Article de méthode
La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) permet l’imagerie sélective et sans étiquette de fractions chimiques spécifiques et elle a été utilisée efficacement pour imager des molécules lipidiques in vivo. Ici, nous fournissons une brève introduction au principe de la microscopie SRS et décrivons des méthodes pour son utilisation dans le stockage des lipides d’imagerie dans Caenorhabditis elegans.
Le métabolisme des lipides est un processus physiologique fondamental nécessaire à la santé cellulaire et de l’organisme. Dysregulation du métabolisme des lipides provoque souvent l’obésité et beaucoup de maladies associées comprenant des désordres cardio-vasculaires, le diabète de type II, et le cancer. Pour faire progresser la compréhension actuelle de la régulation métabolique des lipides, les méthodes quantitatives permettant de mesurer avec précision les niveaux de stockage des lipides in vivo dans le temps et l’espace sont devenues de plus en plus importantes et utiles. Les approches traditionnelles pour analyser le stockage des lipides sont semi-quantitatives pour l’évaluation microscopique ou manquent d’informations spatio-temporelles pour la mesure biochimique. La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) est une technologie d’imagerie chimique sans étiquette qui permet une détection rapide et quantitative des lipides dans les cellules vivantes avec une résolution subcellulaire. Comme le contraste est exploité à partir de vibrations moléculaires intrinsèques, la microscopie SRS permet également un suivi quadridimensionnel des lipides chez les animaux vivants. Au cours de la dernière décennie, la microscopie SRS a été largement utilisée pour l’imagerie de petites molécules dans la recherche biomédicale et a surmonté les principales limitations des méthodes conventionnelles de coloration fluorescente et d’extraction lipidique. En laboratoire, nous avons combiné la microscopie SRS avec les outils génétiques et biochimiques disponibles pour le puissant organisme modèle, Caenorhabditis elegans, pour étudier la distribution et l’hétérogénéité des gouttelettes lipidiques à travers différentes cellules et tissus et finalement pour découvrir de nouvelles voies de signalisation conservées qui modulent le métabolisme des lipides. Ici, nous présentons les principes de travail et la configuration détaillée du microscope SRS et fournissons des méthodes pour son utilisation dans la quantification du stockage des lipides à des points de temps de développement distincts de type sauvage et de signalisation de l’insuline mutant déficient C. elegans.
L’obésité est devenue un problème de santé mondial menaçant un tiers de la population mondiale, et elle présente un grave problème médical, étant donné son association avec une mauvaise santé mentale1 et des maladies mortelles dont le diabète2,les maladiescardiovasculaires 3 et certains types de cancer4. L’étude du métabolisme des lipides est essentielle pour mieux comprendre les problèmes biologiques derrière l’obésité. La quantification rapide et spécifique du stockage lipidique implique la détection d’acides gras et de leurs dérivés, ainsi que de métabolites contenant de....
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1. Configuration instrumentale pour la microscopie à diffusion Raman stimulée
REMARQUE: Le système de microscopie SRS est construit sur un laser picoseconde avec oscillateur paramétrique optique intégré à la pompe et un microscope à balayage laser confocal. L’oscillateur fournit deux trains d’impulsions picosecondes, dont un faisceau de Stokes à 1 064 nm et un faisceau de pompe accordable entre 700 et 990 nm. Le chevauchement temporel et spatial des deux faisceaux est réalisé à l’intérieur du laser. Un modulateur électro-optique (MOE) intégré est conçu spécifiquement pour la microscopie SRS. Ce protocole se concentrera sur le couplage du lase....
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La signalisation de l’insuline est une voie endocrinienne importante qui affecte le développement, la reproduction, la durée de vie et le métabolisme. Chez les vers, la signalisation de l’insuline se compose d’environ 40 ligands peptidiques analogues à l’insuline, d’un orthologue de récepteur du facteur de croissance analogue à l’insuline DAF-2, d’une cascade de kinase PI3K /AKT en aval et de l’orthologue du facteur de transcription FoxO, DAF-1620. les mutants daf-2, qui n’ont pas le réce.......
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Pour se défendre contre l’obésité et ses troubles métaboliques associés, d’importants efforts de recherche ont été mis en œuvre pour mieux comprendre les mécanismes de régulation de l’homéostasie lipidique. Pour la détection quantitative des molécules lipidiques dans les échantillons biologiques, l’imagerie sans étiquette par microscopie SRS s’est avérée être une alternative fiable aux tests biochimiques et à d’autres méthodes de coloration. Notre groupe et d’autres ont révélé de nouveaux mécanismes biologiques dans la r.......
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Ce travail a été soutenu par les subventions R01AG045183 (M.C.W.), R01AT009050 (M.C.W.), R01AG062257 (M.C.W.), DP1DK113644 (M.C.W.), March of Dimes Foundation (M.C.W.), Welch Foundation (M.C.W.), et par le chercheur HHMI (M.C.W.). Nous remercions le Caenorhabditis Genetics Center (CGC) pour les souches de C. elegans.
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Convertisseur A/N | Olympus | Unité | |
| Agarose GeneMate | 3119 | Pour la fabrication de tampons d’agarose | |
| Outil d’alignement - adaptateur | Thorlabs | SM1A4 | Pour le montage de l’outil sur la lunette |
| Outil d’alignement - cible | Thorlabs | VRC2SM1 | Pour la visualisation laser IR |
| Outil d’alignement - tube | Thorlabs | SM1L40 | Longueur boîte variateur |
| Autocorrélateur (en option) | APE | pulseCheck | |
| BBP-21.4+ s’il est modulé à 20 MHz ou KR Electronics 2724 s’il est modulé à 8 MHz | Pour le signal avec filtrage de fréquence de modulation | ||
| Câbles | |||
| Microscope de dissection | Nikon | SMZ800 | Pour la manipulation et le crochetage des vers pour l’imagerie |
| Dodécane | Sigma-Aldrich | 44010 | Utilisé pour l’étalonnage du signal SRS |
| Filtre | Chroma Technology | 890/220 CARS | Pour l’élimination du faisceau de Stokes |
| Ruban d’étiquetage de laboratoire à usage général | VWR | 89097 | Pour la fabrication de tampons d’agarose |
| Lamelles en verre | VWR | 48393-106 | Pour couvrir les vers pour l’imagerie |
| Lame de microscope en verre | VWR | 16004-422 | Pour la fabrication de tampons d’agarose |
| Microscope à balayage laser | Olympus | FV3000 | |
| Objectif | Thorlabs | L1 : AC254-050-B L2 : AC254-075-B | Pour l’expanseur de faisceau |
| Amplificateur à verrouillage | Zurich | HF2LI | |
| Minicircuits à filtre passe-bas | BLP-1.9+ | Pour l’alimentation sans bruit | |
| Miroirs | Thorlabs | BB1-E03 | Pour relais et périscope |
| Objectif | Olympus | UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20 | |
| Photodiode | Thorlabs | FDS1010 | |
| Source laser picoseconde | APE | picoEmerald | |
| Alimentation | TEKPOWER | TP1342U | Pour photodiode, tension inversée 50V |
| Azoture de sodium | Sigma | S2002 | Pour l’anesthésie des vers |
| Worm picker | WormStuff | 59-AWP |
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