 mL de ME10 moyen et réutiliser la pastille.
    8. Comptez le numéro de cellule dans un hémocytomètre.
  4. Ensemencer 80 000 cellules Ts14 ou 100 000 cellules Ts12/puits sur les couvertures dans des plaques de 24 puits dans 500 μL de me10 moyen.
  5. Cellules de culture à 37 °C à 5 % de CO2, pendant 24 h.

3. Dissection des tissus rétiniens

REMARQUE : Les rats Wistar mâles de 2 mois sont utilisés comme source RGN. Deux rétines (un rat) pour 20 puits d’un plat cellulaire de 24 puits. Autoclave matériel chirurgical avant utilisation. Papain kit de dissociation est acheté commercialement (Table of Materials). Suivez les instructions du fournisseur pour la reconstitution. Reconstituer D, L-2-amino-5-phosphonovaleric acide (APV) dans le stock de 5 mM et préparer les aliquots.

  1. Le jour de l’analyse, préparez les médias suivants.
    1. Préparer un plat de culture cellulaire p60 avec 5 mL d’EBSS froid (flacon 1 du kit de dissociation de la papaïne).
    2. Préparer un plat de culture cellulaire p60 avec du flacon reconstitué 2 (papain) du kit de dissociation de la papaïne plus 50 μL d’APV.  Ensuite, ajoutez 250 μL de flacon reconstitué 3 (DNase plus 5 μL d’APV).
    3. Dans un tube stérile, mélanger 2,7 mL de flacon 1 avec 300 μL de flacon 4 (inhibiteur de la protéase albumin-ovomucoïde). Ajouter 150 μL de flacon 3 (DNase) plus 30 μL d’APV.
    4. Préparer 20 mL de milieu Neurobasal-B27 (NB-B27) tel que fourni dans le tableau 1.
  2. Sacrifier un rat par asphyxie avec du CO2.
  3. Retirer la tête par décapitation avec de la guillotine; placez-le dans une boîte de Pétri de 100 mm et vaporisez la tête d’éthanol à 70 % avant de la placer dans un capot d’écoulement laminaire.
  4. Couper les moustaches du rat avec des ciseaux afin qu’ils n’interfèrent pas avec la manipulation des yeux.
  5. Saisir le nerf optique avec des forceps pour retirer le globe oculaire assez pour être en mesure de faire une incision à travers l’œil avec un scalpel.
  6. Retirez la lentille et l’humour vitreux et retirez la rétine (tissu orange), tandis que les couches restantes de l’œil restent à l’intérieur (y compris la couche épithéliale pigmentaire).
  7. Placez la rétine dans le plat de culture cellulaire p60 préparé à l’étape 3.1.1.
  8. Transférer la rétine dans le plat de culture cellulaire p60 préparé à l’étape 3.1.2 et le couper avec le scalpel en petits morceaux d’une taille approximative < 1 mm.
  9. Transférer dans un tube en plastique de 15 mL.
  10. Incuber le tissu pendant 30 min, dans un incubateur humidifié à 37 °C sous 5% de CO2,avec agitation toutes les 10 minutes.
  11. Dissocier les touffes de cellules en pipetage de haut en bas avec une pipette pasteur en verre.
  12. Centrifugeuse de la suspension cellulaire à 200 x g pendant 5 min.
  13. Jetez le supernatant et inactivez la papaïne, réutilisez la pastille cellulaire dans la solution préparée à l’étape 3.1.3. (1,5 mL pour 2 yeux).
  14. Pipet soigneusement cette suspension cellulaire en 5 mL de flacon reconstitué 4.
  15. Centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min.
  16. Pendant la centrifugeuse, retirez complètement le milieu ME-10 de la plaque cellulaire du puits OEG 24 (préalablement préparée à l’étape 2) et remplacez-la par 500 μL de NB-B27 moyen par puits.
  17. Jetez le supernatant et resuspendez les cellules dans 2 mL de milieu NB-B27.
  18. Plaque 100 μL de suspension cellulaire rétinienne, par puits de la plaque m24, sur des monolayers-coverslips PLL ou OEG.
  19. Maintenir les cultures à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 96 h dans le milieu du NB-B27.

4. Immunostaining

  1. Après 96 h, fixer les cellules pendant 10 min en ajoutant le même volume de 4% de paraformaldéhyde (PFA) en 1x PBS au milieu de culture (600 μL) (concentration finale PFA 2%).
  2. Retirez le média et le PFA de la plaque 24-multiwell et ajoutez encore une fois 500 μL de 4% de paraformaldéhyde (PFA) en 1x PBS. Incuber pendant 10 min.
  3. Jeter le fixateur et laver 3 fois avec 1x PBS pendant 5 min.
  4. Bloc avec 0,1% Triton X-100/1% FBS en PBS (PBS-TS) pendant 30-40 min.
  5. Préparez les anticorps primaires dans le tampon PBS-TS comme suit : SMI31 (contre les protéines MAP1B et NF-H) anticorps monoclonaux (1:500). 514 (reconnaît les protéines MAP2A et B) antisérum polyclonal de lapin (1:400).
  6. Ajouter des anticorps primaires aux cocultures et incuber toute la nuit à 4 °C.
  7. Le lendemain, jetez les anticorps et lavez les coverslips avec 1x PBS, 3 fois, pendant 5 min.
  8. Préparez les anticorps secondaires dans le tampon PBS-TS comme suit: Pour SMI-31, anti-souris Alexa Fluor 488 (1:500). Pour 514, anti-lapin Alexa-594 (1:500).
  9. Incuber les cellules avec les anticorps secondaires fluorescents correspondants pendant 1 h, à RT, dans l’obscurité.
  10. Laver les coverslips avec 1x PBS, 3 fois, pendant 5 min, dans l’obscurité.
  11. Enfin, montez des coverslips avec support de montage(Table of Materials)et maintenez-les à 4 °C.
    REMARQUE : Chaque fois que nécessaire, des noyaux fluorescents souillant avec DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) peuvent être exécutés. Avant de monter, incuber les cellules pendant 10 min dans l’obscurité avec dapi (10 μg/mL en 1x PBS). Lavez les coverslips 3 fois avec 1x PBS et enfin, montez les coverslips avec le support de montage.

5. Quantification de régénération axonale

REMARQUE : Les échantillons sont quantifiés dans le cadre de l’objectif 40x d’un microscope à épifluorescence. Un minimum de 30 photos doivent être prises sur des champs aléatoires, avec au moins 200 neurones, à quantifier pour chaque traitement. Chaque expérience doit être répétée au moins trois fois.

  1. Quantifier le pourcentage de neurones avec l’axone (SMI31 neurite positif) par rapport à la population totale de RGNs (identifié avec MAP2A/B 514 immunostaining positif du corps neuronal et des dendrites).
  2. Quantifier l’indice de régénération axonale ou la longueur axonale moyenne (μm/neurone). Ce paramètre est défini comme la somme des longueurs (en μm) de tous les axones identifiés, divisés par le nombre total de neurones comptés, qu’ils présentaient ou non un axone. La longueur axonale est déterminée à l’aide du plugin NeuronJ du logiciel d’image ImageJ (NIH-USA).
  3. Calculez la signification moyenne, l’écart type et la signification statistique à l’aide du logiciel approprié.

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Résultats

Dans ce protocole, nous présentons un modèle in vitro pour apaiser la capacité neurorégénérative d’OEG après des dommages neuronaux. Comme le montre la figure 1, la source de l’OEG est une lignée cellulaire clonale humaine immortalisée réversible -Ts14 et Ts12-, qui provient de cultures primaires, préparées à partir d’ampoules olfactives obtenues dans les autopsies15,17,18. Le tissu rétinien est ext...

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Discussion

La transplantation d’OEG aux emplacements de dommages de CNS est considérée une thérapie prometteuse pour des dommages de CNS dus à ses propriétés pro-neurorégénérativesconstitutives 7,8,9. Toutefois, selon la source tissulaire — muqueuse olfactive (OM-OEG) par rapport à l’ampoule olfactive (OB-OEG) — ou l’âge du donneur, il existe des variations considérables dans cettecapacité 26,

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ces travaux ont été soutenus financièrement par le projet SAF2017-82736-C2-1-R de Ministerio de Ciencia e Innovación à MTM-F et par fundación Universidad Francisco de Vitoria à JS.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
anticorps 514Référence 34Antisérum polyclonal de lapin, qui reconnaît MAP2A et B.
anticorps SMI-31BioLegend801601Anticorps monoclonal contre les protéines MAP1B et NF-H
anti-souris Alexa Fluor 488ThermoFisherA-21202
anti-lapin Alexa Fluor 594 AnticorpsThermoFisherA-21207
B-27 SupplémentGibco17504044
D,L-2-amino-5-phosphonovalériqueSigma283967inhibiteur du récepteur NMDA
DAPISigmaD9542Noyaux colorant fluorescent
DMEM-F12Gibco11320033Milieu de culture cellulaire
FBSGibco11573397Sérum fœtal bovin
FBS-HycloneFisher Scientific16291082Sérum fœtal bovin
FluoromountSouthern Biotech0100-01Support de montage
ImageJNational Institutes of Health (NIH-USA)Logiciel d’image
L-GlutamineLonzaBE17-605F
Milieu neurobasalGibco21103049Milieu de culture de cellules neuronales
Système de dissociation de la papaïneWorthington Biochemical CorporationLK003150Pour utilisation dans l’isolement des cellules neurales
PBSFait
PBS-EDTALonzaH3BE02-017F
Pénicilline/Streptomycine/Amphotéricine BLonza17-745EBactériostatique et bactéricide
Extrait hypophysaireGibco13028014Extrait hypophysaire bovin
Poly -L- lysine (PLL)SigmaA-003-M
maison

Références

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