Article de méthode

Procédures de transplantation de moelle osseuse chez la souris pour étudier l’hématopoïèse clonale

DOI :

10.3791/61875

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26 mai 2021

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1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia School of Medicine, 2Department of Cardiology, Xinqiao Hospital, Army Medical University, 3Department of Cardiology, Osaka City University Graduate School of Medicine, 4Hematovascular Biology Center, Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons trois méthodes de transplantation de moelle (BMT) : BMT avec l’irradiation de tout-corps, BMT avec l’irradiation blindée, et méthode de BMT sans le pré-conditionnement (BMT adoptif) pour l’étude de l’hématopoïèse clonale dans des modèles murins.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’hématopoïèse clonale est une affection associée à l’âge répandue qui résulte de l’accumulation de mutations somatiques dans les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPCs). Les mutations dans les gènes conducteurs, qui confèrent la forme physique cellulaire, peuvent conduire au développement de clones de HSPC en expansion qui donnent de plus en plus lieu à des leucocytes de descendance hébergeant la mutation somatique. Puisque l’hématopoïèse clonale a été associée aux maladies cardiaques, aux accidents vasculaires cérébraux, et à la mortalité, le développement des systèmes expérimentaux qui modélisent ces processus est essentiel pour comprendre les mécanismes qui sous-ensivent ce nouveau facteur de risque. Des procédures de transplantation de moelle impliquant le conditionnement myéloablatif chez la souris, telles que l’irradiation de corps entier (TBI), sont couramment employées pour étudier le rôle des cellules immunitaires dans les maladies cardio-vasculaires. Cependant, des dommages simultanés à la niche de moelle osseuse et à d’autres sites d’intérêt, tels que le cœur et le cerveau, sont inévitables avec ces procédures. Ainsi, notre laboratoire a développé deux méthodes alternatives pour minimiser ou éviter les effets secondaires possibles causés par TBI : 1) la transplantation de moelle avec blindage d’irradiation et 2) BMT adoptive aux souris non conditionnées. Dans les organes blindés, l’environnement local est préservé permettant l’analyse de l’hématopoïèse clonale tandis que la fonction des cellules immunitaires résidentes est intacte. En revanche, le BMT adoptif aux souris non conditionnées a l’avantage supplémentaire que les environnements locaux des organes et la niche hématopoïétique sont préservés. Ici, nous comparons trois différentes approches de reconstitution de cellules hématopoïétiques et discutons de leurs forces et limites pour des études de l’hématopoïèse clonale dans les maladies cardio-vasculaires.

Introduction

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L’hématopoïèse clonale (CH) est une condition qui est fréquemment observée chez les personnes âgées et se produit à la suite d’un clone de tige et de cellule progéniteur hématopoïétique élargie (HSPC) portant une mutation génétique1. On lui a suggéré qu’à l’âge de 50, la plupart des individus auront acquis une moyenne de cinq mutations exoniques dans chaque HSPC2, mais la plupart de ces mutations auront comme conséquence peu ou pas de conséquences phénotypiques à l’individu. Cependant, si par hasard l’une de ces mutations confère un avantage concurrentiel au HSPC, par exemple en favorisant sa prolifération, son auto-renouvellement, sa survie ou une combinaison de ceux-ci, cela peut conduire à l’expansion préférentielle du clone mutant par rapport aux autres HSPCs. En conséquence, la mutation se propagera de plus en plus à travers le système hématopoïétique car le HSPC muté donne naissance à des cellules sanguines matures, conduisant à une population distincte de cellules mutées dans le sang périphérique. Alors que des mutations dans des dizaines de gènes pilotes candidats différents ont été associées à des événements clonaux dans le système hématopoïétique, parmi ceux-ci, les mutations dans l’ADN méthyltransférase 3 alpha (DNMT3A) et dix onze translocation 2 (TET2) sont les plus répandues3. Plusieurs études épidémiologiques ont révélé que les personnes porteuses de ces mutations génétiques présentent un risque significativement plus élevé de maladies cardiovasculaires (MCV), d’accidents vasculaires cérébraux et de mortalité entièrement causale3,4,5,6,7. Tandis que ces études ont identifié qu’une association existe entre le CH et la plus grande incidence de CVD et de course, nous ne savons pas si ce rapport est causal ou un épiphenomenon partagé avec le processus vieillissant. Pour obtenir une meilleure compréhension de cette association, des modèles animaux appropriés qui récapitulent correctement la condition humaine du CH sont exigés.

Plusieurs modèles animaux ch ont été établis par notre groupe et d’autres utilisant des poissons zèbres, des souris et des primates non humains8,9,10,11,12,13,14. Ces modèles utilisent souvent des méthodes de reconstitution hématopoïétique par transplantation de cellules génétiquement modifiées, parfois en utilisant la recombinaison Cre-lox ou le système CRISPR. Cette approche permet l’analyse d’une mutation génétique spécifique dans les cellules hématopoïétiques afin d’évaluer comment elle contribue au développement de la maladie. En outre, ces modèles utilisent souvent des cellules congéniques ou rapporteures pour distinguer les effets des cellules mutantes des cellules normales ou de type sauvage. Dans de nombreux cas, un régime de préconditionnement est nécessaire pour greffer avec succès les cellules souches hématopoïétiques de donneur.

Actuellement, la transplantation de moelle osseuse à des souris réceptrices peut être divisée en deux catégories principales : 1) conditionnement myéloablatif et 2) transplantation non conditionnée. Le conditionnement myéloablatif peut être réalisé par l’une des deux méthodes, à savoir l’irradiation corporelle totale (TBI) ou la chimiothérapie15. Le TBI est réalisé en soumettant le receveur à une dose létale d’irradiation gamma ou radiographique, générant des ruptures d’ADN ou des réticélisations au sein de cellules se divisant rapidement, les rendant irréparables16. Le busulfan et le cyclophosphamide sont deux agents chimiothérapeutiques couramment utilisés qui perturbent la niche hématopoïétique et causent de la même manière des dommages à l’ADN aux cellules qui se divisent rapidement. Le résultat net du préconditionnement myéloablatif est l’apoptose des cellules hématopoïétiques, qui détruit le système hématopoïétique du receveur. Cette stratégie permet non seulement l’engraftment réussi du distributeur HSPCs, mais peut également empêcher le rejet de greffe en supprimant le recipient' système immunitaire de s. Cependant, le préconditionnement myéloablatif a de graves effets secondaires tels que des dommages aux tissus et aux organes et à leurs cellules immunitaires résidentes ainsi que la destruction de la niche native de la moelle osseuse17. Par conséquent, des méthodes alternatives ont été proposées pour surmonter ces effets secondaires indésirables, en particulier en ce qui concerne les dommages aux organes d’intérêt. Ces méthodes comprennent l’irradiation blindée des souris réceptrices et l’MT adoptive sur des souris non conditionnées9,17. Le fait de protéger le thorax, la cavité abdominale, la tête ou d’autres régions de l’irradiation par l’emplacement d’une barrière de plomb protège les tissus d’intérêt des effets nocifs de l’irradiation et maintient leur population résidente de cellules immunitaires. D’autre part, le BMT adoptif des HSPCs aux souris non conditionnées a un avantage supplémentaire car il préserve la niche hématopoïétique indigène. Dans ce manuscrit, nous décrivons les protocoles et les résultats de l’engraftment de HSPC après plusieurs régimes de transplantation chez les souris, spécifiquement la livraison de HSPC aux souris de TBI, aux souris partiellement protégées de l’irradiation, et aux souris non conditionnées. L’objectif global est d’aider les chercheurs à comprendre les différents effets physiologiques de chaque méthode ainsi que la façon dont ils affectent les résultats expérimentaux dans le contexte du CH et des maladies cardiovasculaires.

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Protocole

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Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Virginie.

1. Avant le préconditionnement

  1. Placer les souris réceptrices sur de l’eau supplémentée aux antibiotiques (5 mM de sulfaméthoxazole, 0,86 mM de triméthoprime) ~ 24 h avant l’irradiation. Ceci est nécessaire pour prévenir l’infection, car le système immunitaire sera supprimé après l’irradiation et maintenu pendant 2 semaines après l’irradiation. À ce stade, compléter les souris avec un gel nutritionnel / hydratation pour encourager l’alimentation et pour prévenir la perte de poids et la déshydratation après irradiation.

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Figure 1 : Images montrant diverses configurations de préconditionnement. (A) Configuration de l’irradiation corporelle totale en cage à tarte à l’aide de rayons gamma (césium 137): Le faisceau de rayonnement provient de l’arrière de l’irradiateur dans la direction de l’axe y (rayonnement horizontal). (B) Configuration de l’irradiation corporelle totale de la cage de souris à l’aide de rayons X: La cage de la souris est placée dans la chambre réfléchissante. Le faisceau de rayonnement provient du haut de l’irradiateur en forme de cône (rayonnement vertical). La distance entre la source de rayonnement et la cage est de 530 mm.(C)Plateau réglable en irradiateur à rayons X: Cette configuration est utilisée pour l’irradiation partiellement blindée à l’aide de rayons X. Le faisceau de rayonnement provient du haut de l’irradiateur en forme de cône (rayonnement vertical). La distance entre la source de rayonnement et le plateau est de 373 mm et le rayon est de 250 mm. (D) Thorax-shielding: Les souris anesthésiées sont placées sur un plateau. Les souris sont placées l’une à l’envers les unes aux autres dans des positions couchées sur le décubitus dorsal avec les bras et les jambes complètement étendus. L’extrémité inférieure du bouclier de plomb est alignée avec l’os du xiphisternum et l’extrémité supérieure avec le thymus. (E) Blindage abdominal : Les souris anesthésiées sont placées comme dans la configuration de blindage du thorax avec l’extrémité inférieure du bouclier de plomb alignée avec l’anus et l’extrémité supérieure sous le diaphragme. (F) Configuration d’irradiation de blindage de la tête utilisant les rayons gamma (césium-137): Les pattes avant de la souris anesthésiée sont collées et la souris est placée dans un dispositif de retenue conique. Le bouclier de plomb noir (marqué) couvre la tête et les oreilles de la souris. Le faisceau de rayonnement provient de l’arrière de l’irradiateur dans la direction de l’axe Y (rayonnement horizontal). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

2. Préconditionnement des souris réceptrices (facultatif)

  1. Irradiation corporelle totale
    1. Placer les souris réceptrices dans une cage à tarte uniformément tranchée ou dans une cage à souris dans la chambre réfléchissante dans le rayon calculé pour recevoir la même dose d’irradiation; cependant, un maximum de 8 souris par cage à tarte et de 5 souris par cage à souris est recommandé pour assurer une irradiation uniforme (Figure 1A, B).
    2. Pour obtenir une myéloablation complète, assurez-vous que les souris réceptrices reçoivent une dose totale de rayonnement de 11 Gy dans deux fractions de 5,5 Gy séparées par un intervalle de 4 à 24 h.
      REMARQUE: Bien que la greffe optimale puisse être obtenue en mettant en œuvre un intervalle de 4 h entre les fractions, cela peut être étendu à un intervalle de 24 h, ce qui peut être utile lorsque le travail et / ou l’irradiateur n’est pas disponible.
  2. Irradiation partiellement blindée
    1. Anesthésier les souris réceptrices par injection intrapéritonéale de kétamine (80–100 mg/kg) et de xylazine (5–10 mg/kg). La limitation des mouvements de la souris est essentielle pour assurer l’irradiation uniforme et la protection efficace des organes de ciblage pendant le processus de blindage.
    2. Pour le blindage du thorax et de l’abdomen, orientez verticalement le faisceau de rayonnement de l’irradiateur à rayons X vers la souris(figure 1C).
      1. Placez les souris anesthésiées sur une plaque plate, en centrant la source de rayonnement d’en haut. Placez les souris inversées les unes par rapport aux autres en décubitus dorsal, les bras et les jambes complètement étendus(figure 1D,E).
        REMARQUE: L’installation d’irradiateur à rayons X, pour cette expérience, permet que deux souris à la fois puissent être positionnées dans le rayon effectif qui permet une irradiation uniforme. Bien que le rayon effectif soit calculé en fonction de la distance entre la source de rayonnement et le plateau, le nombre d’animaux qui peuvent être irradiés simultanément dépendra de l’irradiateur spécifique.
      2. Fixez les pattes des souris sur la plaque à l’aide de ruban adhésif pour vous assurer que les souris sont immobilisées pendant la procédure d’irradiation. Placez le blindage au plomb de manière à ce qu’il couvre les régions qui ont besoin de protection.
      3. Pour le blindage du thorax, préparez le bouclier en plomb en mesurant la longueur de l’os du xiphisternum de la souris au thymus et en calculant l’épaisseur qui fournira une protection suffisante contre la source d’irradiation. Placez le blindage en plomb de sorte que l’extrémité inférieure s’aligne avec l’os du xiphisternum. L’extrémité supérieure de la barrière de plomb s’adaptera près du thymus (Figure 1D).
      4. Pour le blindage de l’abdomen, préparez le bouclier en plomb en mesurant la longueur de l’anus de la souris au diaphragme et en calculant l’épaisseur qui fournira une protection suffisante contre la source d’irradiation. Placez le blindage en plomb de sorte que l’extrémité inférieure s’aligne sur l’anus. L’extrémité supérieure du bouclier de plomb s’adaptera sous le diaphragme(Figure 1E).
        REMARQUE : La localisation du bouclier de plomb pour qu’elle soit cohérente entre les cohortes peut réduire certaines variations en ce qui concerne la taille des souris.
    3. Pour le blindage de la tête, orientez le faisceau de rayonnement de l’irradiateur de césium horizontalement vers la souris.
      1. Collez soigneusement les pattes avant d’une souris anesthésiée sur l’abdomen. Cela garantit que les bras reçoivent une dose complète d’irradiation et ne sont pas couverts par le bouclier.
      2. Pour le blindage de la tête, placez la souris dans un dispositif de retenue conique qui tient à l’intérieur d’un bouclier en plomb. Une fois que la souris est à l’intérieur du dispositif de retenue conique, faites glisser le dispositif de retenue dans la fente à l’intérieur du bouclier de plomb(Figure 1F). Le bouclier en plomb doit couvrir complètement la tête et les oreilles de la souris (~ 3,2 cm), laissant le reste du corps de la souris exposé à l’irradiation. La position du dispositif de retenue à l’intérieur du bouclier peut être ajustée pour s’adapter aux animaux de différentes tailles en le faisant glisser plus loin à l’intérieur ou à l’extérieur du bouclier.
      3. Placez les souris à l’intérieur de l’irradiateur, perpendiculairement à la source pour l’irradiation.
    4. Exposer les souris à deux fractions d’irradiation de 5,5 Gy (dose totale de 11 Gy) séparées par un intervalle de 4 à 24 h.
    5. Après chaque fraction d’irradiation, placez les cages avec des souris anesthésiées sur des tapis chauffants ou sous des lampes chauffantes rouges pour prévenir l’hypothermie et aider à la récupération de l’anesthésie.
      REMARQUE: Attention à ne pas surchauffer la souris anesthésiée lors de l’utilisation d’une lampe car ils ne peuvent pas échapper à la chaleur. Comme décrit ci-dessus, le positionnement des animaux et l’épaisseur du bouclier en plomb peuvent différer d’une étude à l’autre en fonction des caractéristiques spécifiques de l’irradiateur (type de rayonnement/direction du faisceau, etc.). Les chercheurs devront ajuster leurs expériences en conséquence.

3. Isolement osseux

REMARQUE : Idéalement, les souris donneuses et les souris réceptrices devraient avoir un âge similaire et avoir entre 8 et 12 semaines. L’utilisation d’au moins 3 souris comme donneurs (plutôt que d’un seul donneur) est préférable pour minimiser l’hétérogénéité (même lors de l’utilisation de souris avec le même génotype). Environ 40 millions de cellules de moelle osseuse non fractionnées peuvent être obtenues à partir de six os (deux fémurs, deux tibias et deux huméris) d’une seule souris. La transplantation de 5 millions de cellules de moelle osseuse à chaque souris réceptrices assurera généralement la greffe.

  1. Euthanasier les souris donneuses par luxation cervicale sans anesthésie (méthode préférée pour éviter la contamination chimique des cellules) et placer chaque souris sur un tampon absorbant.
  2. Désinfectez la peau à l’aide d’un vaporisateur d’éthanol à 70 %.
  3. Faites une petite coupe transversale dans la peau sous la cage thoracique et maintenez la peau fermement de chaque côté de l’incision, déchirez dans des directions opposées vers la tête et les pieds. Décollez la peau de tous les membres.
  4. Couper sur les épaules et les articulations du coude, et enlever les muscles attachés et les tissus conjonctifs à l’aide d’un Kimwipe pour obtenir l’humeri.
  5. Disloquer soigneusement les articulations de la hanche entre le fémur et les os de la hanche. Utilisez des ciseaux émoussés pour couper le long de la tête du fémur et détacher les jambes. Couper sur l’articulation du genou pour séparer le fémur et le tibia, et enlever soigneusement les muscles attachés et les tissus conjonctifs à l’aide d’un Kimwipe pour récolter le fémur et le tibia.
    REMARQUE: Portez une attention particulière pour garder l’épiphyse osseuse intacte au cours de cette étape. Jetez tous les os cassés en raison de la perte de stérilité. Les os de la hanche et de la colonne vertébrale peuvent être collectés en plus du fémur, du tibia et de l’humérus. Pour recueillir les os de la colonne vertébrale, un mortier et un pilon peuvent être utilisés pour écraser les os en morceaux et récolter les cellules de la moelle osseuse.
  6. Placer les os isolés de souris du même génotype dans un tube conique correspondant de 50 mL contenant 20 mL de PBS stérile glacé, et les garder sur la glace jusqu’à une utilisation ultérieure. Portez une attention particulière pour placer correctement les os dans des tubes avec des génotypes assortis.
  7. Répétez les étapes ci-dessus pour chaque animal donneur qui change de gants entre chaque souris. En outre, nettoyez les ciseaux et autres instruments avec 70% d’éthanol entre chaque souris.

4. Isolement des cellules de moelle osseuse

REMARQUE : Effectuez les étapes suivantes dans une armoire de classe II de biosécurité.

  1. Préparation des ensembles de tubes : Faites un petit trou dans le fond d’un tube de microcentrifugation stérile de 0,5 mL à l’aide d’une aiguille de 18 G et placez-le dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL, qui contient 100 μL de PBS stérile glacé au fond.
    REMARQUE: Comme seulement six os peuvent tenir dans le tube de microcentrifuge de 0,5 mL, il est recommandé de préparer suffisamment d’ensembles de tubes pour traiter tous les os en même temps.
  2. Aspirer le PBS et transférer les os isolés sur une boîte de culture cellulaire stérile de 100 mm. En tenant chaque os à l’aide d’une pince fine, coupez soigneusement les épiphyses de chaque extrémité à l’aide de petits ciseaux qui ont été stérilisés dans un autoclave. Placez les os coupés dans les ensembles de tubes préparés.
  3. Centrifuger les tubes à 10 000 x g pendant 35 s à 4 °C.
  4. Après centrifugation, confirmer que la moelle osseuse a été retirée avec succès des os. Les os doivent apparaître blancs et translucides avec une pastille rouge relativement grande au fond du tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Jetez le tube à microcentrifugation de 0,5 mL.
    NOTA : Si l’inspection visuelle ne permet pas de détecter la moelle osseuse au bas du tube de 1,5 mL, coupez de nouveau l’os et répétez l’étape 4.3.
  5. Ressusciter la moelle osseuse dans 1 mL de PBS glacé, puis transférer la suspension cellulaire du même génotype à un tube conique assorti de 50 mL.
  6. Dissocier les cellules en les faisant passer à travers une aiguille de 18 G avec une seringue de 10 mL 10 fois.
  7. Filtrer les suspensions unicellulaires à travers une passoire cellulaire de 70 μm. Ajouter du PBS glacé supplémentaire à un volume final de 10 mL et ressusciter les cellules grâce à l’utilisation douce de pipette-aide.
  8. Centrifuger à 310 x g pendant 10 min à 4 °C.
  9. Aspirez le surnageant et ressuscitez la pastille de cellules avec 10 ml de médias RPMI sans sérum. Épargner 30 μL de ce matériau pour le comptage cellulaire.
  10. Déterminer la concentration cellulaire avec un compteur cellulaire et calculer le volume de suspension cellulaire requis pour la transplantation. Pour l’exemple d’un 100% BMT, 5 x 106 cellules de moelle osseuse sont nécessaires pour chaque souris réceptrices.
    REMARQUE: Pour un BMT compétitif, préparer un total de 5 x 106 cellules de moelle osseuse comprenant un mélange de cellules donneuses (par exemple, CD45.2+) et de cellules concurrentes (par exemple, CD45.1+). La préparation de cellules de moelle osseuse supplémentaires est fortement recommandée. Par exemple, s’il y a 10 souris réceptrices par groupe expérimental, nous préparons généralement suffisamment de cellules pour 12 souris réceptrices.
  11. Transférer le volume calculé de la suspension cellulaire dans un nouveau tube conique de 50 mL. Centrifuger à 310 x g pendant 10 min à 4 °C.
  12. Aspirer le surnageant et ressusciter les cellules en utilisant la quantité calculée de milieu RPMI sans sérum pour atteindre la densité cellulaire et le volume appropriés. Typiquement, 200 μL est le volume optimal pour une injection rétro-orbitale.

5. Transplantation de cellules de moelle osseuse à des souris irradiées

  1. Anesthésier les souris réceptrices avec 5% d’isoflurane.
  2. Pendant que les souris sont anesthésiées, injectez lentement 200 μL de cellules de moelle osseuse dans la veine rétro-orbitale à l’aide d’une aiguille de 28 à 30 G avec une seringue à insuline.
    1. Alternativement, effectuer l’administration des cellules donneuses par injection intraveineuse de la veine de la queue et injection intramédullaire fémorale, avec un volume maximal de 0,2 mL et 25 μL, respectivement.
  3. Une fois les cellules injectées, placez une goutte de gouttes oculaires contenant de la proparacaïne sur la surface de l’œil pour soulager la douleur. On peut alors laisser l’animal reprendre conscience.

6. Transplantation de cellules de moelle osseuse à des souris non conditionnées

  1. Anesthésier les souris réceptrices par inhalation d’isoflurane à 5%.
  2. Injecter 5 x 106 cellules de moelle osseuse non fractionnées de l’un ou l’autre génotype rétro-orbitalement à des souris réceptrices non irradiées avec une seringue à insuline de 28 à 30 G.
  3. Répétez les étapes 6.1 et 6.2 sur 3 jours consécutifs, de sorte que les souris réceptrices seront transplantées avec un total de 1,5 x 107 cellules de moelle osseuse.
    REMARQUE: Puisque le BMT adoptif sans procédure de préconditionnement exige la transplantation de moelle pendant 3 jours consécutifs, on devrait essayer d’alterner les yeux pour chaque injection.
  4. Après l’injection, administrer une goutte de gouttes oculaires contenant de la proparacaïne à l’œil affecté.

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Résultats

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Pour comparer l’effet de trois méthodes de BMT/pre-conditioning sur l’engraftment de distributeur de cellules, les fractions des cellules de distributeur dans le sang périphérique et le tissu de coeur ont été analysées par cytometry d’écoulement à 1 mois de poteau-BMT. Des cellules d’isolement ont été souillées pour que les marqueurs spécifiques de leucocyte identifient les différents sous-ensembles de leucocytes. Dans ces expériences, le sauvage-type(WT) C57BL/6 (CD45.2) cellules de moelle de distributeur ont é...

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Discussion

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Pour des études d’hématopoïèse clonale, nous avons décrit trois méthodes de BMT : BMT avec l’irradiation de tout-corps, BMT avec l’irradiation avec le blindage partiel, et une méthode moins couramment utilisée de BMT qui n’implique aucun préconditionnement (BMT adoptif). Ces méthodes ont été utilisées pour évaluer l’impact de l’hématopoïèse clonale sur les maladies cardiovasculaires. Les chercheurs peuvent modifier ces méthodes en conséquence en fonction de l’objectif spécifique de leur étude.

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health des États-Unis à K. Walsh (HL131006, HL138014 et HL132564), à S. Sano (HL152174), une subvention de l’American Heart Association à M. A. Evans (20POST35210098) et une subvention de la Japan Heart Foundation à H. Ogawa.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Microcentrifugeuse 0,5 mlFisher Scientific05-408-121approvisionnement général
Microcentrifugeuse 1,5 ml FisherScientific05-408-129approvisionnement général
1/2 cc SERINGUE D’INSULINE LO-DOSEEXELINT26028approvisionnement général
Éthanol absolu (200 prfof)Fisher chemical200559approvisionnement général
BD 1mL Tuberculine Seringues 25G Aiguille 5/8 pouceBecton Dickinson309626approvisionnement général
BD PrecisionGlide Aiguille 18G (1,22 mm x 25 mm)Becton Dickinson395195approvisionnement général
Irradiateur au césium-137J. L. Shepherd  ;Équipement Mark IV
DietGel 76AClear H2O70-01-5022approvisionnement général
Falcon 100 mm Plat de culture cellulaire traité TC Sciencesde la vie353003approvisionnement général
Falcon 50 mL Tubes à centrifuger coniquesFisher Scientific352098approvisionnement général
Fisherbrand filtres à cellules stériles, 70 &mu ; mFisher Scientific22363548approvisionnement général
Graefe ForcepsFine Science Tools11051-10approvisionnement général
Ciseaux fins renforcésOutils de science fine14090-09approvisionnement général
Isothésie (Isoflurane) solutionHenry Schein29404Solution
KétamineZoetis043-304injection
Kimwipes Delicate Task Essuie-glacesKimtech ScienceKCC34155approvisionnement général
PBS pH7.4 (1X)Gibco10010023Solution
RadDisk &ndash ; Irradiateur pour rongeurs DisqueBraintree ScientificIRD-P Mapprovisionnement général
RPMI Medium 1640 (1X)Gibco11875-093Medium
Sulfaméthoxazole et triméthoprimeTEVA0703-9526-01injection
XylazineAkorn139-236injection
Irradiateur à rayons XSource de radRS-2000équipement

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Irradiation corporelle totaleBlindage contre les radiationsGreffe de moelle osseuse adoptiveCytom trie en fluxCellules d ficientes en Tet2Prise des cellules du donneurCellules souches h matopo tiquesMaladie cardiovasculaire

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