Article de méthode

Production acellulaire de protéoliposomes pour l’analyse fonctionnelle et le développement d’anticorps ciblant les protéines membranaires

DOI :

10.3791/61871

⸱

22 septembre 2020

 , 
1Graduate School of Medicine, Ehime University, 2Proteo-Science Center, Ehime University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit une méthode efficace sans cellules pour la production de protéoliposomes de haute qualité par dialyse bicouche utilisant un système sans cellules de blé et des liposomes. Cette méthode fournit des moyens appropriés pour l’analyse fonctionnelle des protéines membranaires, le criblage des cibles médicamenteuses et le développement d’anticorps.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les protéines membranaires jouent un rôle essentiel dans une variété de processus cellulaires et remplissent des fonctions vitales. Les protéines membranaires sont médicalement importantes dans la découverte de médicaments, car elles sont la cible de plus de la moitié de tous les médicaments. Un obstacle à la réalisation d’études biochimiques, biophysiques et structurelles des protéines membranaires ainsi que du développement d’anticorps a été la difficulté de produire de grandes quantités de protéines membranaires de haute qualité avec une conformation et une activité correctes. Nous décrivons ici une « méthode de dialyse bicouche » utilisant un système sans cellules germinales de blé, des liposomes et des tasses de dialyse pour synthétiser efficacement les protéines membranaires et préparer des protéoliposomes purifiés en peu de temps avec un taux de réussite élevé. Les protéines membranaires peuvent être produites autant que dans plusieurs milligrammes, telles que les RCPG, les canaux ioniques, les transporteurs et les tétraspanines. Cette méthode acellulaire contribue à réduire le temps, le coût et les efforts nécessaires à la préparation de protéoliposomes de haute qualité et fournit des moyens appropriés pour l’analyse fonctionnelle des protéines membranaires, le criblage de cibles médicamenteuses et le développement d’anticorps.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les protéines membranaires sont l’une des cibles médicamenteuses les plus importantes dans le diagnostic et la thérapeutique. En effet, la moitié des petits médicaments composés ciblés sont des protéines membranaires, telles que les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) et les canaux ioniques1. Au fil des ans, les chercheurs ont travaillé sur des études biochimiques, biophysiques et structurales des protéines membranaires afin d’élucider leur structure et leur fonction 2,3. Le développement d’anticorps monoclonaux dirigés contre les protéines membranaires est également réalisé activement afin d’accélérer les études fonctionnelles et structurelles et de développer des applications thérapeutiques et diagnostiques 4,5,6,7,8,9. Toutes ces études nécessitent une grande quantité de protéines membranaires de haute qualité10. Par exemple, plusieurs milligrammes de protéines membranaires purifiées avec une conformation naturelle sont nécessaires pour le développement d’anticorps. Une quantité beaucoup plus importante de protéines membranaires hautement purifiées est nécessaire pour la cristallographie aux rayons X. Cependant, la production de masse de protéines membranaires reste un goulot d’étranglement dans la recherche sur les protéines membranaires11. Les protéines membranaires ont des structures compliquées avec une ou plusieurs hélices transmembranaires et jouent un rôle important dans l’homéostasie cellulaire. La surexpression hétérologue des protéines membranaires entraîne de multiples obstacles tels que l’agrégation des protéines membranaires qui s’accumulent à des concentrations locales élevées ou la perturbation des voies de signal cellulaire. Même si l’expression est réussie, les étapes ultérieures de la préparation de l’échantillon rencontrent également des difficultés. Par exemple, la préparation du protéoliposome nécessite des compétences de haut niveau et des expériences professionnelles en solubilisation, purification et stabilisation des protéines membranaires, et coûte beaucoup d’efforts et de temps12,13.

D’autre part, certaines technologies de pointe ont émergé au cours des dernières décennies pour produire des protéines sans l’utilisation de cellules vivantes 14,15,16,17,18. La technologie de synthèse des protéines acellulaires reconstitue la réaction de traduction dans un tube à essai. Comme il n’y a pas de limites que le système d’expression cellulaire a, les systèmes acellulaires ont le potentiel de synthétiser une variété de protéines qui sont difficiles à exprimer ou qui montrent une toxicité dans les cellules. L’extrait cellulaire purifié ou la machinerie translationnelle reconstituée est mélangé avec des ARNm modèles, des acides aminés et des sources d’énergie, et les protéines recombinantes sont synthétisées en peu de temps. En ce qui concerne la synthèse des protéines membranaires, certains types d’échafaudages composés de lipides ou d’amphiphiles, tels que les liposomes, les bicelles, les nanodisques ou les copolymères sont ajoutés à la réaction acellulaire 19,20,21,22,23,24. Les protéines membranaires synthétisées interagissent avec les échafaudages et peuvent être stabilisées dans l’eau. Les protéines membranaires synthétisées acellulaires sont largement utilisées dans les études fonctionnelles et la production d’anticorps 25,26,27,28,29,30,31.

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode efficace de production de protéoliposomes sans cellules utilisant un système sans cellules de blé et des liposomes. Le système de synthèse protéique acellulaire du blé est un puissant système de traduction in vitro utilisant l’extrait de germe de blé 15,32,33. Le germe de blé contient une grande quantité de machinerie translationnelle et peu d’inhibiteurs de la traduction. La machinerie translationnelle du blé, un membre des eucaryotes, convient à la traduction des protéines eucaryotes, et son efficacité de traduction n’est guère affectée par l’utilisation du codon de l’ARNm modèle. En utilisant un système sans cellules de blé, nous avons synthétisé une variété de protéines, y compris les protéines kinases 34,35, l’ubiquitine ligases36, les facteurs de transcription37 et les protéines membranaires avec des taux de réussite élevés. Pour la production de protéines membranaires, nous ajoutons le liposome des vésicules lipidiques dans le mélange de traduction sous forme d’échafaudage19,38. Les domaines hydrophobes de la protéine membranaire interagissent avec la bicouche lipidique et sont spontanément intégrés aux liposomes. La centrifugation par gradient de densité est utilisée pour séparer strictement le protéoliposome des protéines endogènes du blé, même si une centrifugation commune du mélange réactionnel de translation est suffisante pour une simple purification du protéoliposome20. De nombreux types de protéines membranaires intégrales ont été synthétisés à l’aide d’un système sans cellules de blé et appliqués pour diverses recherches et développements 25,38,39,40,41,42,43,44. De plus, nous avons développé la « méthode de dialyse bicouche » pour la production à grande échelle45,46. Dans cette méthode, un dispositif de dialyse de type tasse est immergé dans le tampon d’alimentation du substrat, et deux couches de mélange de réaction de translation et de tampon d’alimentation de substrat sont formées dans la tasse, comme illustré à la figure 1. L’approvisionnement continu en substrats et l’élimination du sous-produit peuvent être effectués efficacement en haut et en bas du mélange réactionnel pendant une longue période, ce qui conduit à une excellente efficacité de traduction (Figure 2A et Figure 2B)45.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Préparation du plasmide d’expression pEU

REMARQUE : le plasmide d’expression pEU doit inclure le codon de départ, le cadre de lecture ouvert de la protéine membranaire cible et le codon stop dans le fragment (voir Figure 1). Ajouter une ou plusieurs séquences d’étiquettes de détection/purification à l’endroit approprié au besoin. La digestion enzymatique de restriction ou le clonage continu est applicable au sous-clonage. Nous décrivons ici un protocole utilisant une méthode de clonage transparente.

  1. Préparez insérer un fragment d’ADN.
    1. Amplifier le gène d’intérêt par PCR en utilisant la matrice d’ADNc, l’amorce 1 et l’amorce 2. L’amorce 1 et l’amorce 2 contiennent des chevauchements de 15 pb pour un clonage homogène, respectivement (voir le tableau des matières).
      REMARQUE : N’incluez pas les séquences à traiter et à éliminer des protéines matures dans les cellules (p. ex., séquence du signal). Le traitement des protéines synthétisées n’est pas effectué dans un système sans cellules de blé. N’ajoutez pas de séquence Kozak. Le vecteur pEU-E01-MCS possède un amplificateur de traduction E01.
    2. Ajouter 1/25 volume d’enzyme de restriction DpnI au produit PCR pour éliminer l’ADN plasmidique modèle. Incuber pendant 30 min à 37 °C.
    3. Utilisez un kit de purification PCR pour purifier le produit PCR et ajuster la concentration à 20-50 ng / μL.
  2. Linearize pEU-E01-MCS vectoriel.
    1. Effectuer la PCR inverse à l’aide de pEU-E01-MCS, amorce 3 et amorce 4.
    2. Ajouter 1/25 volume d’enzyme de restriction DpnI au produit de PCR inverse. Incuber pendant 30 min à 37 °C.
    3. Utilisez un kit de purification PCR pour purifier le produit PCR selon les recommandations du fabricant. Ajuster la concentration à 20–50 ng/μL.
  3. Mélanger 2 μL de fragment d’ADN inséré, 2 μL de vecteur linéarisé et 4 μL de 2x mélange d’enzymes de clonage sans soudure.
  4. Transformez la souche JM109 d’Escherichia coli avec le produit de clonage sans soudure. À l’aide d’un épandeur, étaler la suspension bactérienne sur une plaque de gélose LB-ampicilline.
    REMARQUE: Le vecteur pEU a un marqueur de résistance à l’ampicilline.
  5. Confirmer la séquence du plasmide d’expression construit à l’aide de l’amorce 5 et de l’amorce 6 du côté 5' et 3' du MCS dans le plasmide pEU, respectivement.
  6. Amplifier et purifier les plasmides d’expression.
    1. Culture de la souche JM109 d’E. coli transformée en plasmide dans 150 mL de milieu LB-ampicilline à 37 °C et 125 coups par minute en agitant pendant la nuit.
    2. Extraire et purifier les plasmides à l’aide d’un kit midi de préparation de plasmide disponible dans le commerce. Dissoudre les plasmides dans 500 μL de tampon TE.
      ATTENTION : N’utilisez pas de mini kit de préparation pour l’extraction plasmidique. Il ne fournit pas une qualité et une quantité suffisantes de plasmide.
    3. Ajouter 500 μL d’alcool phénol/chloroforme/isoamylique (25:24:1). Mélanger vigoureusement pendant 5 min, et centrifuger pendant 5 min à 17 800 x g et à température ambiante. Transférer la solution plasmidique supérieure dans un nouveau tube.
      ATTENTION : Portez des gants jetables pour protéger la peau du phénol et du chloroforme.
      REMARQUE: Afin d’éliminer la contamination de la RNase du kit d’extraction plasmidique, purifier les plasmides en utilisant la purification phénol-chloroforme.
    4. Ajouter 500 μL de chloroforme pour éliminer complètement le phénol. Mélanger vigoureusement pendant 5 min, et centrifuger pendant 5 min à 17 800 x g et à température ambiante. Transférer la solution plasmidique supérieure dans un nouveau tube.
    5. Ajouter 2,5 volume d’éthanol et 1/8 volume d’acétate d’ammonium 7,5 M et conserver à -30 °C pendant 1 h.
    6. Centrifuger à 17 800 x g à 4 °C pendant 10 min. Lavez la pastille avec 500 μL d’éthanol à 70 %. Retirer délicatement le surnageant et laisser sécher la pastille pendant 5 minutes.
    7. Dissoudre complètement les plasmides d’expression dans 100 μL d’eau ultrapure. Mesurer la concentration de plasmides avec une absorbance à 260 nm. Ajuster la concentration à 1 mg/mL.

2. Transcription in vitro

ATTENTION : Utilisez des tubes et des embouts en plastique sans DNase et sans nucléase dans les étapes de transcription et de traduction. Évitez d’autoclaver les articles en plastique pour éviter toute contamination.

  1. Récoltez de l’eau ultrapure dans un nouveau tube en plastique.
    ATTENTION : N’utilisez pas d’eau traitée au DEPC car le DEPC résiduel inhibe fortement la réaction. Utilisez de l’eau ultrapure fraîchement purifiée pour la transcription et la traduction.
  2. Préparer le mélange réactionnel de transcription en mélangeant 115,2 μL d’eau ultrapure, 40 μL de tampon de transcription LM, 20 μL de mélange NTP, 2,4 μL d’inhibiteur de RNase 80 U/μL, 2,4 μL de 80 U/μL SP6 polymérase et 20 μL de plasmides d’expression pEU de 1 mg/mL. Mélanger doucement les réactifs en les retournant. Effectuez un tour rapide.
  3. Incuber la réaction de transcription à 37 °C pendant 6 h.
  4. Mélangez doucement la réaction en inversant et tournez rapidement vers le bas. Utilisez-le immédiatement pour la traduction, sinon congelez-le et conservez-le à -80 °C.
  5. Confirmer le produit de transcription par électrophorèse.
    1. Mélanger 100 mL de 1x tampon TAE et 1 g d’agarose. Chauffer la suspension dans un four à micro-ondes pour préparer le gel TAE d’agarose à 1%.
    2. Prendre 1 μL de réaction de transcription et mélanger avec 3 μL d’eau et 4 μL de colorant de charge 2x.
      REMARQUE: La dénaturation de l’ARN n’est pas nécessaire.
    3. Charger 4 μL du mélange et 2 μL de marqueur d’échelle d’ADN sur le gel TAE d’agarose.
    4. Électrophorèse à 100 V pendant 20 min.
    5. Colorer le gel dans du bromure d’éthidium pendant 30 min. Vérifiez le diagramme de bande d’échelle de l’ARNm à l’aide d’un transilluminateur UV et d’un imageur de gel.
      NOTE: Lorsqu’une bande tachée de moins de 500 pb est observée, une dégradation de l’ARNm est suspectée.

3. Préparation des documents à traduire

  1. Préparez le tampon de traduction.
    1. Mélanger 27 mL d’eau ultrapure fraîchement préparée et 0,75 mL de chaque solution mère 40x pour S1, S2, S3 et S4, respectivement dans un tube de 50 mL.
      REMARQUE: Modulez les quantités de matériaux en fonction de la quantité finale requise de tampon de traduction 1x.
      ATTENTION : Ne conservez pas ou ne recongelez pas l’excès de tampon de traduction 1x après utilisation.
  2. Préparer la solution mère de créatine kinase. Dissoudre la créatine kinase lyophilisée dans de l’eau ultrapure jusqu’à une concentration finale de 20 mg/mL. Distribuer la solution en petites quantités (10 à 50 μL chacun) dans des tubes PCR à 8 bandes de 0,2 mL. Congeler les tubes dans de l’azote liquide et conserver à -80 °C.
    ATTENTION : Ne pas recongeler la solution de créatine kinase après la décongélation.
  3. Lavez les gobelets de dialyse (format 0,1 mL) pour éliminer le glycérol de la membrane de dialyse.
    REMARQUE: Il existe plusieurs tasses de dialyse de différentes tailles. Des gobelets de petite taille (0,1 mL) sont utilisés pour les essais à petite échelle (section 5.4) et des gobelets de grande taille (2 mL) pour la production à grande échelle (section 5.5), respectivement. L’étape de lavage de la membrane de dialyse des tasses de grande taille est évitable.
    1. Mettez 1 mL d’eau ultrapure dans un nouveau tube de 1,5 mL. Insérez une tasse de dialyse de petite taille (0,1 ml) dans le tube. Ajouter 0,5 ml d’eau ultrapure dans la tasse.
    2. Incuber pendant plus de 30 min à température ambiante.

4. Préparation des liposomes

NOTE: Nous décrivons ici deux protocoles pour la préparation des liposomes. L’un utilise des liposomes lyophilisés prêts à l’emploi (rubrique 4.1), tandis que l’autre produit des liposomes en hydratant un film lipidique mince (rubrique 4.2).

  1. Préparer les liposomes en utilisant des liposomes lyophilisés.
    REMARQUE: Un moyen plus facile de produire du protéoliposome est d’utiliser un liposome d’asolectine disponible dans le commerce. L’asolectine est une sorte de lipide naturel extrait du soja.
    1. Ouvrez le flacon contenant 10 mg de liposomes d’asolectine lyophilisés (voir le tableau des matières) et ajoutez 200 μL de tampon de traduction (rubrique 3.1) au fond du flacon. Sceller le flacon et incuber pendant 10 min.
    2. Mélanger vigoureusement en mettant le flacon sur le mélangeur vortex pendant 1 min.
    3. Insérez le flacon dans un tube de 50 mL. Faire tourner le tube en centrifugeant à 500 x g pendant 1 min.
    4. À l’aide d’une pipette, transférer la suspension de liposomes d’asolectine (50 mg de lipides/mL) dans un nouveau tube de 1,5 mL. Utilisez immédiatement le liposome pour la traduction, sinon congelez dans de l’azote liquide et conservez-le à -80 °C.
  2. Préparez les liposomes en hydratant un mince film lipidique.
    1. Si un lipide est vendu sous forme de poudre, dissoudre dans du chloroforme ou un solvant organique approprié à une concentration de 10 à 100 mg/mL.
      NOTE: Un film lipidique mince peut être préparé en utilisant des lipides amphiphiles purifiés et / ou synthétisés. La méthode de purification de l’asolectine est décrite précédemment38. Des lipides fonctionnellement modifiés, tels que les lipides biotinylés, les lipides fluorescents et les lipides adjuvants, peuvent être ajoutés aux lipides basaux pour produire des liposomes fonctionnels.
    2. Transvaser la solution lipidique contenant 50 mg de lipide(s) dans une fiole d’évaporation.
    3. À l’aide d’un évaporateur rotatif, évaporer le solvant et répartir uniformément le lipide sur la paroi du fond du ballon pour former une fine pellicule de lipides.
    4. Mettre la fiole dans un dessiccateur sous vide et laisser sous pression négative pendant une nuit pour éliminer complètement le solvant.
    5. Ajouter 1 mL de tampon de translation dans la fiole d’évaporation. Faire pivoter la fiole pour étaler le tampon sur le film lipidique mince. Incuber pendant 5 min pour hydrater le film.
    6. Soniquer le ballon avec un homogénéisateur à ultrasons ou un nettoyeur à ultrasons. Modifier l’angle de la fiole de temps en temps pour permettre à la solution de toucher complètement le film. Assurez-vous que le film lipidique mince est pelé par le bas et émulsionné de manière complète et homogène.
      NOTE: La micrographie électronique des lipides biotinylés contenant des liposomes est illustrée à la figure 1.
    7. Transférer la suspension de liposomes (50 mg de lipides/mL) dans un nouveau tube de 1,5 mL. S’il ne doit pas être utilisé immédiatement, congeler les liposomes dans de l’azote liquide et conserver à -80 °C.

5. Traduction in vitro

  1. Décongeler rapidement l’extrait de germe de blé en faisant flotter les tubes sur de l’eau à température ambiante pendant quelques minutes. Après la décongélation, mélanger immédiatement doucement en retournant les tubes, tourner vers le bas et refroidir sur la glace jusqu’à utilisation.
    NOTE: Congeler l’extrait de germe de blé dans de l’azote liquide après utilisation et conserver à -80 °C. Il résiste à plusieurs cycles de gel/dégel.
  2. Décongeler 20 mg/mL de solution mère de créatine kinase. Mélanger 5 μL de solution mère et 45 μL de tampon de traduction pour préparer une solution de travail de créatine kinase à 2 mg/mL.
    ATTENTION : La recongélation de la créatine kinase n’est pas recommandée.
  3. Décongeler les liposomes ou les ARNm au besoin.
  4. Effectuer une traduction de protéines à petite échelle.
    1. Retirer l’eau du tube et de la tasse de dialyse (0,1 mL), tel que préparé à l’étape 3.3.2.
    2. Injecter 1 mL et 300 μL de tampon de traduction dans le tube et la tasse de dialyse, respectivement.
      ATTENTION : Si le fond de la tasse de dialyse n’atteint pas la surface du tampon de translation dans le tube de 1,5 mL, injectez 50 à 100 μL supplémentaires de tampon dans le tube.
    3. Préparer le mélange réactionnel de translation en mélangeant 15,6 μL de tampon de traduction, 2,4 μL de créatine kinase à 2 mg/mL, 12 μL de liposomes à 50 mg/mL, 15 μL d’extrait de germe de blé et 15 μL d’ARNm. Mélanger doucement en inversant les tubes et tourner vers le bas.
    4. Aspirer 60 μL du mélange de réaction de translation à l’aide d’une pipette de 200 μL.
    5. Insérez l’embout de la pipette dans la surface inférieure du tampon de translation dans la cuvette de dialyse. Éjecter à la pipette le mélange réactionnel lentement et doucement. Couvrir la tasse de dialyse avec un couvercle pour éviter l’évaporation.
      REMARQUE: Le mélange réactionnel coule naturellement au fond de la tasse et forme une bicouche. Ne dérangez pas la bicouche en mélangeant ou en secouant la tasse.
  5. Effectuez une traduction à grande échelle (Figure 1).
    1. Verser 22 mL de tampon de translation dans un tube de 25 mL. Insérez une tasse de dialyse de grande taille (2 ml) dans le tube et ajoutez 2 ml de tampon de traduction dans la tasse.
    2. Préparer un mélange réactionnel de translation en mélangeant 130 μL de tampon de traduction, 20 μL de créatine kinase à 2 mg/mL, 100 μL de liposomes à 50 mg/mL, 125 μL d’extrait de germe de blé et 125 μL d’ARNm. Mélanger doucement par pipetage.
    3. Aspirer tout le mélange de réaction de translation (500 μL) à l’aide d’une pipette de 1 000 μL. Injecter le mélange de réaction de translation dans la coupelle de dialyse de la même manière que celle décrite à l’étape 5.4.5. Couvrir la tasse de dialyse avec un couvercle pour éviter l’évaporation.
  6. Incuber les réactions à 15 °C pendant 24 h.
  7. Bien mélanger la réaction dans la tasse de dialyse en pipetant. Transférer la suspension brute de protéoliposomes dans un nouveau tube.
    REMARQUE : Un tube à fond plat de 1,5 mL est recommandé pour recueillir le protéoliposome à partir de la traduction à petite échelle. Après centrifugation, les liposomes forment des pastilles compactes et facilement visibles sur le coin inférieur du tube.

6. Purification des protéoliposomes

  1. Centrifuger le tube contenant la suspension brute de protéoliposomes à 17 800 x g à 4 °C pendant 10 min.
  2. Retirez le surnageant. Suspendre la pastille de protéoliposome dans du PBS (petite échelle : 1 mL, grande échelle : 10 mL) par pipetage.
  3. Répétez la centrifugation et le lavage des protéoliposomes pour deux autres cercles.
  4. Après le lavage, ajouter une petite quantité de PBS et bien remettre en suspension la pastille de protéoliposome par pipetage. Mesurer le volume de suspension à l’aide d’une micropipette. Ajouter du PBS pour ajuster le volume à 60 μL (petite échelle) ou 500 μL (grande échelle). Transférer la suspension dans un nouveau tube de 1,5 mL.
  5. Transférer 10 μL de suspension de protéoliposomes dans un nouveau tube PCR pour SDS-PAGE. Diviser le reste des échantillons en plus petites portions pour les utiliser au besoin. Congeler dans de l’azote liquide et conserver à -80 °C.

7. FDS-PAGE et coloration CBB

  1. Ajouter 70 μL d’eau et 40 μL de tampon d’échantillon SDS-PAGE 3x à 10 μL de suspension de protéoliposome.
    ATTENTION : Ne pas faire bouillir l’échantillon SDS-PAGE, car les protéines membranaires s’agrègent et pénètrent à peine dans le gel d’acrylamide en électrophorèse. De plus, ajouter suffisamment d’agent réducteur au tampon d’échantillon SDS-PAGE (p. ex. 2-mercaptoéthanol à 3 % de concentration finale) pour prévenir l’oxydation.
  2. Réglez un gel SDS-PAGE à gradient de 5 % à 20 % dans une chambre d’électrophorèse. Charge 3 μL, 6 μL, 12 μL d’échantillons de protéoliposomes, 2 μL de marqueur de taille de protéine et série standard BSA.
  3. Électrophorèse à 52 mA, 400 V pendant 30 min.
  4. Colorer le gel avec du colorant CBB pendant 1 h. Décolorer dans l’eau chaude et scanner l’image du gel.
  5. À l’aide du logiciel NIH Image J (https://imagej.nih.gov/ij/), quantifier l’intensité de la bande de protéines membranaires dans chaque voie. Estimer la quantité de protéines membranaires synthétisées avec la série standard BSA.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En utilisant ce protocole, des protéoliposomes partiellement purifiés peuvent être obtenus en peu de temps. Des résultats représentatifs sont présentés à la figure 2A. Vingt-cinq RCPG de classe A, B et C ont été synthétisés avec succès en utilisant la méthode de dialyse bicouche (à petite échelle) et partiellement purifiés par centrifugation et lavage tampon. Bien que la quantité de protéines synthétisées varie selon le type de protéine, 50 à 400 μg de protéines membranaires peuvent générale...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole présenté fournit une méthode de production de protéines membranaires à un taux de réussite élevé. Ce protocole est simple, hautement reproductible et facile à mettre à l’échelle. Il a également le potentiel de réduire le temps et le coût des expériences qui consomment une grande quantité de protéines membranaires. La méthode de dialyse bicouche améliore la productivité de 4 à 10 fois par rapport à la méthode bicouche ou à la méthode de dialyse (Figure 2B)45

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette recherche a été soutenue par Platform Project for Supporting Drug Discovery and Life Science Research (Basis for Supporting Innovative Drug Discovery and Life Science Research (BINDS)) de l’AMED sous le numéro de subvention JP20am0101077. Ce travail a également été partiellement soutenu par JSPS KAKENHI Grant Number 20K05709.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
& fois ; 3 TamponContenant 10 % de 2-mercaptoéthanol
5-20 % de gradient SDS-PAGE gelATTOE-D520L
70 % d’éthanolÉthanol dilué par de l’eau ultrapure.
AgaroseTakara Bio
Ammonium acétateNakalai tesque02406-95Comme ce réactif est déliquescent, dissolvez-le entièrement dans l’eau une fois ouvert et stockez-le à -30° ;C.
Ampicilline sodiqueNakalai tesque02739-74
Liposome d’asolectine, lyophiliséCellFree SciencesCFS-PLE-ASLUn flacon contient 10 mg de liposomes lyophilisés.
BSA standard1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 & micro ; L & fois ; 1 tampon d’échantillon SDS-PAGE
de gel CBB
Clone d’ADNc d’intérêtPlasmide hébergeant un clone d’ADNc ou un fragment d’ADN synthétique
ChloroformeNakalai tesque08402-84
IncubateurTempérature allant de 0 à 40 ° ; C ou plus large.
Créatine kinaseRoche Diagnostics04524977190
Gobelet de dialyse (0,1 mL)Thermo Fisher Scientific69570Slide-A-Lyzer MINI Appareil de dialyse, 10K MWCO, 0,1 mL
Gobelet de dialyse (2 mL)Thermo Fisher Scientific88404Slide-A-Lyzer MINI Appareil de dialyse, 10K MWCO, 2 mL
Marqueur d’échelle d’ADNThermo Fisher ScientificSM0311GeneRuler 1 kb ADN Ladder
DpnIThermo Fisher ScientificFD1703FastDigest DpnI
E. coli strain JM109
Chambre d’électrophorèseATTO
Ethanol (99.5 %)Nakalai tesque14713-95
Bromure d’éthylium
Flacon d’évaporation, 100 mL
Imageur
ScannerNous utilisons un scanner de documents et un immuniseur LED comme substitut.
Bouillon
Lipides d’intérêtAvanti Polar Lipids
Micro centrifugeuseTOMYMX-307
NTP mixCellFree SciencesCFS-TSC-NTPMélange d’ATP, GTP, CTP, UTP, à 25 mM chacun
Tube de 25 mL sans nucléaseIWAKI362-025-MYP
Tubes en plastique sans plisWatson bio labsNe pas autoclave. Utilisez-les séparément des autres expériences.
Pointes sans plisWatson bio labsNe pas autoclave. Utilisez-les séparément des autres expériences.
PBS
KIT DE PURIFICATION PCRMACHEREY-NAGEL740609NucleoSpin Gel et PCR Nettoyage
vecteur pEU-E01-MCS CellFreeSciencesCFS-11
Phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25:24:1)Nippon Gene311-90151
Préparation de plasmide Kit MidiMACHEREY-NAGEL740410NucleoBond Xtra Midi
Amorce 1Thermo Fisher ScientificSynthèse d’oligo-éléments personnalisée5'-CCAAGATATCACTAGnn-3'
Amorce spécifique au gène, avant. La majuscule indique la séquence de chevauchement à ajouter pour un clonage sans faille. Minuscules nnnn&hellip ;. (20-30 pb) montre une séquence spécifique du gène.
Amorce 2Thermo Fisher ScientificSynthèse d’oligo-éléments personnalisée5'-CCATGGGACGTCGACnn-3'
Amorce spécifique au gène, inversé. La majuscule indique la séquence de chevauchement à ajouter pour un clonage sans faille. Minuscules nnnn&hellip ;. (20-30 pb) montre une séquence spécifique du gène.
Amorce 3Thermo Fisher ScientificSynthèse d’oligo-nucléotides personnalisée5'-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3'
Amorce directe pour la linéarisation vectorielle. Le soulignement fonctionne comme un chevauchement dans le clonage transparent.
Amorce 4Thermo Fisher ScientificSynthèse d’oligo-synthèse personnalisée5'-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3'
Amorce inverse pour linéarisation vectorielle. Le soulignement fonctionne comme un chevauchement dans le clonage transparent.
Amorce 5Thermo Fisher ScientificSynthèse d’oligo personnalisée5'-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3'
Amorce de séquençage, amorce avant
6Thermo Fisher ScientificSynthèse d’oligo-éléments personnalisée5'- CCTGCGCTGGGAGATAAAC-3'
Amorce de séquençage, inverse
Marqueur de taille de protéineBio-Rad1610394Precision Plus Protein Standard
Évaporateur
mélange d’enzymes de clonage sans soudureNew England BioLabsE2611LGibson Assembly Master Mix
D’autres réactifs de clonage sans soudure sont également disponibles.
SP6 ARN polymérase & Inhibiteur de RNaseCellFree SciencesCFS-TSC-ENZ
d’électrophorèse sous-marin
Tampon TAE Tampon
transcription LMCellFree SciencesCFS-TSC-5TB-LM
Tampon de traductionCellFree SciencesCFS-SUB-SGCSUB-AMIX SGC (× ; 40) solution mère (S1, S2, S3, S4).
Préparer & fois ; 1 tampon de traduction avant utilisation en mélangeant le stock S1, S2, S3, S4 et l’eau ultrapure.
EauNous vous recommandons de préparer de l’eau ultrapure en utilisant un système de production d’eau ultrapure à chaque fois que vous faites des expériences. Ne pas autoclave.
Nous préparons de l’eau ultrapure en utilisant Milli-Q Reference et le système Elix10.
L’eau sans nucléase disponible dans le commerce (pas l’eau traitée au DEPC) peut être utilisée comme substitut. Prenez soin de la contamination après avoir ouvert la bouteille.
L’homogénéisateur à ultrasonsBransonSONIFIER modèle 450D-AdvancedNettoyeur à ultrasons peut être utilisé comme substitut.
Transilluminateur
Dessiccateur
Extrait de germe de bléCellFree SciencesCFS-WGE-7240WEPRO7240
d’échantillonnage SDS-PAGE Coloration refroidi gel gel LBTampon rotatifSystème de ultrapure UVsous vide

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
  2. Gusach, A., et al. Beyond structure: emerging approaches to study GPCR dynamics. Current Opinion in Structural Biology. 63, 18-25 (2020).
  3. Congreve, M., de Graaf, C., Swain, N. A., Tate, C. G. Impact of GPCR Structures on Drug Discovery. Cell. 181 (1), 81-91 (2020).
  4. Wilkinson, T. C. I. Discovery of functional monoclonal antibodies targeting G-protein-coupled receptors and ion channels. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 831-837 (2016).
  5. Hino, T., Iwata, S., Murata, T. Generation of functional antibodies for mammalian membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 23 (4), 563-568 (2013).
  6. Webb, D. R., Handel, T. M., Kretz-Rommel, A., Stevens, R. C. Opportunities for functional selectivity in GPCR antibodies. Biochemical Pharmacology. 85 (2), 147-152 (2013).
  7. Douthwaite, J. A., Finch, D. K., Mustelin, T., Wilkinson, T. C. I. Development of therapeutic antibodies to G-protein coupled receptors and ion channels: Opportunities, challenges and their therapeutic potential in respiratory diseases. Pharmacology and Therapeutics. 169, 113-123 (2016).
  8. Hashimoto, Y., Yagi, K., Kondoh, M. Current progress in a second-generation claudin binder, anti-claudin antibody, for clinical applications. Drug Discovery Today. 21 (10), 1711-1718 (2016).
  9. Hutchings, C. J., Colussi, P., Clark, T. G. Ion channels as therapeutic antibody targets. mAbs. 11 (2), 265-296 (2019).
  10. Errey, J. C., Fiez-Vandal, C. Production of membrane proteins in industry: The example of GPCRs. Protein Expression and Purification. 169, 105569(2020).
  11. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  12. Wiseman, D. N., et al. Expression and purification of recombinant G protein-coupled receptors: a review. Protein Expression and Purification. 167, 105524(2020).
  13. Jeffery, C. J. Expression, Solubilization, and Purification of Bacterial Membrane Proteins. Current Protocols in Protein Science. 83 (1), 1-15 (2016).
  14. Spirin, A. S., Baranov, V. I., Ryabova, L. A., Ovodov, S. Y., Alakhov, Y. B. A continuous cell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield. Science. 242 (4882), 1162-1164 (1988).
  15. Takai, K., Sawasaki, T., Endo, Y. Practical cell-free protein synthesis system using purified wheat embryos. Nature Protocols. 5 (2), 227-238 (2010).
  16. Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
  17. Shimizu, Y., Kuruma, Y., Ying, B. W., Umekage, S., Ueda, T. Cell-free translation systems for protein engineering. The FEBS Journal. 273 (18), 4133-4140 (2006).
  18. Klammt, C., et al. Cell-free expression as an emerging technique for the large scale production of integral membrane protein. The FEBS Journal. 273 (18), 4141-4153 (2006).
  19. Nozawa, A., et al. A cell-free translation and proteoliposome reconstitution system for functional analysis of plant solute transporters. Plant and Cell Physiology. 48 (12), 1815-1820 (2007).
  20. Nozawa, A., et al. Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system. BMC Biotechnology. 11 (1), 35-45 (2011).
  21. Henrich, E., Hein, C., Dotsch, V., Bernhard, F. Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates. FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).
  22. Henrich, E., Peetz, O., et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife. 6, 243(2017).
  23. Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins. Frontiers in Pharmacology. 10, 744(2019).
  24. Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).
  25. Sackin, H., Nanazashvili, M., Makino, S. I. Direct injection of cell-free Kir1.1 protein into Xenopus oocytes replicates single-channel currents derived from Kir1.1 mRNA. Channels. 9 (4), 196-199 (2015).
  26. Zemella, A., Richter, T., Thoring, L., Kubick, S. A combined cell-free protein synthesis and fluorescence-based approach to investigate GPCR binding properties. Methods in Molecular Biology. 1947 (10), 57-77 (2019).
  27. Vaish, A., Guo, S., Murray, R. M., Grandsard, P. J., Chen, Q. On-chip membrane protein cell-free expression enables development of a direct binding assay: A curious case of potassium channel KcsA-Kv1.3. Analytical Biochemistry. 556, 70-77 (2018).
  28. Suzuki, Y., et al. Functional G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) synthesis: the pharmacological analysis of Human Histamine H1 Receptor (HRH1) synthesized by a wheat germ cell-free protein synthesis system combined with asolectin glycerosomes. Frontiers in Pharmacology. 9, 38(2018).
  29. Cortes, S., Barette, C., Beroud, R., De Waard, M., Schaack, B. Functional characterization of cell-free expressed Kv1.3 channel using a voltage-sensitive fluorescent dye. Protein Expression and Purification. 145, 94-99 (2018).
  30. Woznicka-Misaila, A., Juillan-Binard, C., Baud, D., Pebay-Peyroula, E., Ravaud, S. Cell-free production, purification and characterization of human mitochondrial ADP/ATP carriers. Protein Expression and Purification. 144, 46-54 (2018).
  31. Hashimoto, Y., et al. Engineered membrane protein antigens successfully induce antibodies against extracellular regions of claudin-5. Scientific Reports. 8 (1), 8383(2018).
  32. Sawasaki, T., et al. A bilayer cell-free protein synthesis system for high-throughput screening of gene products. FEBS Letters. 514 (1), 102-105 (2002).
  33. Goshima, N., et al. Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome. Nature Methods. 5 (12), 1011-1017 (2008).
  34. Nemoto, K., Takemori, N., Seki, M., Shinozaki, K., Sawasaki, T. Members of the plant CRK superfamily are capable of trans- and autophosphorylation of tyrosine residues. The Journal of Biological Chemistry. 290 (27), 16665-16677 (2015).
  35. Takeda, H., et al. Comparative analysis of human src-family kinase substrate specificity in vitro. Journal of Proteome Research. 9 (11), 5982-5993 (2010).
  36. Takahashi, H., et al. Establishment of a wheat cell-free synthesized protein array containing 250 human and mouse E3 ubiquitin ligases to identify novel interaction between E3 ligases and substrate proteins. PLoS One. 11 (6), 0156718(2016).
  37. Nozawa, A., et al. Construction of a protein library of Arabidopsis transcription factors using a wheat cell-free protein production system and its application for DNA binding analysis. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (7), 1661-1664 (2009).
  38. Goren, M. A., Nozawa, A., Makino, S. I., Wrobel, R. L., Fox, B. G. Cell-free translation of integral membrane proteins into unilamelar liposomes. Methods in Enzymology. 463, 647-673 (2009).
  39. Nozawa, A., et al. Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system. BMC Biotechnology. 11 (1), 35(2011).
  40. Renauld, S., et al. Functional reconstitution of cell-free synthesized purified Kv channels. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1859 (12), 2373-2380 (2017).
  41. Liu, S., et al. Efficiency and Safety of CRAC Inhibitors in Human Rheumatoid Arthritis Xenograft Models. Journal of Immunology. 199 (5), 1584-1595 (2017).
  42. Jarecki, B. W., Makino, S. I., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. Function of shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into xenopus oocytes. Scientific Reports. 3, 1-7 (2013).
  43. David, G., et al. Phosphorylation and alternative translation on wheat germ cell-free protein synthesis of the DHBV large envelope protein. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 138(2019).
  44. Jirasko, V., et al. Proton-detected solid-state NMR of the cell-free synthesized α-helical transmembrane protein NS4B from hepatitis C virus. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 21 (10), 1453-1460 (2020).
  45. Takeda, H., et al. Production of monoclonal antibodies against GPCR using cell-free synthesized GPCR antigen and biotinylated liposome-based interaction assay. Scientific Reports. 5, 11333(2015).
  46. Zhou, W., Takeda, H. Production of immunizing antigen proteoliposome using cell-free protein synthesis system. Methods in Molecular Biology. 1868, Clifton, N.J. 49-67 (2018).
  47. Hutchings, C. J., Koglin, M., Marshall, F. H. Therapeutic antibodies directed at G protein-coupled receptors. mAbs. 2 (6), 594-606 (2010).
  48. Raetz, C. R. H., et al. Discovery of new biosynthetic pathways: the lipid A story. Journal of Lipid Research. 50, 103-108 (2009).
  49. Baldridge, J. R., Crane, R. T. Monophosphoryl lipid A (MPL) formulations for the next generation of vaccines. Methods. 19 (1), 103-107 (1999).

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Synth se prot ique acellulaireProduction de prot ines membranairesPr paration de prot oliposomesM thode de dialyse bilayerSyst me de germe de blFormation de liposomesAnalyse par SDS PAGEPurification par centrifugation

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